流式細胞術在微生物快速檢測領域的研究進展-

1、2010年第3期9月出版摘要概述了流式細胞術的發(fā)展歷史、工作原理及其在微生物快速檢測方面的應用。關鍵詞流式細胞術;微生物;快速檢測Abstract The development history,detecting princi-ple,and its application of Flow Cytometry (FCM in rapid detecting microorganisms were reviewed.keywords flow cytometry ;microorganisms ;rapid detection隨著市場經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活水平的提高,特別是加入WTO 后,消費者

2、對食品安全更加關注,食品安全與食品貿(mào)易的關系更為密切,提高我國食品安全水平的要求越來越迫切。為確保食品安全與食品貿(mào)易,降低細菌、真菌等微生物對食品安全和口味的影響,需要大力加強食品檢驗的力度。于是,ATP 熒光法、紙片法、疏水柵格濾膜法、流式細胞術等快速檢測方法被采納應用到微生物檢測行業(yè),其中流式細胞術是一門綜合了光學、電子學、流體力學、細胞化學、免疫學、激光和計算機等多門學科和技術性的先進方法。流式細胞術(Flow Cytometry ,FCM 是一種在功能水平上對單個細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。他能高速分析上萬個細胞,并能同時測量細胞的物理或化學性質,如粒子的大小、體積

3、、內(nèi)部結構、DNA 、RNA 、蛋白質、抗原等,進行多信息分析。他集電子技術、計算機技術、激光技術、流式理論于一體,被譽為實驗室里的“CT ”。如今,他正成功的運用于免疫學、遺傳學、血液學、腫瘤學、病理學、放射生物學等,并在其中交叉滲透,逐漸形成了獨立的學科分支。1FCM 的發(fā)展歷史1930年,Casperrsson 和Thorell 開始致力于細胞的計數(shù)。1934年,Moldaven 是世界上最早設想使細胞檢測自動化的人,他試圖用光電儀記錄流過1根毛細管的細胞數(shù)量。1936年,Caspersson 等引入顯微光度術。1940年,Coons 提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)的特定蛋白。194

4、7年,Guclcer 運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數(shù)器。1949年,Coulter 提出在懸液中計數(shù)粒子的方法并獲得專利。1950年,Caspersson 用顯微分光光度計在紫外(UV 和可見光光譜區(qū)檢測細胞。1953年,Croslannd2Taylor 應用分層鞘流原理,成功地設計紅細胞光學自動計數(shù)器。1953年,Parker 和Hutcheon 描述一種全血細胞計數(shù)器裝置,成為流式細胞儀的雛形。1954年,Beirne 和Hutchcon 發(fā)明光電粒子計數(shù)器。1959年,B 型Coulter 計數(shù)器問世;1965年,Kamemtsky 等提出兩個設想:用分光光度計定量細胞成分;結合測量

5、值對細胞進行分類。1967年,Kamemtsky 和Melamed 在Moldaven 的方法基礎上提出細胞分選的方法。1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事們在LosALmos ,NM (即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs 發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計。1972年,Herzenberg 研制出一個細胞分選器的改進型,能夠檢測出經(jīng)熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號。1975年,Kochler 和Milstein 提出單克隆抗體技術,為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應用奠定基礎。張峻峰*劉道亮趙占民孫曉霞胡連霞(河北出入境檢驗

6、檢疫局,石家莊050050流式細胞術在微生物快速檢測領域的研究進展ZHANG Jun-feng *LIU Dao-liangZHAO Zhan-minSUN Xiao-xiaHU Lian-xia(Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ,Shijiazhuang 050050,China*張俊峰,男,1981年出生,2004年畢業(yè)于浙江大學生物技術專業(yè),工程師。收稿日期:2010-06-19食品工程FOOD ENGINEERINGResearch development on flow cytometry in the rapid

7、detection of microorganisms192010年第3期9月出版2流式細胞儀的工作原理流式細胞儀主要由流動室及液流驅動系統(tǒng)、激光光源及光束形成系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、信號檢測與存儲、顯示分析系統(tǒng)、細胞分選系統(tǒng)5個部分組成。待測細胞被制成單細胞懸液,經(jīng)不同的熒光染料染色后加入樣品管,在氣壓推動下,進入流動室,流動室內(nèi)的鞘液包繞著樣品。此時,細胞在鞘液的約束下單行排列,依次通過檢測區(qū),被熒光染料染色的細胞受到強烈的激光照射,產(chǎn)生散射光和熒光信號。散射光分為前向角散射(Forward Scatter,FS和側向角散射或90°散射(Side Scatter, SS。前者主要反映被測

8、細胞的大小,后者主要反映其胞質、胞膜、核膜的折射等以及細胞內(nèi)顆粒的性狀。光信號通過波長選擇通透性濾片后,經(jīng)光電倍增管接受轉為電信號,再經(jīng)數(shù)/模轉換器轉換為可被計算機識別的數(shù)學信號,以一維直方圖或二維位圖及數(shù)據(jù)表或三維圖形顯示出。流式細胞儀具有高分辨能力,主要表現(xiàn)在五個方面:測定細胞內(nèi)的DNA的變異系數(shù)最小,一般為1%2%;正確分辨二倍體、四倍體、近二倍體和非整倍體,可用于細胞周期分析;利用特配的激光熒光染料進行蛋白質、核酸染色及熒光分析,可以敏感的鑒別細胞上熒光量的差異;能夠選擇地對某個細胞群進行分析;盡管對單細胞懸液植被要求嚴格、操作復雜,但檢測客觀,總分析數(shù)多,統(tǒng)計結論可靠。3FCM在微生

9、物快速檢測中的應用流式細胞術最初主要應用于科學研究和臨床檢驗,在微生物學方面的應用則發(fā)展相對較晚。近20年來,國內(nèi)外專家學者使用FCM在微生物學上做了不少的研究和應用工作,已經(jīng)成為高水平病原微生物研究中不可缺少的技術,可用于微生物基因組及功能基因組學、生理生化學、臨床微生物學、抗感染免疫學、藥物學等領域。實際上,微生物學,尤其是細菌學當前面臨的一些問題,特別是需要對大數(shù)量細菌進行逐個的快速多參數(shù)精確測量時,流式細胞術很適合解決此類問題。已發(fā)表的論文多數(shù)是針對酵母菌和各類細菌的測量與分析。酵母菌的測量在技術上比較簡單,他自身體積大,其DNA 含量約為人類二倍體細胞DNA含量的1/200。在工業(yè)中

10、,流式細胞術可用于快速微生物鑒定,如對飲用水及原油中的微生物學鑒定與控制。因此,流式細胞術在液態(tài)商品的微生物檢測方面的應用越來越受到人們的關注。近年來,FCM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細菌的活力和功能狀態(tài),由于檢測速度快,周期短,已經(jīng)被應用于食品加工業(yè)、化妝品加工業(yè)、制藥業(yè)和水質監(jiān)測等行業(yè)。3.1在食品加工業(yè)中的應用3.1.1在食品發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的應用1990年Day首次將FCM應用于酒類釀造之后,該技術在國外被廣泛運用于面包發(fā)酵、釀酒等行業(yè)。1999年Srienc對同步化酵母細胞發(fā)酵液中CO2的產(chǎn)量與細胞周期進行了分析,發(fā)現(xiàn)同步化酵母細胞數(shù)量最大時,CO2的產(chǎn)量最高,即細胞活性最高。在國內(nèi),

11、肖安風等利用流式細胞儀檢測PI染色的畢赤酵母細胞活性。目前國內(nèi)啤酒制造行業(yè),FCM 方法主要應用于對啤酒中活細菌數(shù)量檢測監(jiān)測并且控制生產(chǎn)流程中啤酒酵母的數(shù)量。啤酒酵母的活性和數(shù)量對優(yōu)化發(fā)酵和產(chǎn)品質量非常重要,同時死亡的酵母細胞由于細胞膜不完整而導致細胞質的流出,會對啤酒口感產(chǎn)生嚴重影響,因此快速檢測啤酒中的酵母等微生物項目,便于隨時了解啤酒生產(chǎn)流程中酵母數(shù)量的變化,并可以及時調(diào)整發(fā)酵罐中各成分的配比,對于啤酒生產(chǎn)有著重大意義。3.1.2在乳制品加工中的應用目前,在乳制品加工過程中,流式細胞術主要應用于生乳中微生物指標的檢測和UHT奶的無菌監(jiān)測。生乳(raw milk是從健康奶畜擠下的常乳,僅經(jīng)

12、過冷卻,可能經(jīng)過過濾,但未經(jīng)過任何殺菌處理。生乳中微生物數(shù)量會影響產(chǎn)品的質量、貨架期及生產(chǎn)流程的安全性。用FCM法代替應用最廣泛的平皿計數(shù)法,極大的縮短了檢測時間,而且流式細胞術可以區(qū)分具有生命活力的細菌和已經(jīng)死亡的細菌,并可以同時進行多個樣品的處理,能夠滿足大量樣品在線檢測的要求。3.1.3在飲料類食品加工行業(yè)中的應用UHT奶、巴氏奶、軟飲料、礦物質水、果汁及水果濃縮汁等液體飲料富含營養(yǎng)成分,一旦被微生物污染,極易腐敗變質,因此在最終產(chǎn)品放行之前,對其在生產(chǎn)過程中進行快速實時無菌監(jiān)測,使生產(chǎn)過程中微生物的污染得到及時有效控制。另食品工程202010年第3期9月出版張峻峰,等:流式細胞術在微生

13、物快速檢測領域的研究進展外,在酸奶的生產(chǎn)工程中,FCM方法還被應用于檢測其中添加的有益的乳酸菌的數(shù)量。3.2制藥業(yè)FCM方法可以通過熒光染料標記來檢測病原菌、毒素和血清抗體,因此可用于抗生素敏感性試驗,并對抗生素后效應、細菌耐藥的異質性等進行分析。一方面,在藥物制造過程中,注射用水和純凈水的檢測,需要對可見的營養(yǎng)細胞、微生物芽胞、酵母菌和霉菌進行間個細胞檢測,FCM方法在2h 內(nèi)提供結果,不需要細胞的增長,且敏感性高,而且有非常廣泛的應用功能。由于能夠快速、準確的提供實時的趨勢分析,這使管理者對非正常結果能及時做出快速反應。另一方面,人們通常在食品中添加一些消毒防腐劑,以便更安全、更長久地保存

14、食品。季胺類藥物由于具有一定的表面活性、無腐蝕且毒性低等優(yōu)點而被廣泛地用于食品保鮮和臨床環(huán)境的防腐消毒。但隨著他的使用,許多國家已發(fā)現(xiàn)金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌對季胺類藥物產(chǎn)生耐藥性。因此,為了防止耐藥菌的流行,有必要對耐藥菌進行調(diào)查和監(jiān)測。3.3水質檢測20世紀80年代流式細胞術被引入水生生態(tài)系統(tǒng)研究以來,該技術正以其樣品制備簡單、可進行快速多參數(shù)數(shù)據(jù)采集、精確測定、不易受溶解有機物的干擾、可進行多元數(shù)據(jù)分析及具分選功能等優(yōu)越性引起愈來愈多研究者的關注,從而成為水生和環(huán)境微生物學研究中的一項重要工具。之后的20多年里,流式細胞術在國外蓬勃發(fā)展,在環(huán)保領域,Yamaguchi等應用FCM測定了

15、細菌在污染和未污染河水中呼吸及酶活性,結果發(fā)現(xiàn),細菌的酯酶活性比率與河水污染程度直接相關,這一比率可作為評價水環(huán)境污染程度的指標。Coskuner等鑒定了活性污泥中硝化細菌群落的組成和分布,為研究污水處理中氮素循環(huán)提供了重要信息。在水生生物學研究領域,Fushs等采用流式細胞儀與熒光原位雜交技術及變性梯度凝膠電泳結合的方法來研究浮游細菌的分類鑒定;在海洋環(huán)境中,海洋細菌,即異養(yǎng)細菌在物質循環(huán)和能量循環(huán)中扮演著重要角色,他能分解海水中的有機質并將營養(yǎng)物質提供給上一級浮游植物,從而完成物質循環(huán),是海洋生物鏈中不可或缺的重要組成部分,Olson R J、Grégori G等利用FCM技術對

16、海洋細菌在海洋生態(tài)中的作用以及在極端環(huán)境中特殊功能展開了大量的研究。近幾年,國內(nèi)也加強了在這些方面的研究,主要集中于水體中的浮游植物,包括對淡水湖富營養(yǎng)化、赤潮等的研究,潘洛安等也曾用SYBR Green I染料對自然水樣進行染色,再結合FCM來計數(shù)其中的異養(yǎng)細菌。3.4化妝品檢驗化妝品衛(wèi)生質量長期以來一直被人們所重視,尤其是微生物學檢驗指標與方法不斷被研究。最近幾年化妝品行業(yè)檢驗水平逐漸提高,流式細胞儀也被引入到化妝品中微生物的檢驗。對于香水類的化妝品,香水中的酒精濃度本可有效抑制霉菌和酵母菌的生長。但在酒精含量降低、污染量大、菌株耐酒精作用強時,香水類化妝品可有霉菌和酵母菌生長。所以,在日

17、常監(jiān)測中, FCM方法被用來監(jiān)控其中的活菌的生長情況。對于含抗菌劑化妝品,防腐效力檢驗是化妝品被審批時必須做的檢測。一方面,FCM方法用于檢測其中的微生物含量,以檢驗化妝品防腐劑抑菌效果;另一方面化妝品中各種不同的化學成分對防腐劑的抑菌效果會產(chǎn)生不可知的影響,所以FCM方法也適合于測定化學成分對防腐劑的影響效果。4FCM的發(fā)展前景和問題近年來,隨著各項科學技術的迅猛發(fā)展,多學科之間的相互結合成為大的趨勢,與生物醫(yī)學、分子生物學和細胞生物學等相關學科的結合已成為流式細胞技術發(fā)展的必然方向,例如,將生物芯片技術和FCM有機結合在一起,把不同生物探針(核酸、蛋白等標記在各種有熒光的微球上,以熒光標記

18、微球作為反應載體在液相系統(tǒng)中完成生物學反應,即為流式細胞術液相芯片技術,他可以在同一液相中同時檢測多個目的分子,完成多組分的快速檢測。同時,流式細胞儀的功能不斷完善、各種功能強大的分析軟件的開發(fā)、多參數(shù)分析技術的發(fā)展等,為流式細胞術檢測結果準確性的提高和分析能力的擴展提供了保障,并使儀器不斷向小型化,操作自動化,簡單化方向發(fā)展?？梢灶A見,在未來微生物快速檢測領域,流式細胞術的應用范圍會進一步擴大,應用深度會進一步加強。當然,流式細胞技術完全應用于微生物快速檢212010年第3期9月出版測還有很多問題亟待解決,首先是在國內(nèi)尚無標準可循;其次,流式細胞儀的前期成本投入較大,運行操作的費用較高;再次

19、,流失細胞技術可應用的樣品種類太少,暫時只能應用于液態(tài)商品,而且,不同液態(tài)商品中不同的基質對熒光染料的標記和熒光信號的收集都可能產(chǎn)生未知的影響,如何提高特異性,還需要我們研究解決。參考文獻1楊懷德,張才軍,李秀義,等.流式細胞術在微生物學中的應用J.醫(yī)學綜述,2006,12(13:825-827.2左連富.流式細胞術與生物醫(yī)學M.沈陽:遼寧人民出版社,1996:129-422.3沈關心,周汝麟.現(xiàn)代免疫學實驗技術M武漢:湖北科學技術出版社,2002:226-230.4魏熙胤,牛瑞芳.流式細胞儀的發(fā)展歷史及其原理和應用進展J.現(xiàn)代儀器,2006(4:8-11.5M AECKER HT.Cytok

20、ine flow cytometry methodsJ.M olBiol,2004,263:95-108.6張藝.流式細胞儀構成與工作原理J醫(yī)療設備信息,2005,20(8:25-26.7王菊香,裴士庚,陳文弦.流式細胞儀及其在科研及醫(yī)療上的應用J.邯鄲醫(yī)專學報,1996,9(3:241-243.8曾令武.流式細胞術J.微生物與感染,2008,3(2:125-126.9SHERRIF F.IBRAHIM L,GER VAN DEN ENGH.Flowcto-metry and Cell SortingJ.Adv Biochem Engin/Biotechnol.2007,106:19-39.1

21、0JOHN P.NOLAN,LORETTAYANG.The flow of cytometryinto systems biology Briefings in functional genomics andproteomicsJ.2007,6(2:81-90.11閆虹,流式細胞術的臨床應用J.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2007,22(5:93-95.12DAY A,M EYLING J C.Practical experience with rapidmethods ofdetectingyeasts in breweriesJ.J Inst Brew,1990,89:204-206.13SRIEN

22、C F.Cytometric data as the basis for rigorous models ofcell population dynamicsJ.J Biotechnol,1999,71:233-238.14肖安風,周祥山,周利,等.應用流式細胞術檢測畢赤酵母的細胞活性J.微生物學通報,2006,33(6:22-26.15張波,陳君,盧啟威,等.應用流式細胞術對啤酒酵母在含油酸培養(yǎng)基中生長的定量研究J.現(xiàn)代儀器,2008(2:16-20.16王寧,劉寧.流式細胞術快速檢測生乳中細菌總數(shù)J.食品工業(yè)科技,2007,28(9:197-200.17LAPLACE-BUILHE,C H

23、AHNE,K HUNGER,et al.Application of flow cytometry to rapid microbial analysis infood and drinks industriesJ.Biol Cell,1993,78:123-128. 18李慶,馬筱玲,李柏青,.流式細胞術在臨床細菌學檢測中的應用J.國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊,2002,23(6:344-345.19D.L.JONES,M.A.BRAILSFORD,J-L.DROCOURT SOLID-PHASEK.aser-scanningcytometry:a newtwo-Hour methodf

24、or the enumeration ofmicroorganisms in pharmaceutical waterJ.Pharmacopeial Forum,1999,25(1:7626-7645.20華德興,錢元恕.細菌的消毒防腐劑耐藥基因研究進展J.中國抗生素雜志,2008,33(9:513-519.21ROBERTSONBR,BUTTONDK,KOCH AL.Determinationof the biomasses of small bacteria at low concentrations in amixture of species with forward light sc

25、atter measurements byflow cytometryJ.Appl Environ M icrobiol,1998,64(10:3900-3909.22YAM AGUCHI N,NASU M.Flowcytometric analysis of bac-terial respiratory and enzymatic activity in the natural aquaticenvironmentmJ.Appl M icrobiol,1997,83(1:43-52. 23COSKUNER G,CURTIS T P.In situ characterization ofnitrifiersinan activated sludge plant:detection of nitrobactersppJ.Journal