生物物質(zhì)分離工程復(fù)習(xí)

1、生物物質(zhì)分離工程復(fù)習(xí)第一章緒論第一節(jié) 生物工業(yè)下游技術(shù)的工作領(lǐng)域一、下游工程對于由生物界自然產(chǎn)生的或由微生物菌體發(fā)酵的、動植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的、酶反應(yīng)等各種生物工業(yè)生產(chǎn)過程獲得的生物原料，經(jīng)提取分離、加工并精制目的成分，最終使其成為產(chǎn)品的技術(shù)，通常稱為下游技術(shù)（Downstream Processing），也稱為下游工程或下游加工過程。二、技術(shù)范疇物質(zhì)分離 產(chǎn)品加工三、生物工業(yè)下游技術(shù)的發(fā)展歷程1.古代釀造業(yè)2.第一代生物技術(shù):第一代(傳統(tǒng))生物工業(yè)主要指19世紀(jì)60年代到20世紀(jì)40年代青霉素等抗生素出現(xiàn)之前的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。這一時期，發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵的本質(zhì)是微生物的作用，掌握了純種培養(yǎng)技術(shù)。3.第二

2、代生物技術(shù):第二代生物技術(shù)以20世紀(jì)40年代出現(xiàn)的青霉素產(chǎn)品為代表。4.第三代生物技術(shù):第三代生物技術(shù)一般認(rèn)為以20世紀(jì)70年代末崛起的DNA重組技術(shù)及細(xì)胞融合技術(shù)為代表。到了20世紀(jì)80年代以來，生物工業(yè)下游技術(shù)進步很快，出現(xiàn)了許多新概念、新技術(shù)、新產(chǎn)品和新裝備。第二節(jié) 生物工業(yè)下游技術(shù)的一般工藝過程一、原料及產(chǎn)品特性二、下游技術(shù)的一般工藝過程如按生產(chǎn)過程劃分，生物工業(yè)下游技術(shù)大致可分為4個階段，即預(yù)處理、提?。ǔ醪椒蛛x）、精制（高度純化）、成品制作，如書中P8圖1-1所示。第三節(jié) 生物工業(yè)下游技術(shù)的發(fā)展動態(tài)一、傳統(tǒng)分離技術(shù)的提高和完善 二、新技術(shù)的研究和開發(fā)1.新型分離介質(zhì)的研究開發(fā)2.子

3、代分離技術(shù)3.其他新興下游技術(shù)三、清潔生產(chǎn)（Cleaner Production）清潔生產(chǎn)是指將綜合預(yù)防的環(huán)境保護策略持續(xù)應(yīng)用于生產(chǎn)過程和產(chǎn)品中，以期減少對人類和環(huán)境的風(fēng)險。它包括三方面內(nèi)容，即清潔生產(chǎn)工藝（技術(shù)）、清潔產(chǎn)品、清潔能源。清潔生產(chǎn)工藝是生產(chǎn)全過程控制工藝，包括節(jié)約原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，并在全部排放物和廢物離開生產(chǎn)過程以前，盡最大可能減少它們的排放量和毒性，對必須排放的污染物實行綜合利用，使廢物資源化。*第五節(jié) 常用的幾種精制方法簡介生物產(chǎn)物的精制過程，往往包括濃縮、精制和干燥。常用的濃縮方法有真空單效蒸發(fā)濃縮和真空薄膜蒸發(fā)濃縮，尤以薄膜濃縮用得較多，形式也多種多樣。精

4、制方法更是五花八門，但歸納起來有下列幾種：（a）脫色精制除去色素及熱原；（b）結(jié)晶及重結(jié)晶，其中包括共沸結(jié)晶及鹽析結(jié)晶；（c）中間體轉(zhuǎn)化法；（d） 柱層析法及分子篩法；（e）其他。一、分子篩去鹽利用分子量大小，可將無機鹽雜質(zhì)從目標(biāo)產(chǎn)物溶液中除去，從而降低灰分，提高純度。通常采用高交聯(lián)度的強酸性陽離子H型樹脂處理，當(dāng)溶液通過它時，其中無機陽離子被吸附，釋放出來的氫離子，再通過陰離子樹脂，中和氫離子，這樣經(jīng)過兩種樹脂串聯(lián)處理，可以達到去鹽目的。二、色譜分離法色譜分離法是一總稱，它從分離的原理上可以分為：1.吸附色層分離法:靠吸附力不同而分離。2.分配色層分離法（紙層析）：靠各物質(zhì)在兩液相間分配系數(shù)

5、不同而分離。3.離子交換色層分離法：靠離子親和力不同而分離。4.凝膠層離法：靠物質(zhì)的分子大小或形狀不同而分離。5.電泳法（電層離法）：靠電泳速度不同而分離。但從固定相的形狀不同，色層分離法可以分為柱層、紙層和薄板（層）等。它的機理是多種多樣的，但不管怎樣，必須包括兩個相，一相是固定的，叫固定相，通常為表面積很大或多孔性固體，另一相是流動的，是液體或氣體，當(dāng)流動相流過固定相時，由于物質(zhì)在兩相間的分配情況不同，經(jīng)過多次差別分配而達到分離。這里著重介紹具有工業(yè)生產(chǎn)價值的幾種方法：（一）吸附色層分離法是靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力的差異而達到了分離精制目的。常用的吸附劑：Al2O3、硅膠、活性炭（顆

6、粒狀），其他還有CaCO3、淀粉、纖維素等。下面重點介紹三種吸附劑：Al2O3有：堿性（適應(yīng)于對堿性穩(wěn)定的生物產(chǎn)物的吸附）；中性；酸性（適應(yīng)對酸性穩(wěn)定的生物產(chǎn)物的提取）之分。 Al2O3可以重復(fù)使用，洗滌后200-400度加熱6小時進行活化，其活性與含水量關(guān)系很大，活性可分6級。可根據(jù)不同水分，不同溫度，不同烘烤時間，可得不同活性。硅膠:它具有多孔性的硅氧烷交鏈結(jié)構(gòu)。活性炭:是憎水性吸附劑，適宜于從水溶液中吸附非極性物質(zhì)。一般說來，它對極性小的化合物吸附能力大于極性大的化合物，對芳香族的吸附能力大于脂肪族的化合物，對分子量大的化合物吸附能力大于分子量小的化合物。（二）凝膠過濾法球型交鏈右旋糖酐

7、凝膠，又名葡聚糖凝膠（簡稱凝膠），是一種分子篩，它由右旋糖酐和交聯(lián)劑相互交聯(lián)，形成具有二圍空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。按網(wǎng)孔的疏密將凝膠分為： G-15 G-25 G-50 G-75 G-100網(wǎng)孔： 密 疏優(yōu)點：操作方便，不會使物質(zhì)變性，可反復(fù)使用。原理：凝膠過濾法是把含有不同大小分子的混合物溶液倒在凝膠面上，如下圖，讓它在凝膠柱中流濾，由于凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，當(dāng)混和物通過網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)凝膠柱子縫隙中，溶液中的溶質(zhì)凡是比網(wǎng)絡(luò)小的的分子都能自由進入膠粒內(nèi)，惟有大分子由于不能進入網(wǎng)絡(luò)，被阻于膠粒粒外，沿膠粒間的空隙往下移，從而很快流出柱外，這樣就把大小分子篩離開了。當(dāng)加入洗脫液后，溶液繼續(xù)往下移動，大小分子繼續(xù)向相

8、反方向擴散、滲入下移，這樣先流出的洗脫液中，含有大分子物質(zhì)，后流出的洗脫液中含有小分子物質(zhì)，從而達到精制的目的。三、洗滌工藝原理：利用某種溶劑或洗滌劑對雜質(zhì)的溶解度較大，通過洗滌可提高其純度。第六節(jié) 選擇生物分離的方法和原則選擇確定生物分離方法，首先必須掌握以下幾個基本因素。一、生物產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與分類以抗生素為例。據(jù)抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)，抗生素大體上可以分成八大類：內(nèi)酰胺類、氨基酸多肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、多烯類、四環(huán)類、氨基糖苷類、蒽環(huán)類、甾體類等。各類抗生素從目前工業(yè)化生產(chǎn)角度來歸納，大體上每一類抗生素采用相似方法。例大環(huán)內(nèi)酯類一般采用溶媒萃取法，氨基糖苷類大都采用離子交換法，多烯類采用收集菌體，再

9、用溶媒法萃取等等。因此，當(dāng)某一新抗生素確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)后，按其分類大致上按已知抗生素提取方法來提取，是有可能的。二、生物產(chǎn)物的極性及其大小三、溶解度應(yīng)掌握生物產(chǎn)物在各種溶劑中的溶解度，是水溶性還是酯溶性以及各種溶劑的分配系數(shù)。四、化學(xué)穩(wěn)定性五、化學(xué)反應(yīng)性第七節(jié) 生物產(chǎn)物酸堿性及極性大小的測定如抗生素酸堿性、溶解度及極性大小測定用下列三種方法大體可以確定。一、紙上層析法（簡稱紙層析） 紙層析的原理，是以濾紙作為支柱，用一定的溶劑系統(tǒng)展開而達到分離分析的目的。每一種生物產(chǎn)物在一定溶劑中，均有它自己的比移值（即為Rf值），Rf值測量示意如下圖:根據(jù)某些生物產(chǎn)物在同一系統(tǒng)中Rf值的不同，可以判斷它們是不

10、同的生物產(chǎn)物。抗生素極性和溶解度的測定，通常是利用八種溶媒系統(tǒng)法的紙層析數(shù)據(jù)來進行的。層析結(jié)果的判斷： Rf值為零或很小，說明抗生素不能溶于或很少溶于所用的溶劑系統(tǒng)； Rf值較大，說明抗生素能夠很好地溶于所用的溶劑系統(tǒng)。一般極性強的抗生素易溶于極性高的溶劑中，極性弱的抗生素易溶于極性低的溶劑中。二、PH層析色譜法PH層析是紙層析法的一種，可用來研究某些酸類、堿類或兩性生物產(chǎn)物在不同PH下，在有機溶劑中的溶解情況，從而可決定萃取的最適PH。 PH層析的方法如下：用九條層析紙條，分別用PH2，3，4，5，6，7，8，9，10的各種緩沖液處理，點上樣品后，選用適當(dāng)?shù)乃柡偷挠袡C溶劑展開，層析完畢后用

11、生物顯影，即得到PH層離譜。幾種抗生素的“PH-層析”圖譜如圖1-5。從圖中可以看出：（一）酸性生物產(chǎn)物：在“PH-層析”的圖譜中的Rf值呈S形逆方向，其最大值在酸性區(qū)域，隨PH增加其Rf值降低。（二）堿性生物產(chǎn)物：在 “PH-層析”的圖譜中的Rf值呈S形曲線，曲線的最大值在堿性區(qū)域，而其最小值在酸性區(qū)域。（三）兩性生物產(chǎn)物：在 “PH-層析”的圖譜中的Rf 值從較低的值區(qū)域中逐漸增加，到達某一最高值時開始下降，這一類化合物的Rf值從最低點到最高點表現(xiàn)為堿性，從最高點到PH10則表現(xiàn)為酸性。（四）中性生物產(chǎn)物：在 “PH-層析”圖譜中，在整個PH范圍內(nèi)，Rf值接近相同，實際上呈直線形。從“PH

12、層析圖譜”的結(jié)果，可知：1.可判知生物產(chǎn)物的性質(zhì);2.確定用溶媒萃取法提取生物產(chǎn)物的最適PH值。具體地說，用溶劑抽提時的最適PH值， 即為“PH層析”譜中Rf值最大的PH值；相反，在“PH層析”譜中Rf值最小的PH值即為反萃取的最適PH值。三、紙電泳法經(jīng)過系統(tǒng)紙層析法判斷為水溶性的生物產(chǎn)物，可用紙電泳法進一步判斷其電離性質(zhì)。原理為：不同的生物產(chǎn)物由于帶電性質(zhì)，電荷數(shù)量以及分子量的大小不同，因此在一定時間內(nèi)在電場作用下，移動的方向和距離是不同的。對于帶有正電荷的抗生素電泳時移向負(fù)極，稱為堿性抗生素；帶有負(fù)電荷的抗生素電泳時移向正極，稱為酸性抗生素；不具有極性基團的抗生素電泳時不移動，稱為中性抗生

13、素；兩性抗生素在電場作用下移動的方向與溶液的PH值密切相關(guān)。由此，利用紙電泳法可判斷生物產(chǎn)物是：強酸性、弱酸性、強堿性、弱減性或兩性、中性的，以及有可能采用何種離子交換樹脂來提取。具體做法是：試樣在電壓、電流相同的情況下，分別用酸性和堿性緩沖液進行電泳。兩次電泳結(jié)果及判斷見表1-2。 第八節(jié) 提煉工作中應(yīng)注意的幾個問題一、遵循四條原則。（一）操作時間盡量縮短，在設(shè)備平衡上，爭取當(dāng)班能處理一批發(fā)酵液，特別是發(fā)酵液過濾。（二）提煉溫度一般要低，避免破壞，避免異構(gòu)體轉(zhuǎn)化，避免長菌。（三）要選擇對生物產(chǎn)物穩(wěn)定的PH值。（四）設(shè)備管道要勤清洗消毒，特別是過濾崗位，避免染菌污染。二、注意發(fā)酵液質(zhì)量對提煉的

14、影響。三、加強質(zhì)量意識，正確處理產(chǎn)質(zhì)量關(guān)系。四、應(yīng)重視設(shè)備選型，提高生產(chǎn)效益。五、三廢治理及綜合利用思考題*1.生物產(chǎn)物提煉工作中應(yīng)注意的幾個問題? 2.影響生物產(chǎn)物穩(wěn)定性的主要因素有哪些?*3.測定生物產(chǎn)物酸堿性或極性大小可采用哪幾種方法?*4.生物工業(yè)下游技術(shù)的發(fā)展歷程。第二章 下游技術(shù)的理論基礎(chǔ)第一節(jié) 下游技術(shù)中的物理學(xué)過程 一、基礎(chǔ)物性二、分類以物理學(xué)過程為基礎(chǔ)的分離操作，大致可分為以下三類。1.平衡分離過程這種操作是建立在相平衡關(guān)系上的。是利用相的組成差別進行混合物體系的分離的。表2-1為平衡分離代表性單元操作。大部分平衡分離操作都包含在內(nèi)。 明白單元操作屬于哪一類。根據(jù)紙層析和紙電

15、泳的結(jié)果，就可以大致決定采用何種方法提取。2.擬平衡(速度差)分離操作在混合物體系本身所占有的空間之外加一個能引起物質(zhì)分離的勢能場，在它的作用下，形成分離場。其結(jié)果為，欲分離的物質(zhì)在分離場的端面濃縮，或者在分離場內(nèi)形成一個穩(wěn)定的濃度分布。如表2-2所示。3.非平衡分離操作平衡和擬平衡分離操作以外的操作，有代表性的是利用物質(zhì)移動速度差和廣義的、基于“隱蔽效應(yīng)”的分離操作。如表2-3所示。第二節(jié) 下游技術(shù)中的化學(xué)過程一、化學(xué)性分子識別1.分子間相互作用（疏水性相互作用） 2.分子識別二、下游技術(shù)中的化學(xué)反應(yīng)第三節(jié) 下游技術(shù)中的生物學(xué)過程一、特異性相互作用（鎖鑰關(guān)系）生物學(xué)分離過程的主要特征是生物高

16、分子的特異性相互作用。有時也被稱作生物親和力。這種作用，除共價結(jié)合外，還有其他一些作用。1.離子間的相互作用 2.氫鍵結(jié)合 3.疏水性相互作用4.對金屬原子配位5.弱共價鍵結(jié)合影響上述作用的因素：（1）熱（2）溫度（3）PH值（4）靜電性的環(huán)境變化（5）試劑第三章 發(fā)酵液的過濾和預(yù)處理第一節(jié) 發(fā)酵液過濾特性的改變一、微生物發(fā)酵液的主要特性：1.發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1%-10%；2.懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；3.固體粒子可壓縮性大；4.液相粘度大，大多為非牛頓型流體；5.性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。*二、發(fā)酵液預(yù)處理的要求對發(fā)酵液的

17、預(yù)處理一般有下列的要求：（1）菌體的分離（2）固體懸浮物的去除（3）蛋白質(zhì)的去除（4）重金屬離子的去除（5）色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機雜質(zhì)的去除（6）改變發(fā)酵液的性質(zhì)（7）調(diào)節(jié)適宜PH值和溫度三、確定預(yù)處理方法的基本條件1.穩(wěn)定性2.生物產(chǎn)物的溶解度3.工藝上要求四、發(fā)酵液預(yù)處理方法按原理不同分為1.降低液體粘度：常用的方法：（1）稀釋法：此法適用于，若加水一倍，液體的粘度下降50%以上的體系。（2）加熱法：升溫一是可以降低粘度，另外還可以凝固蛋白。2.調(diào)整PHPH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)PH值可改善其過濾特性。此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理較常用的方法之一。3.

18、凝聚與絮凝采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率。除此之外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。因此，凝聚和絮凝是目前工業(yè)上最常用的預(yù)處理方法之一。（1）凝聚是指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。凝聚作用：就是向膠體懸浮液中加入某種電解質(zhì)，在電解質(zhì)中異電離子作用下，膠粒的雙電層電位降低，使膠體體系不穩(wěn)定，膠體粒子間因相互碰撞而產(chǎn)生凝集的現(xiàn)象。電解質(zhì)的凝聚能力用凝聚值來表示。凝聚值：使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mmol/L）。反離子的價數(shù)越高，該值就越小，即

19、凝聚能力越強。采用凝聚方法得到的凝聚體，其顆粒常常是比較細(xì)小的，有時還不能有效地進行分離。*（2）絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。絮凝劑是一種能溶于水高分子聚合物，其相對分子量可高達數(shù)萬至一千萬以上，它們具有長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子（如-COOH）或陽離子（如-NH2）基團以及不帶電荷的非離子型基團。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。絮凝作用：當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)接時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。對絮凝劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)一般有下列兩方面的

20、要求：.分子必須含有相當(dāng)多的活性官能團，使之能和膠粒表面相結(jié)合；.必須具有長鏈的線形結(jié)構(gòu)，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團，但相對分子量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。根據(jù)其活性基團在水中解離情況的不同，絮凝劑可分為：非離子型、陰離子型和陽離子型三類。根據(jù)其來源的不同，工業(yè)上使用的絮凝劑又可分為：.有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物。.無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等。.天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等（3）混凝對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸

21、附橋架的雙重機理，所以可以單獨使用。對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，則主要通過分子間引力和氫鍵作用產(chǎn)生吸附橋架，所以它們常與無機電解質(zhì)凝聚劑搭配使用。首先加入電解質(zhì)，使懸浮粒子間的雙電層電位降低、脫穩(wěn)，凝聚成微粒，然后再加入絮凝劑絮凝成較大的顆粒。無機電解質(zhì)的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而大大提高了絮凝的效果。這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。4.加入助濾劑助濾劑的使用方法有兩種：一種是在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑；另一種是直接加入到發(fā)酵液中，也可兩種方法同時兼用。5.加入反應(yīng)劑第二節(jié) 發(fā)酵液的相對純化一、高價無機離子的除去二、雜蛋白質(zhì)的除去第三節(jié) 發(fā)酵液的過濾一、過

22、濾與預(yù)處理的基本要求1.過濾速度一般要求過濾效率高，操作時間短，勞動強度低，能連續(xù)性操作。為什么要求過濾速度要快？這是由于：大多數(shù)生物產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，根據(jù)生物產(chǎn)物半衰期的特點，過濾時間越短，生物產(chǎn)物生物活性、效價單位損失越少，濾液的質(zhì)量和收率越好，加之生物工業(yè)生產(chǎn)是條大型的生產(chǎn)流水線，各工序之間應(yīng)相互銜接，密切配合，保證生產(chǎn)作業(yè)計劃順利進行，盡量縮短整個品種的生產(chǎn)周期，周期越短越好。由此可見，在保證過濾質(zhì)量的前提下，過濾速度越快越好，對提高產(chǎn)質(zhì)量均有利。過濾速度的表示方法：m3/hm22.濾液質(zhì)量（1）濾液澄清；（2）PH適中；（3）一定濃度；（4）溫度；（5）雜質(zhì)含量要求。對發(fā)酵液的過濾為什

23、么必須做到濾液要清，過濾速度要快？這是因為：若濾液不清就會影響生物產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。因為對非水溶性生物產(chǎn)物來講，若濾液不清，則意味著含有生物產(chǎn)物的菌絲體漏入了廢的濾液中，這會大大影響過濾收率，最后使生物產(chǎn)量減少；對水溶性生物產(chǎn)物來講，若濾液不清，則意味著廢的濾餅（渣）滲漏入含有生物產(chǎn)物的濾液中，這會給后步提取精制帶來影響，甚至導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降。3.過濾收率4.綜合利用5.清洗消毒二、設(shè)備（一）板框過濾機優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，濾液質(zhì)量好。缺點：勞動強度大，費濾布，不能連續(xù)操作，占地面積大衛(wèi)生差，生產(chǎn)能力低。若采用板框過濾機時，要考慮幾個問題：1.發(fā)酵液內(nèi)固形物總?cè)萘繎?yīng)小于板框總?cè)莘e，應(yīng)在50-80%。

24、2.批處理完畢總用時間應(yīng)在菌絲體產(chǎn)生嚴(yán)重自溶之前。3.處理一批料液量，應(yīng)一次濾完，不能考慮中途拆洗一次，因而在設(shè)計上要考慮足夠的總臺數(shù)。板框過濾機有明流及暗流式兩種，但目前國外已趨向自動化操作，形式有立式和臥式兩種，濾布可以自動行走清洗。（二）真空轉(zhuǎn)鼓過濾機（三）硅藻土過濾機（四）離心分離機生物工業(yè)中常見的離心分離設(shè)備有：碟片式離心機管式離心機傾析式離心機：對于含固量較多的發(fā)酵液，還可采用傾析式(或稱螺旋型)離心機(decanter centri fuge)，它依靠離心力和螺旋的推進作用自動排渣。（五）其他固液分離方法二、助濾劑和過濾介質(zhì)助濾劑：發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中為了加快過濾速率，提高濾液質(zhì)量，有

25、時加入某一種固體物質(zhì)，凡是能提高過濾速率的物質(zhì)，就稱為助濾劑。（一）助濾劑應(yīng)具備的條件1.本身是一種極細(xì)的堅硬的，不具有壓縮性的固體顆粒。2.是一惰性物質(zhì)，在液體中不起反應(yīng)，也不會釋放有害物質(zhì)，對抗生素等生物產(chǎn)物也不會釋放有害物質(zhì)，對目標(biāo)產(chǎn)物無多大吸附作用。3.能懸浮在水中，有一定細(xì)度，其大小適合保留欲過濾的固體。4.因為一般用量較大，故應(yīng)考慮資源與成本。三、發(fā)酵對過濾的影響（一）正常發(fā)酵對過濾的影響（二）發(fā)酵液染菌批號難過濾的幾種措施第四節(jié) 不過濾提取的發(fā)酵液預(yù)處理預(yù)處理的目的：1.釋放單位，提高收率；2.降低發(fā)酵液粘度，便于樹脂分離；3.調(diào)整合適PH，有利吸附；4.減少雜質(zhì)含量。第五節(jié) 介

26、紹幾種預(yù)處理工藝第四章 微生物細(xì)胞破碎第一節(jié) 細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)一、細(xì)菌細(xì)胞壁細(xì)菌細(xì)胞壁占細(xì)胞干重的10%-25%，堅韌而略具彈性，包圍在細(xì)胞的周圍，使細(xì)胞具有一定的外形和強度。 肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分，它是一個大分子復(fù)合體，由多糖鏈借短肽交聯(lián)而成。細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度和強度取決于多糖鏈上所存在的肽鍵數(shù)量和其交聯(lián)的程度。交聯(lián)的程度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就越致密，破碎的難度也就越大。 G細(xì)菌：細(xì)胞壁較厚，只有一層（20-80nm），主要由肽聚糖組成（占40%-90%），其余是多糖和胞壁酸。其肽聚糖結(jié)構(gòu)為多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中75%的肽聚糖亞單位相互交聯(lián)，網(wǎng)

27、格致密堅固。 G細(xì)菌：細(xì)胞壁包括內(nèi)壁層和外壁層。內(nèi)壁層較?。?-3nm），由肽聚糖組成；外壁層較厚 （8-10nm），主要由脂蛋白和脂多糖組成。 G菌細(xì)胞壁的肽聚糖為單層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它們只有30%的肽聚糖亞單位彼此交聯(lián)，故其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及G細(xì)菌的堅固，顯得比較疏松。二、酵母菌細(xì)胞壁酵母菌細(xì)胞壁比G細(xì)菌要厚，大多為100-300nm，但不及G細(xì)菌細(xì)胞壁堅韌。幼細(xì)胞的細(xì)胞壁較薄，有彈性，以后逐漸變厚、變硬。研究表明，有可能僅有一部分厚度對細(xì)胞壁的剛性和強度起重要作用。 酵母細(xì)胞壁由特殊的酵母纖維素構(gòu)成，其主要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、蛋白質(zhì)（6%-8%）和脂類（8.5%-13.

28、5%），幾丁質(zhì)含量因種而異。不含纖維素。細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)可分為三層：最里層葡聚糖層，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀。外層甘露聚糖層中間層蛋白質(zhì)層葡聚糖層與甘露聚糖層之間靠處于中間的蛋白質(zhì)交聯(lián)起來，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。近10%的甘露聚糖的側(cè)鏈通過磷酸二酯鍵與磷酸連接同細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，酵母細(xì)胞壁破碎的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。三、霉菌細(xì)胞壁霉菌細(xì)胞壁厚度為100-250nm，主要由多糖組成（80%-90%），其次含有較少的蛋白質(zhì)和脂類。不同的霉菌，細(xì)胞壁的組成有很大的不同，其中大多數(shù)的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成的。由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強度比

29、細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。四、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與細(xì)胞破碎為了破碎細(xì)胞，必須克服的主要阻力是連接細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價鍵。各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)差異很大，取決于遺傳信息、培養(yǎng)生長環(huán)境和菌齡。此外，霉菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)還隨培養(yǎng)過程中機械攪拌作用的強弱而變化。在機械破碎中，細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)胞壁的厚度和聚合物的交聯(lián)程度是影響破碎難易程度的重要因素。在使用酶法和化學(xué)法溶解細(xì)胞時，細(xì)胞壁的組成顯得特別重要，其次是細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。了解細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，就可選擇合適的溶菌酶和化學(xué)試劑，以及在使用多種酶或化學(xué)試劑相結(jié)合時確定其使用的順序。第二節(jié) 常用破碎方法細(xì)胞破碎的目的是釋出胞內(nèi)產(chǎn)物，其方法很多。按其是否

30、使用外加作用力可分為：一、珠磨法（Bead mill）是一種有效的細(xì)胞破碎法。其工作原理是：進入珠磨機的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑1mm一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。延長研磨時間、增加珠體裝量、提高攪拌轉(zhuǎn)速和操作溫度等都可有效地提高細(xì)胞破碎率，但高破碎率將使能耗大大增加。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。此外，破碎率的確定，主要是根據(jù)產(chǎn)物的總收率來確定，并兼顧下游過程。二、高壓勻漿法（High-pressure homogenizatio

31、n） 高壓勻漿法是大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，所用設(shè)備是高壓勻漿器，它是由高壓泵和勻漿閥組成。影響其細(xì)胞破碎的因素主要有壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度。 破碎性能，隨菌體的種類和生長環(huán)境的不同而不同。一般說來，酵母菌較細(xì)菌難破碎，處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞較處于快速生長狀態(tài)的細(xì)胞難破碎，在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞比在簡單合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞較難破碎。 此外，不宜采用高壓勻漿法破碎的微生物細(xì)胞有：易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，以及含有包含體（inclusion body）的基因工程菌，因為包含體質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥。高壓勻漿法與珠磨法相比： （1）前者操作參數(shù)少，易于確定，適合于大規(guī)模操作；

32、后者操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗估計，在大規(guī)模操作中夾套冷卻控溫難度較大。珠磨機連續(xù)操作時兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性。而高壓勻漿法需配備換熱器進行級間冷卻。 （2）珠磨法破碎在適當(dāng)條件下一次操作即可達到較高的破碎率，而高壓勻漿法往往需循環(huán)2-4次才行。 （3）珠磨機適合于各種微生物細(xì)胞的破碎，而高壓勻漿不適合于絲狀真菌及含有包含體的基因工程菌。三、超聲破碎法（Ultrasonication）也是應(yīng)用較多的一種破碎法，通常采用的超聲破碎機在15-25kHz的頻率下操作。一般認(rèn)為超聲波破碎的機理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation），空穴的形成、增大的閉合產(chǎn)生極大

33、的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。對不同菌種的發(fā)酵液，超聲破碎的效果差別較大。一般地，桿菌比球菌較易破碎，革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞比革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞較易破碎，對酵母菌的效果較差。四、酶溶法（Enzymatic lysis）是一種研究較廣的方法，它利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達到破壁的目的。 酶溶法可分為：1.外加酶法在外加酶法中，常用的溶酶有溶菌酶（Lysozyme）、-1,3-葡聚糖酶（Glucanase）、 -1,6-葡聚糖酶、蛋白酶（Protease）、甘露糖酶（Mannanase）、糖苷酶（Glycosidase）、肽

34、鍵內(nèi)切酶（Endopeptidase）、殼多糖酶等，而細(xì)胞壁溶解酶（Zymolyase）是幾種酶的復(fù)合物。其中溶菌酶主要用于細(xì)菌類，其他酶對酵母作用較顯著。溶酶同其他酶一樣具有高度專一性，外加酶法主要用于實驗室規(guī)模。2.自溶法 自溶法(Autolysis)是一種特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的。自溶法的缺點是對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性；此外，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速率下降。五、化學(xué)滲透法某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性(滲透性)，從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來，這種處理方式稱為化學(xué)滲透法(Ch

35、emical permeation)。化學(xué)滲透法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成，不同化學(xué)試劑對各種微生物作用的部位和方式有所不同。1.表面活性物質(zhì)：可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。2.EDTA鏊合劑：可用于處理革蘭氏陰性菌，它對其細(xì)胞外層膜有破壞作用。 3.有機溶劑：能分解細(xì)胞壁中的脂類。4.變性劑：鹽酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的變性劑。一般認(rèn)為變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。優(yōu)點：（1）對產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，

36、而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)?？刂茥l件可以有選擇地釋放出位于細(xì)胞內(nèi)不同部位的產(chǎn)物。 （2）細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液黏度低，易于固液分離和進一步提取。缺點：（1）通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細(xì)胞。（2）時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%。（3）有些化學(xué)試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過程中，需設(shè)法分離除去。六、其他方法1.X-press法：X-press法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25 oC形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。優(yōu)點：適應(yīng)范圍廣，破碎率高，細(xì)胞

37、碎片粉碎程度低，活性保留率高。缺點：目前主要用于實驗室，且不適用于對冷凍敏感的生化物質(zhì)。2.滲透壓法（Osmotic pressure）是一種較溫和的細(xì)胞破碎法。將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破碎。于是，細(xì)胞內(nèi)容物就釋放出來。適用性：此法僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或者在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強度減弱。3.反復(fù)凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞

38、膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用性：只適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，常需反復(fù)多次。此外，在凍融過程中，可能引起某些蛋白質(zhì)變性。4.干燥法氣流干燥主要適用于酵母菌。真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。第三節(jié) 破碎率的測定與破碎技術(shù)的研究方向一、破碎率的測定二、破碎技術(shù)的研究方向思考題1.常用細(xì)胞破碎方法（珠磨法、高壓勻漿法、超聲破碎法、酶溶法、化學(xué)滲透法）的原理、特點及適用性。第五章 溶劑萃取與浸取第一節(jié) 溶媒萃取一、溶劑萃取過程的理論基礎(chǔ)目前還不能定量地解釋溶解的規(guī)律，用得較多的仍然是“相

39、似相溶”原理。分子之間可以有兩方面的相似：一是分子結(jié)構(gòu)相似，如分子的組成、官能團、形態(tài)結(jié)構(gòu)的相似； 二是能量（相互作用力）相似，如相互作用力有極性的和非極性的之分，兩種物質(zhì)如相互作用力相近，則能互相溶解。與水“相似”的物質(zhì)易溶于水，與油“相似”的物質(zhì)易溶于油就是相似相溶原理的表現(xiàn)。3.溶劑的極性溶劑萃取的關(guān)鍵是萃取溶劑的選擇，而選擇的依據(jù)是“相似相溶”的原則。前已說明“相似”有兩個方面：一是分子結(jié)構(gòu)相似，這相對容易考察；另一個是分子間作用能相似，即分子間相互作用力相似。在生物工業(yè)上，對后一點考察較多的是分子極性。介電常數(shù)是一個化合物摩爾極化程度的量度，如果已知介電常數(shù)，就能預(yù)測該化合物是極性的

40、還是非極性的。根據(jù)萃取目標(biāo)物質(zhì)（產(chǎn)物）的介電常數(shù)，尋找極性相接近的溶劑作為萃取溶劑，也是溶劑選擇的重要方法之一。二、與溶劑萃取有關(guān)的一些名詞及定義（一）溶劑萃取的相與相比萃取：在一個萃取體系中，水相料液與有機相接觸時，料液中的溶質(zhì)向有機相轉(zhuǎn)移的過程。*反萃取：是將負(fù)荷有機相與反萃劑（含無機酸或堿的水溶液，有時也可以是水）相接觸，使某種被萃入有機相的溶質(zhì)轉(zhuǎn)入水相的過程，可把這種過程看作是萃取的逆過程。（三）分配定律和分配比在萃取和反萃取的過程中，“平衡”都是暫時的、有條件的。當(dāng)條件變了，原來的平衡就會被打破并建立起新的平衡。能斯特（Nernst）分配定律認(rèn)為：在一定溫度一定壓力的條件下，溶質(zhì)分配

41、在兩個互不相溶的溶劑中，達到平衡時溶質(zhì)在兩相中的活度之比為一常數(shù)。如果是稀溶液，活度可用濃度代替，則達到平衡時溶質(zhì)在兩相中的濃度之比為一常數(shù)。這一常數(shù)稱之為分配系數(shù)K，即有：萃取相濃度 c1K （ 5-1）萃余相濃度 c2常溫下K為常數(shù)，c的單位通常用mol/L或u/ml。式（5-1）應(yīng)用條件（1）稀溶液；（2）溶質(zhì)對溶劑之互溶度沒有影響；（3）必須是同一種分子類型，即不發(fā)生締合或離解。當(dāng)滿足這樣條件時，分配系數(shù)為一常數(shù)，它與溶質(zhì)的總濃度和相比都沒有關(guān)系，只與溶質(zhì)分子在有機相中的溶解度有關(guān)，簡而言之，分配定律只適用于稀溶液的簡單物理分配體系。但是在大多數(shù)萃取體系中，情況往往比較復(fù)雜。分配比（D

42、）：表示萃取體系達到平衡后，被萃取溶質(zhì)在有機相中總濃度與水相總濃度之比。c1 (c1)1(c1)2(c1)3···(c1)nDc2 (c2)1(c2)2(c2)3···(c2)n分配比不是常數(shù)，它隨被萃取溶質(zhì)的濃度、水相的酸度、萃取劑的濃度、稀釋劑的性質(zhì)、溫度以及其他物質(zhì)的存在等因素的變化而變化。（四）萃取因數(shù)（萃取比）*萃取因數(shù)：萃取平衡后，被萃取溶質(zhì)進入有機相的總量與該溶質(zhì)在萃余液中總量之比。通常以 E表示。這個物理量在用計算法確定流比和理論級數(shù)時有用。若以V1和V2分別表示有機相和水相的體積，M1和M2分別表示溶質(zhì)在有機相和水相

43、中的平衡濃度。根據(jù)定義，萃取因數(shù)：有機相中總?cè)苜|(zhì)量 M1V1E水相中總?cè)苜|(zhì)量 M2V2又因分配比： 相比：M1 V1D RM2 V2所以 ED·R即萃取因數(shù)等于分配比與相比的乘積。由上式可知，萃取因數(shù)實際上就是在相比等于1時的分配比。E 不是常數(shù)，其數(shù)值與相比、萃取劑濃度、溫度、PH、溶質(zhì)在水相和有機相中的解離、水相中溶質(zhì)濃度等因素有關(guān)。（五）萃取率()萃取率：表示萃取過程中溶質(zhì)被萃取到有機相中份數(shù)，通常以百分?jǐn)?shù)表示。被萃到有機相中溶質(zhì)總量 M1V1×100%×100%原始料液中溶質(zhì)總量 M1V1 M2V2E D×100%×100%E1 D1/

44、R由上式可以看出，萃取率與萃取因數(shù)或分配比和相比有關(guān)。分配比越高，相比越大，萃取率越高，也就是萃取越完全。當(dāng)相比等于1時，萃取率的大小完全取決于分配比。（六）分離因數(shù)（分離系數(shù)）DA KADB KB根據(jù)分配比定義，上式可以寫為：CA1/CA2 CA1CB2CB1/CB2 CB1CA2式中：CA1、CA2和CB1、CB2分別為溶質(zhì)A、B 在萃取相和萃余相的平衡濃度。值越大（或越小），說明兩種溶質(zhì)越容易分離。顯然，當(dāng)DADB，1時，兩種溶質(zhì)就分不開了。值得注意的是，當(dāng)萃取劑濃度、組成、水相成分、相比以及溫度等改變時，值就要發(fā)生變化。（七）飽和容量及操作容量（八）萃取的協(xié)同效應(yīng)協(xié)萃協(xié)萃：兩種或兩種以

45、上萃取劑同時萃取某一溶質(zhì)或其他化合物時，萃取性能優(yōu)于它們各自萃取的性能之和的效應(yīng)。三、溶劑萃取原理四、溶劑萃取法的特點*五、溶劑選擇的基本條件 1.有很大的萃取容量，即單位體積的萃取溶劑能萃取大量的產(chǎn)物。也就是分配系數(shù)K要大。K必須大于1，否則起不到濃縮作用2.分離因數(shù)高：即有良好的選擇性，理想情況是只萃取產(chǎn)物而不萃取雜質(zhì)。3.要有一定的比重差：比重差越大越好分離，一般說至少要0.1。4.溶解度與被萃取的液相（通常是水相）互溶度要小，且粘度低、界面張力小或適中，這樣有利于相的分散和兩相分離。 5.溶劑的回收和再生容易。6.化學(xué)穩(wěn)定性好，不易分解，對設(shè)備腐蝕性小。7.經(jīng)濟性好，價廉易得。8.安全

46、性好，閃點高，對人體無毒性或毒性低。*六、萃取方式及理論收得率的計算工業(yè)上萃取操作通常包括三個步驟：（1）混合料液和萃取劑充分混合形成具有很大比表面劑的乳濁液，產(chǎn)物自料液轉(zhuǎn)入萃取劑中。（2）分離將乳濁液分離成萃取相和萃余相。（3）溶劑回收從萃取相有時也需從萃余相（有少量混溶情況下）中分離出有機溶劑，并加以回收。因而工業(yè)萃取的流程中須有混合器、分離器和溶劑回收裝置。混合萃取和分離也可在同一臺設(shè)備內(nèi)完成。萃取操作流程可分為單級萃取和多級萃取。多級萃取中又有多級錯流萃取和多級逆流萃取之分。另外還有錯流和逆流結(jié)合的萃取。1.單級萃取即使用一個混合器和一個分離器的萃取操作。 S _L 混 分 合 離 器

47、 機 F _R 單級萃取 S萃取劑 F料液 L萃取液 R萃余液設(shè)料液體積為VF，萃取劑的體積為VS，經(jīng)萃取后，溶質(zhì)在萃取液和萃余液中總量（重量或克分子、或效價）的比值是萃取因數(shù)E，則：C1·VS VSEKC2·VF VF由此，即可計算出理論收率：萃取液溶質(zhì)總量1×100%料液溶質(zhì)總量萃取液溶質(zhì)總量×100%萃取液溶質(zhì)總量萃余液溶質(zhì)總量E×100%E12.多級錯流萃取料液經(jīng)萃取后的萃余液再用新鮮萃取劑進行萃取，稱為多級錯流萃取或多級順流萃取。由下圖可以看出，第一級萃余液（R1）作為第二級的料液，第二級的萃余液（R2）再作為第三級的料液，各自都用新

48、鮮萃取劑萃取。 多級錯流萃取流程的特點：每級均加新鮮溶劑，故溶劑消耗量大，得到的萃取液產(chǎn)物平均濃度較稀，但萃取較完全。其理論收得率為：111×100%(E11)(E21)······(En1)當(dāng)S1S2S3······SnS，即E1E2E3······EnE時，則：111×100%(E1)n3.多級逆流萃取在第一級中加入料液（F），萃余液順序加為后一級的料液，而在最后一級加入萃取劑（S），萃取液順

49、序作為前一級的萃取劑。料液移動的方向和萃取劑移動的方向相反，故稱為逆流萃取。多級逆流萃取流程的特點：料液走向和萃取劑走向相反，只在最后一級中加入萃取劑，故和錯流萃取相比，萃取劑消耗少，萃取液產(chǎn)物平均濃度高，產(chǎn)物收率最高。其理論收得率為：En1E1×100%En11七、影響溶劑萃取的主要因素（一）乳化和破乳化1.乳化乳化是一種液體（分散相）分散在另一種不相混溶的液體（連續(xù)相）中的現(xiàn)象。當(dāng)有機溶劑（通稱為油）和水混合加以攪拌時，可能產(chǎn)生兩種形式的乳濁液，一種是油滴分散在水中，稱為水包油型（O/W）乳濁液；另一種是水滴分散在油中，稱為油包水（W/O）型乳濁液。但油與水是不相溶的，二者混在一

50、起很快會分層，不能形成穩(wěn)定的乳濁液。只有第三種物質(zhì)乳化劑存在時，才容易形成乳濁液。乳化劑多為表面活性劑，它一般是由親油基和親水基兩部分組成，且能降低界面張力的物質(zhì)。表面張力也可以表示為增加單位表面積所需要的功。所以表面張力降低，液體容易分散成微滴而發(fā)生乳化。在乳濁液中，界面積大，物系的自由能大，故為熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)。時間一長，乳濁液會自行破壞。因此，要形成穩(wěn)定的乳濁液，還應(yīng)具備使其穩(wěn)定的條件。其穩(wěn)定性和下列幾個因素有關(guān)：界面上是否形成保護膜；液滴是否帶電；介質(zhì)的粘度。其中以為最重要。在發(fā)酵液中，蛋白質(zhì)是引起乳化的最重要的表面活性物質(zhì)。生產(chǎn)過程出現(xiàn)的乳濁液是水包油（O/W），還是油包水型（W/O

51、），主要由表面活性劑的性質(zhì)決定。當(dāng)表面活性劑的親水基團強度大于親油基團，易生成水 包油型（O/W）乳濁液；反之，則易生成油包水型（W/O）乳濁液。表面活性劑的親水與親油程度的相對強弱，在工業(yè)上常用HLB數(shù)來表示。它最早由經(jīng)驗得來，現(xiàn)在有一些經(jīng)驗公式用來計算，也可用實驗方法測定。HLB數(shù)即親水與親油平衡程度：HLB數(shù)越大，親水性越強，形成OW型乳濁液；HLB數(shù)越小，親油性越強，形成WO型乳濁液。當(dāng)HLB數(shù)未知時，可根據(jù)其溶解度或 分散程度粗略估計，見表5-6。不同HLB數(shù)的表面劑的用途見表5-7。根據(jù)對發(fā)酵液的分析，無機物中的酸、堿和鹽不是表面活性物質(zhì)，而在有機物中蛋白質(zhì)對表面張力的影響最明顯，

52、見圖5-11。從圖5-11可見隨著蛋白質(zhì)含量的上升，表面張力明顯下降即d/dc<0，所以蛋白質(zhì)是引起發(fā)酵液乳化的表面活性物質(zhì)之一。乳濁液穩(wěn)定性大小可用乳濁液在離心機中(分離因素一定)分離一定時間后，分出的有機相體積與原來有機溶劑體積之比作為指標(biāo)來表征。比值愈小，乳濁液愈穩(wěn)定?？股貫V液中含有蛋白質(zhì)顆粒（25- 30m），溶劑萃取時，這些顆粒在兩相界面上形成保護膜，產(chǎn)生穩(wěn)定乳濁液。蛋白質(zhì)一般是由疏水性肽鏈和親水性極性基團構(gòu)成，由于疏水基和親水基的平衡，蛋白質(zhì)顯示表面活性，而起乳化劑作用，構(gòu)成乳濁液。蛋白質(zhì)是憎水性的（親油基強度大于親水基），故形成W/O型乳濁液。2.乳化的防止和破乳化為了保

53、證溶劑萃取操作的正常進行，措施要分兩方面：一方面為萃取之前去除蛋白質(zhì)，使發(fā)酵濾液中的蛋白質(zhì)含量達到最低濃度；另一方面為在萃取過程中如何破壞生物產(chǎn)物發(fā)酵濾液中蛋白質(zhì)經(jīng)酸化變性后所引起的乳化作用。一般采用的措施如下：(1)乳化的防止嚴(yán)格發(fā)酵過程的代謝控制，合理確定發(fā)酵周期，準(zhǔn)確判斷放罐時間。加強發(fā)酵液預(yù)處理和過濾操作。常用的方法：a.過濾和離心分離b.熱處理c.等電點法d.加重金屬鹽法e.加絮凝劑法(2)破乳化a.電解質(zhì)中和法b.吸附法c.頂替法d.轉(zhuǎn)型法加入表面活性劑做去乳劑，改變界面的表面張力，促使乳濁液轉(zhuǎn)型，就是使W/O型的乳濁液變?yōu)镺/W型的過程或者是相反的過程，但又不穩(wěn)定，從而達到破乳的

54、目的。3.常用的去乳化劑及應(yīng)用除預(yù)先除去引起乳化的蛋白質(zhì)外，如何破壞這種乳濁液，可有以下幾種途徑：引入一種親水性表面活性劑，且其乳化能力要強于進入有機相的中性蛋白質(zhì)；加入一種能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，從而改變蛋白質(zhì)等電點的物質(zhì)；加入一種水溶性陽離子表面活性劑，使其既能中和蛋白質(zhì)上的負(fù)電荷，又能形成向O/w型乳濁液轉(zhuǎn)化的能力。常用的破乳劑有：（1）陽離子表面活性劑a.十二烷基三甲基溴化銨（1231） 化學(xué)結(jié)構(gòu)式：CH3-(CH2)10-CH2·(CH3)3NBr，易溶于水，淺黃色粘稠狀液體，含量50%左右，在酸性下不溶于有機溶劑。因此適于破壞w/o型乳濁液。其作為破乳劑時和蛋白質(zhì)有兩種

55、作用方式：由于1231為陽離子表面活性劑，其離子帶正電荷，溶液中蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，它的加入會中和蛋白質(zhì)所帶的負(fù)電荷，形成沉淀；和蛋白質(zhì)形成1231-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并中和掉蛋白質(zhì)分子上的部分負(fù)電荷，即提高了蛋白質(zhì)分子的等電點。在1231濃度低時，由于溶液中的1231不足以中和掉蛋白質(zhì)上所有負(fù)電荷并將其沉淀，而且因其提高了蛋白質(zhì)的等電點，使得蛋白質(zhì)更容易成為中性進入有機相，此時，乳化反而加劇。當(dāng)1231加量0.075% w/v濾液體積，即使在離心分離后，整個有機相仍是全乳化狀態(tài)，其乳化程度反而比不加1231者更為嚴(yán)重；當(dāng)1231的加量提高至w/v0.25%w/v濾液體積時，這時不用離心，兩相就可獲得很好的分離，界面無中間層，水底有沉淀物，說明