酵母蔗糖酶的提取分離純化及其蛋白質(zhì)濃和酶活力測(cè)定

1、會(huì)計(jì)學(xué)1酵母蔗糖酶的提取分離純化及其蛋白質(zhì)酵母蔗糖酶的提取分離純化及其蛋白質(zhì)濃和酶活力測(cè)定濃和酶活力測(cè)定酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖 酶是生物體內(nèi)具有催化活性的物質(zhì)，可據(jù)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)來(lái)選擇分離提純方法和含量測(cè)定。 酶的分離提純是為了提高純度（或比活力）及收率；依據(jù)其性質(zhì)（分子大小、溶解度、電荷、吸附等）進(jìn)行分離; 同時(shí)用測(cè)定酶活力的方法了解酶的去向、衡量酶提純的程度和得率。本實(shí)驗(yàn)由四個(gè)分實(shí)驗(yàn)組成：蔗糖酶的提取與初步純化蔗糖酶各級(jí)分酶活力的測(cè)定蔗糖酶各級(jí)分酶蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定離子交換柱層析純化蔗糖酶分實(shí)驗(yàn)一：蔗糖酶的提取與初步純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)蔗糖酶分離提取的原理 學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞破壁、有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)

2、的原理與操作二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞破碎的方法細(xì)胞破碎的方法高壓勻漿破碎法（homogenization） 振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead) 高速攪拌珠研磨破碎法（fine grinding） 超聲波破碎法（ultrasonication） 機(jī)械法滲透壓沖擊破碎法（osmotic shock） 凍融破碎法（freezing and thawing） 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化學(xué)破碎法（chemical treatment） 去垢劑破碎法（detergents） 非機(jī)械法 乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑可破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度下降；另一方面有機(jī)溶劑能降低溶液的介電

3、常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，降低其溶解度，因此使之發(fā)生沉淀反應(yīng)。如把溶液的pH 值調(diào)節(jié)到該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則沉淀更完善。 在室溫條件下，有機(jī)溶劑沉淀所得蛋白質(zhì)往往已發(fā)生變性。 若在低溫條件下進(jìn)行沉淀，則變性作用進(jìn)行緩慢。利用機(jī)械法（二氧化硅研磨）破碎酵母細(xì)胞壁采用預(yù)冷的去離子水溶解破壁后釋放出來(lái)的蔗糖酶離心去除酵母菌體而得到蔗糖酶溶液加熱去除熱不穩(wěn)定的雜蛋白乙醇沉淀獲得粗提酶。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑 實(shí)驗(yàn)材料：安琪酵母 儀器和試劑: 研缽，離心管，滴管，量筒，恒溫水浴鍋，燒杯， 高速冷凍離心機(jī)， pH值試紙 二氧化硅，去離子水，冰，食鹽，1mol/L乙酸， 95乙醇.四、操作步驟

4、 提?。?）準(zhǔn)備冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中（2）稱取3g干酵母粉和5g 二氧化硅(石英砂)，放入研缽中（3）用量筒量取30mL預(yù)冷的去離子水，先加5ml左右研磨（若不夠每次用滴管再加2mL左右水）， 邊加邊研磨成糊狀（至少用30 min），然后轉(zhuǎn)移到100mL離心管中,最后用剩余的水洗凈研缽中的物質(zhì)并轉(zhuǎn)移到離心管中，以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相中。（4）平衡，4、10000rpm離心10min （5）將上清液倒入量筒，量出體積并記錄，轉(zhuǎn)入清潔燒杯中。（6）用pH試紙檢查上清pH值，用1mol/L 乙酸將pH值調(diào)至5.0。（7）將其置于50的水浴，經(jīng)常緩慢攪拌，30min。 （8）于冰浴中迅速冷卻，

5、倒入100ml的離心管中，4，離心 10分鐘。（9）取上清液，量體積并記錄，得粗酶液1，同時(shí)預(yù)留2.0 ml 測(cè)定用。乙醇沉淀 將粗酶液1轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰鹽浴（碎冰、撒入少量食鹽），逐滴加入等體積-20預(yù)冷的95%乙醇，同時(shí)輕輕攪拌，共需30min；再在冰鹽浴中放置10 min，使沉淀完全。4、 10000 rpm離心10min，棄上清，并滴干，記錄為“醇級(jí)分2”，用5mL去離子水溶解后用于蛋白質(zhì)含量和酶活力的測(cè)定。分實(shí)驗(yàn)二：蔗糖酶各級(jí)分酶活力的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆照崽敲富盍y(cè)定方法二、實(shí)驗(yàn)原理 蔗糖酶能催化非還原性雙糖(蔗糖)的1,2-糖苷鍵裂解，釋放出等量的果糖和葡萄糖。每摩爾蔗糖水解

6、產(chǎn)生兩摩爾還原糖，蔗糖的裂解速率可以通過(guò)斐林試劑法測(cè)定還原糖的產(chǎn)生數(shù)量來(lái)測(cè)定。蔗糖在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。葡萄糖、果糖和堿性銅試劑混合加熱后被其氧化，二價(jià)銅 被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀。氧化亞銅與磷鉬酸作用生成藍(lán)色溶液，其藍(lán)色深度與還原 糖的量成正比，于650nm測(cè)定光吸收值。斐林試劑法測(cè)還原糖含量靈敏度較高，其原理是：三、試劑堿性銅試劑磷鉬酸試劑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mol/L蔗糖溶液0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.9四、儀器試管、試管架、移液管、分光光度計(jì)、比色杯、水浴鍋等五、酶活力測(cè)定的步驟1.粗酶液1 ，醇級(jí)分2 酶活力測(cè)定（1）首先用去離子水稀釋粗酶液1

7、： 2000倍，醇級(jí)分2： 5000、10000倍，（可取0.1mL加入25ml刻度試管，定容25mL，即稀釋250倍）各管名稱對(duì)照粗酶液1 醇級(jí)分2 葡萄糖對(duì)照葡萄糖管數(shù)12356稀釋倍數(shù)2000倍5000倍/ 10000倍酶液/ml0.60.6水/ml0.610.8HAC-NaAC緩沖液0.20.20.22mmol/L葡萄糖/ml0.20.2mol/L蔗糖/ml0.20.20.2加入蔗糖，立即搖勻開(kāi)始計(jì)時(shí)，室溫準(zhǔn)確反應(yīng)10min后，立即加堿性銅試劑終止反應(yīng)。堿性銅試劑/ml11111立即用9095水浴加熱78min，立即用自來(lái)水冷卻。磷鉬酸試劑/ml11111水/ml55555A650nm

8、E=mol/min.ml原始酶液酶活力E單位/ml( (波長(zhǎng)：波長(zhǎng)：650nm)650nm)一個(gè)酶活力單位一個(gè)酶活力單位Units定義為在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，定義為在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘能催化每分鐘能催化1mol蔗糖水解所需的酶量蔗糖水解所需的酶量比活力，每比活力，每mg蔗糖酶所具有的酶活力單位蔗糖酶所具有的酶活力單位稀釋后酶液的活力(按還原糖計(jì)算)： A650nm0.22 A650nm10B（mol / minmL）式中： A650nm 第2,3,4管所測(cè)A650 A650nm第6管所測(cè)A650 0.2 第6管葡萄糖取樣量 2 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度2mmol/L = 2mol/ml 10 反應(yīng)1

9、0min B 每管加入酶液mL數(shù)原始酶液的酶活力 E = (E/2)稀釋倍數(shù)E=分實(shí)驗(yàn)三：蔗糖酶各級(jí)分的蛋白含量測(cè)定 （G-250法）實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理儀器試劑方法波長(zhǎng)為595nm1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（選用0.5cm比色皿） 管號(hào) 試劑 0 1 2 3 4 5 樣品粗酶液1（50X）醇級(jí)分2（50X）柱級(jí)分牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ml）100g/ml 0 0.2 0.4 0.60.8 1.01.0 1.0考馬斯亮藍(lán)（ml） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.52.52.5蒸餾水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0蛋白質(zhì)濃度（g/ml） 0 20 40 60 80100

10、未知未知計(jì)算：1.計(jì)算并比較粗酶液I，醇級(jí)分II，獲得的蔗糖酶的蛋白總量，及酶活力, 并分析原因。 蛋白總量 = 蛋白濃度總體積總酶活 = 酶活校正體積比活力（Unit/mg）總酶活力/總蛋白純化倍數(shù) = 比活力之比回收率 = 總酶活之比2. 各級(jí)分的純化回收計(jì)算：級(jí)分記錄體積/ml校正體積/ml蛋白質(zhì)/mg/ml總蛋白量/mg酶活Unit總酶活力Unit*V比活/Unit/mg純化倍數(shù)回收率1.0100分實(shí)驗(yàn)四：離子交換柱層析純化蔗糖酶一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握離子交換柱層析的原理與操作二 、實(shí)驗(yàn)原理 離子交換是指液相中的離子與固相交換基團(tuán)中的離子可逆反應(yīng)。離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維

11、素：CM-纖維素）和陰離子交換劑（如：二乙氨基乙基纖維素：DEAE-纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。三、試劑陰離子交換劑 DEAE0.02 mol/L pH7.3 Tris-HCl緩沖液0.02 mol/L pH7.3 Tris-HCl緩沖液（含1 mol/L NaCl）0.02 mol/L pH7.3 Tris-HCl緩沖液（含2 mol/L NaCl）四、儀器層析柱部分收集器磁力攪拌器及攪拌子梯度混合器紫外檢測(cè)儀紫外記錄儀真空泵與抽濾瓶精密pH試紙或pH計(jì)五、操作步

12、驟1. 裝柱與平衡 將層析柱垂直裝好，將DEAE 引流裝柱，然后用0.02 mol/L pH 7.3的Tris-HCl緩沖液洗柱，直至流出液的電導(dǎo)率與緩沖液相同或接近時(shí)，穩(wěn)定后即可上樣。注意層析柱中不能有氣泡，否則要重裝首先將前次實(shí)驗(yàn)放在-20的醇級(jí)分2取出，用5 mL 0.02 mol/L pH值為7.3的Tris-HCl緩沖液稀釋，混勻，4，10000rpm離心5min,取1.5ml用于測(cè)定。 將2-3mL醇級(jí)分2用移液管沿著管壁輕輕加到層析柱中，注意不要擾動(dòng)柱床，上樣后，用大約30ml緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì)，當(dāng)A280nm值降低穩(wěn)定后，可用恒流泵及梯度混合器進(jìn)行梯度洗脫 梯度混合器

13、左側(cè)放入50ml 0.02 mol/L pH值為7.3的Tris-HCl緩沖液（含1 mol/L NaCl），右側(cè)放入等量0.02 mol/LpH值為7.3的Tris-HCl緩沖液。 連續(xù)收集洗脫液，注意觀察紫外檢測(cè)儀的讀值，注意標(biāo)記其升高時(shí)對(duì)應(yīng)的收集器中的試管，待蛋白峰過(guò)后A280nm值穩(wěn)定后，記住標(biāo)記此時(shí)對(duì)應(yīng)的收集器中的試管。 最后用0.02 mol/L pH值為7.3的Tris-HCl緩沖液（含2 mol/L NaCl）洗層析柱，洗去所有吸附在柱子上的物質(zhì)。分組：3人一組（4）平衡，4、10000rpm離心10min （5）將上清液倒入量筒，量出體積并記錄，轉(zhuǎn)入清潔燒杯中。（6）用pH試紙檢查上清pH值，用1mol/L 乙酸將pH值調(diào)至5.0。（7）將其置于50的水浴，經(jīng)常緩慢攪拌，30min。 （8）于冰浴中迅速冷卻，倒入100ml的離心管中，4，離心 10分鐘。（9）取上清液，量體積并記錄，得粗酶液1，同時(shí)預(yù)留2.0 ml 測(cè)定用