第六章凝膠層析法

1、凝膠層析法凝膠層析法 一凝膠層析(Gel chromatography)凝膠層析也稱：排阻層析(ellusion chromatography)凝膠過(guò)濾(gel filtration)分子篩層析(moleculer sieve chromatography)凝膠層析中常用凝膠的類型（4種主要類型） 葡聚糖凝膠： Sephadex； 瓊脂糖凝膠 Sepharose； 聚丙烯酰胺凝膠 Bio-Gel p； 瓊脂糖及葡聚糖組成的復(fù)合凝膠 Superdex二凝膠層析法特點(diǎn)： 1設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便2對(duì)高分子物質(zhì)有良好的分離效果，重復(fù)性高3分離條件緩和，不改變樣品的生物學(xué)性質(zhì) 4應(yīng)用廣泛。分離純化、脫鹽、

2、濃縮5分辨率不高，分離操作較慢一凝膠層析的機(jī)理 1固定相：由惰性的凝膠顆粒組成。 2流動(dòng)相：也叫緩沖溶液，洗脫劑。 二凝膠層析的物理特性： 1排阻極限（排阻限）：指不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)部的最小溶質(zhì)分子。2分級(jí)分離范圍：某種凝膠允許溶質(zhì)分子量在多大范圍內(nèi)能得到線性分離。3得水值：每克干膠吸收水的克數(shù)（mL數(shù)）。4床體積：凝膠和凝膠顆粒周?chē)值目傮w積（mL/g干膠）。 型號(hào)分離范圍（分子量）吸水量（ml/g）床體積/干凝膠（ml/mg）G107001.00.123G151 5001.50.22.53.5G255 0002.50.246G50150020 0008.00.3911G753 0

3、0070 0007.50.51215G1004 00015 00010.01.01520G1505 000800 00015.01.52030G2005 00030 000020.02.03040 5凝膠顆粒形狀和大小。.凝膠顆粒都成球形，內(nèi)部有高密度網(wǎng)孔構(gòu)。.顆粒大小有二種表示方法： a.以篩目的大小表示（目）； b.以干顆粒直徑表示（m）。 三凝膠層析分離的過(guò)程 1Vt (total volume) 總體積：凝膠柱床容積。 由三部分組成：Vt=Vo+Vi+Vg2Vo (outer volume) 外水容積（外容積或孔隙容積）:存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相容積。3Vi (inner

4、 volume) 內(nèi)水容積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的容積。4Vg 凝膠本身的容積。 三凝膠層析分離的過(guò)程 三凝膠層析分離的過(guò)程 5Ve (elution volume) 洗脫容積： Ve=Vo+KdVi 。自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度（峰）出現(xiàn)時(shí)所流出的容積。6Kd：樣品組分在兩相間的分配系數(shù)。7Kd: 通過(guò)實(shí)驗(yàn)可求得。 Ve=V0+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi8Kd有下列幾種情況： .當(dāng)Kd=0時(shí) Ve=Vo (全排阻)。.當(dāng)Kd=1時(shí) Ve=Vo+Vi (全滲入).當(dāng) 0 Kd1時(shí) 即VeVo+Vi 表示凝膠對(duì)組分有吸附作用。 凝膠的實(shí)驗(yàn)條件： 1凝膠必須是化學(xué)惰性的。 2凝膠

5、的化學(xué)性質(zhì)必須是穩(wěn)定的。 3凝膠上沒(méi)有或只有極少量的離子交換 基團(tuán)。 4凝膠必須具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度。 一凝膠的選擇： 1凝膠的交聯(lián)度越高，孔徑越小。 2對(duì)大分子物質(zhì)的分離，多采用瓊脂糖。 3對(duì)小分子物質(zhì)的分離，多采用葡聚糖。 4凝膠顆粒的粗細(xì)影響分離效果。 二凝膠的用前處理1除去影響流速的過(guò)細(xì)顆粒 “水力浮洗法”：將顆粒粗細(xì)不均的凝膠懸浮在大體積的水中，讓它自然沉降，過(guò)細(xì)的顆粒浮在上面，倒去即可。反復(fù)幾次。2溶脹 使用前需直接在欲使用的洗脫液中浸泡溶脹。通常使用“熱法”溶脹，即在沸水浴中，將懸浮于洗脫液中的凝膠漿逐漸升溫到近沸，12小時(shí)即可。 三裝柱 1裝柱：先在柱中加入約1/3高度的洗脫液，

6、邊攪拌邊加入凝膠懸浮液。 2平衡 3檢查柱子是否均勻 四樣品的上柱及洗脫 1柱床表面要平整。2使洗脫液流至距柱床表面12mm時(shí)關(guān)閉出口。3以層析允許最小體積的樣品，用滴管慢慢加入（一般為0.5mL）。4水溶性物質(zhì)的洗脫用水或具有不同離子強(qiáng)度和pH的緩沖液。 非水溶性物質(zhì)的洗脫用有機(jī)溶劑（苯，丙酮等）。 五凝膠柱的保養(yǎng)和凝膠的保存 柱的保存： 真空保存或低溫保存（避免凍結(jié)）。凝膠的保存： 1經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為宜。 2長(zhǎng)期不用的凝膠可采用干燥保存法。 影響凝膠層析的主要因素一柱長(zhǎng)的影響1L/D（長(zhǎng)度/直徑）：比值高的柱子分辨率高；2柱長(zhǎng)相同時(shí)：直徑大 分辨率高； 直徑小 分辨率低。3分析時(shí)，采用直徑較小的柱子； 制備時(shí)，采用直徑較大的柱子。4交聯(lián)度小的凝膠柱不宜細(xì)而長(zhǎng)，否則操作上有困難。 二樣品體積的影響1.分析工作時(shí)，樣品體積為柱床體積的14%； 制備分離時(shí)，