微生物學(xué)實驗報告

1、微生物學(xué)實驗報告實驗一普通光學(xué)顯微鏡的使用及細(xì)菌染色與形態(tài)觀察第一部分：顯微鏡的使用一、目的要求1熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、油鏡的使用原理和顯微鏡的維護(hù)方法。2學(xué)會正確使用油鏡觀察細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊構(gòu)造。3了解各種顯微鏡的主要特征。二、實驗原理（一）光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造微生物實驗室中最常用的是普通光學(xué)顯微鏡， 它的構(gòu)造可分為機(jī)械部分和光學(xué)部分。1、機(jī)械部分普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡的機(jī)械部分通常包括以下幾個部分： 目鏡、鏡筒、基座回轉(zhuǎn)器、物鏡、載物臺、光圈、聚光器、光源、鏡臂、細(xì)調(diào)節(jié)器、粗調(diào)節(jié)器等。2、光學(xué)部分：目鏡、物鏡、聚光器、光圈、光源。（二）放大倍數(shù)標(biāo)本首先經(jīng)物鏡放大， 在目鏡的焦距平面上形成一

2、個實像， 再經(jīng)過目鏡放大成最終的虛像。總的放大倍數(shù)是物鏡放大倍數(shù)與目鏡放大倍數(shù)的乘積。物鏡的放大倍數(shù)愈大，其工作距離（物鏡鏡頭到標(biāo)本片之間的距離）愈短，這時光圈就要打開得愈大。顯微鏡的放大倍數(shù)放大倍數(shù)總的放大倍數(shù)物鏡目鏡低倍鏡10×10×100×高倍鏡45×10×450×油鏡100×10×1000×（三）分辨距離與分辨力顯微鏡的性能受物鏡的分辨距離或分辨力所限制。分辨距離即透鏡所能分辨的兩個物點之間的最小距離， 分辨距離愈小， 透鏡的分辨力愈高， 物像也就愈清晰。因此常以分辨距離來衡量顯微鏡的分辨力。R=

3、0.61 /N.A式中： R-分辨距離；-作用光的波長；N.A-數(shù)值口徑。一些介質(zhì)的折射率.介 質(zhì)折射率空氣1水13玻璃55香柏油1.56三、實驗內(nèi)容（一）材料：顯微鏡，香柏油，擦鏡紙。（二）方法：細(xì)菌很小，須使用油鏡方可觀察到。 油鏡是顯微鏡上最重要的部件之一， 觀察時與玻片非常接近， 稍不小心即可壓碎玻片， 更嚴(yán)重的是損壞鏡頭， 故必須極其仔細(xì)地學(xué)習(xí)油鏡的使用方法：1、為使低倍鏡取得最適之光源，可將低倍鏡頭調(diào)節(jié)到離載物臺約 1cm的高度，將聚光器提高，光圈完全打開，然后調(diào)節(jié)電壓旋鈕至視野最合適。2、 滴一滴香柏油，固定于載物臺上，用推動器調(diào)節(jié)到載物臺正中。在雙目側(cè)視下，下旋粗調(diào)節(jié)器， 使油

4、鏡頭浸入油中幾乎與標(biāo)本片相接觸。 然后眼睛從目鏡觀察（如光線不足，可適當(dāng)增大電源電壓） ，徐徐上旋粗調(diào)節(jié)器至看到模糊物像之后，再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)以使物像清晰。 如鏡頭已離開油面還未看到物像， 則再重新操作。3、更換標(biāo)本時應(yīng)先提高油鏡頭，再更換玻片，切勿隨意移動顯微鏡的位置。4、油鏡觀察完畢后，按“顯微鏡保護(hù)”中（6）項處理。5、最后將油鏡各部分還原， 聚光器下降， 反光鏡垂直于鏡座， 鏡頭轉(zhuǎn)成八字形，以免與聚光器發(fā)生碰撞。四、思考題1、使用顯微鏡時為何調(diào)節(jié)下列構(gòu)造？反光鏡，光圈，聚光器，粗調(diào)節(jié)器，細(xì)調(diào)節(jié)器，鏡頭回轉(zhuǎn)器。答： 聚光器的位置之升降可影響視野的明亮度，上升則視野明亮，下降則光線減弱。光

5、圈的放大或縮小也可控制視野明亮程度。 粗調(diào)節(jié)器和細(xì)調(diào)節(jié)器均是調(diào)節(jié)焦距的裝置。鏡頭回轉(zhuǎn)器為裝置物鏡和轉(zhuǎn)換物鏡之用。2、使用不同放大倍數(shù)的物鏡時，工作距離與光圈的關(guān)系。如何利用這一原理用好顯微鏡？答：物鏡的放大倍數(shù)愈大，其工作距離（物鏡鏡頭到標(biāo)本片之間的距離）愈短。標(biāo)本首先經(jīng)物鏡放大， 在目鏡的焦距平面上形成一個實像， 再經(jīng)過目鏡放大成最終的虛像?？偟姆糯蟊稊?shù)是物鏡放大倍數(shù)與目鏡放大倍數(shù)的乘積。3、為何要選用與玻璃折射率相似的香柏油作為油鏡的介質(zhì)？油鏡的原理是什么？答：香柏油只在使用油鏡頭時（ 100 倍物鏡）使用，因為當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時，由于空氣（ n= 1.52 ）的折射率不同，光線

6、會發(fā)生折射，不僅使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角。當(dāng)以香柏油（ n=1.515）為介質(zhì)時，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過載玻片后可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射， 不僅增加了視野的照明度， 更重要的是通過增加數(shù)值孔徑達(dá)到提高分辨率的目的?？梢姽獾牟ㄩL平均為0.55 m。當(dāng)使用數(shù)值孔徑為 0.65 的高倍鏡時，它能辨別兩點之間的距離為0.42 m；而使用數(shù)值;.孔徑為 1.25 的油鏡時，能辨別兩點之間的距離則為 0.22 m。選用香柏油是因為它的折射率是 1.5154、顯微鏡有哪幾種？各自的主要特征是什么？答：光學(xué)顯微鏡中除明視野顯微鏡外， 還有暗視野顯微鏡、

7、 相差顯微鏡和熒光顯微鏡；除光學(xué)顯微鏡外，還有電子顯微鏡。暗視野顯微鏡：在普通光學(xué)顯微鏡載物臺下安裝一個暗視野聚光器即成暗視野顯微鏡。相差顯微鏡：相差顯微鏡成像的原理和普通光學(xué)顯微鏡一樣， 所不同的是相差顯微鏡包括有環(huán)狀光闌、裝有相板的相差物鏡和全軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡三個特殊部分。熒光顯微鏡：熒光顯微鏡的主要特征是以紫外線為光源， 當(dāng)照射到用熒光素標(biāo)記的細(xì)菌時，熒光素吸收了紫外線的能量后，再發(fā)射出可見的橙、黃、淺綠色熒光。由于用熒光素標(biāo)記的菌體各種結(jié)構(gòu)中的溶解、 吸附或化合情況不一， 于是發(fā)出不同色調(diào)和亮度的熒光，從而可以觀察細(xì)菌的不同結(jié)構(gòu)。電子顯微鏡：電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和工作原理與普通光學(xué)顯微鏡非

8、常相似，不同的是用電子流代替光線，用電磁圈代替透鏡聚焦。第二部分：細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查方法一、目的要求1、 了解不染色標(biāo)本檢查法，用懸滴法觀察活細(xì)菌及其動力。2、 熟悉染色標(biāo)本的制備過程，掌握革蘭氏染色法及其結(jié)果判斷，了解革蘭氏染色法原理。3、 了解其它常用染色法。二、實驗原理檢查細(xì)菌形態(tài)的主要工具是顯微鏡， 可根據(jù)不同目的將細(xì)菌染色或不染色進(jìn)行鏡檢。常用的堿性染料有結(jié)晶紫、美藍(lán)、堿性復(fù)紅等。染色法又分單染色法和復(fù)染色法兩大類。 單染色法即僅用一種染料著色， 所有的細(xì)菌均被染成一種顏色， 無鑒別細(xì)菌的作用。 復(fù)染色法又稱鑒別染色法， 通常用二種或二種以上的染料著色， 由于不同種類的細(xì)菌或同種細(xì)菌的不

9、同組成結(jié)構(gòu)對染料有不同的反應(yīng)性而被染成不同的顏色，從而有鑒別細(xì)菌的作用。2、 最常用的細(xì)菌復(fù)染色法是革蘭氏染色法（ Gram stain ）。通過革蘭氏染色法操作，可把細(xì)菌分成兩大類： 革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌。 凡能使第一種染料結(jié)晶紫保留藍(lán)色的細(xì)菌叫革蘭氏陽性細(xì)菌， 凡被灑精脫色后染上對比顏料沙黃或稀釋復(fù)紅而呈紅色的細(xì)菌叫做革蘭氏陰性細(xì)菌。三、實驗內(nèi)容（一）染色標(biāo)本的制備及觀察1、復(fù)染色法（革蘭氏染色法）材料：葡萄球菌瓊脂培養(yǎng)物1支大腸桿菌瓊脂培養(yǎng)物1支革蘭氏染液一套：結(jié)晶紫、 95%酒精、路哥氏碘液、稀釋復(fù)紅各1 瓶。玻片，接種環(huán)，酒精燈，吸水紙等。方法：（ 1）涂片用葡萄球菌和大腸

10、桿菌混合涂片。 取玻片一塊，拭凈。;. 用無菌接種環(huán)取生理鹽水一滴，放在玻片中央 （如被檢材料是液體， 可不加生理鹽水）。 左手斜持菌種試管，右手將菌種試管棉塞稍加轉(zhuǎn)動，以便拔下。 右手持接種環(huán)， 經(jīng)火焰滅菌后， 用右手小拇指拔開菌種試管棉塞，試管口通過火焰，將接種環(huán)插入試管中取菌少許（切不可多， 更不可將培養(yǎng)基刮下）。 試管口再通過火焰，塞好棉塞。 將接種環(huán)上的細(xì)菌加入玻片上之水滴內(nèi)，磨勻，涂成直徑為 1cm大小的薄菌膜。 接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌。 .（ 2）干燥涂片置于空氣中，使其自然干燥。（ 3）固定干燥后將涂片在火焰上緩緩?fù)ㄟ^三次， 此為“固定”。 目的是使細(xì)菌粘于玻片上， 染色和水沖時不易

11、脫落； 且細(xì)菌為蛋白質(zhì)， 被熱凝固可保持完整形態(tài)。（ 4）染色初染媒染脫色復(fù)染 加結(jié)晶紫染液于標(biāo)本上，使其覆滿標(biāo)本，染 12 分鐘。 細(xì)水沖洗。 加路哥氏碘溶液經(jīng)1 分鐘。 水洗。 加 95%酒精于玻片上來回流動，傾去酒精。如此重復(fù)23 次（約 30 秒鐘）。 水洗。 加稀釋復(fù)紅染液，染約1 分鐘。 水洗，用吸水紙吸干。（ 5）鏡檢革蘭氏陽性菌在結(jié)晶紫著色后不易被酒精脫色， 故仍為深藍(lán)色或紫色；革蘭氏陰性菌在結(jié)晶紫著色后易被酒精脫色， 故經(jīng)稀釋復(fù)紅復(fù)染后成紅色。三、實驗記錄革蘭氏染色過程：取玻片一塊，在玻片上滴三小滴水（有一定的距離） ，分別用接種環(huán)取 EC（大腸桿菌）和 BS（金黃色葡萄球菌

12、）與兩邊的水滴上，并混勻，灼燒接種環(huán)后再分別取 EC和 BS于中間的水滴上混勻 （即中間水滴是兩種菌的混合物），并在酒精燈下灼燒至干 （小心不要將玻片炸裂） ，用結(jié)晶紫進(jìn)行初染，細(xì)水沖洗后， 加路哥氏碘液進(jìn)行媒染， 水洗后加酒精脫色 23 次，水沖洗后加稀釋復(fù)紅染液復(fù)染一分鐘，水洗，并用吸水紙吸干。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，染色后呈紫紅色。普葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，染色后呈現(xiàn)藍(lán)紫色。以下為實驗觀測圖：;.四、思考題1染色法在微生物學(xué)上有何實際意義？染色法可以更方便的觀察細(xì)菌的具體形態(tài)， 更方便觀察細(xì)菌， 革蘭氏染色法有更重要的意義， 可以鑒別細(xì)菌， 把眾多的細(xì)菌分為兩大類， 革蘭氏陽性菌和革蘭氏

13、陰性菌，在實驗方面，可以通過殺死陽性或陰性菌而得到目的菌。2比較復(fù)染色法與單染色法的優(yōu)缺點。答：單染色法：優(yōu)點：僅用一種染料著色，所有的細(xì)菌均被染成一種顏色，簡單方便，可用來觀察細(xì)菌的形態(tài)和排列方式。缺點：但無鑒別細(xì)菌的作用。復(fù)染色法：優(yōu)點：用二種或二種以上的染料著色， 由于不同種類的細(xì)菌或同種細(xì)菌的不同組成結(jié)構(gòu)對染料有不同的反應(yīng)性而被染成不同的顏色，從而有鑒別細(xì)菌的作用。缺點：使用試劑較多，過程較單染色法更復(fù)雜繁瑣。3以革蘭氏染色法為例，說明它至少要涉及幾種試劑？各起何作用？答：至少用到 4 種試劑。結(jié)晶紫溶液進(jìn)行初染，路哥氏碘液進(jìn)行媒染， 95%酒精進(jìn)行脫色，稀釋復(fù)紅染液進(jìn)行復(fù)染。4要確證

14、一個未知細(xì)菌的革蘭氏染色性質(zhì)，你可用什么方法來說明你的結(jié)果是可靠的？答：通過在顯微鏡下的菌體被染的顏色可以判斷， 凡能使第一種染料結(jié)晶紫保留藍(lán)色的細(xì)菌為革蘭氏陽性細(xì)菌， 凡被灑精脫色后染上對比顏料沙黃或稀釋復(fù)紅而呈紅色的細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)菌。;.微生物學(xué)實驗報告實驗二培養(yǎng)基的的制備滅菌及接種技術(shù)培養(yǎng)基的制備和滅菌一、目的要求掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)具備的條件及其制備方法。二、實驗原理培養(yǎng)基是人工配制的供給細(xì)菌或其它微生物生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。 微生物的種類雖然繁多，但對基本營養(yǎng)物質(zhì)如碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因子和水分等的要求卻有共同性。 這些營養(yǎng)物質(zhì)的作用是： 提供合成菌體和代謝產(chǎn)物的原料；提供生

15、命活動必需的能量；調(diào)節(jié)代謝環(huán)境。作為培養(yǎng)基必須具備下列條件：含有適當(dāng)?shù)乃趾鸵欢ㄅ浔鹊倪m宜的營養(yǎng)物質(zhì)。 具有合適的酸堿度 （pH 值）。有適當(dāng)?shù)奈锢頎顟B(tài)： 液體培養(yǎng)基、 固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基必須經(jīng)滅菌成為無菌狀態(tài)后方能使用。利用培養(yǎng)基對細(xì)菌等進(jìn)行人工培養(yǎng)， 在微生物學(xué)上有重要意義。 例如，細(xì)菌純培養(yǎng)物的分離、培養(yǎng)，細(xì)菌生物學(xué)特性的研究、分類鑒定，菌種保藏等都需要利用培養(yǎng)基進(jìn)行人工培養(yǎng)。同時在傳染病的診斷、生物制品的研制、發(fā)酵生產(chǎn)，以及利用細(xì)菌等作為工具進(jìn)行的其它學(xué)科的研究中（如遺傳學(xué)、基因工程等） ，都離不開培養(yǎng)基的應(yīng)用和細(xì)菌的人工培養(yǎng)?；A(chǔ)培養(yǎng)基一般指的是營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊

16、脂培養(yǎng)基， 它通常由蛋白胨（主要作為氮源）、牛肉浸膏（作為碳源、氮源、維生素和無機(jī)鹽） 、氯化鈉（無機(jī)鹽并具有維持一定的滲透壓的作用） 和水所組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基含有大多數(shù)細(xì)菌生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。 另外，根據(jù)培養(yǎng)基的組成和使用目的菌不同， 還有加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基等。三、實驗內(nèi)容（一）馬丁培養(yǎng)基的配制：葡萄糖 10.0 g 、蛋白胨 5.0 g 、磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 1.0 g、硫酸鎂 (MgSO4·7H2 O) 0.5 g 、孟加拉紅 33.4 mg 、蒸餾水 1000 mL、實驗中使用的是已經(jīng)配制好的培養(yǎng)基粉，稱取36g，加入 1000ml 水，分裝在兩

17、個 500ml 的錐形瓶中，包扎，置于高溫滅菌鍋中121 下滅菌 30 min 。滅菌后進(jìn)行倒平板備用。四、思考題1液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基各有何功用？答：液體培養(yǎng)基：組分均一，適宜各類微生物的營養(yǎng)生長。廣泛應(yīng)用于實驗研究及大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，有利于廣泛獲得大量菌體或代謝產(chǎn)物。固體培養(yǎng)基： 瓊脂固體培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于微生物的分離培養(yǎng)、菌種鑒定和保藏。;.半固體培養(yǎng)基：用于觀察細(xì)菌的運(yùn)動、菌種鑒定及測定噬菌體的效價等。2細(xì)菌的人工培養(yǎng)需要哪些條件，在微生物學(xué)上有何重要意義？答：需要基本營養(yǎng)物質(zhì)：如碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因子和水分等。細(xì)菌純培養(yǎng)物的分離、培養(yǎng)，細(xì)菌生物學(xué)特性的研究、

18、分類鑒定，菌種保藏等都需要利用培養(yǎng)基進(jìn)行人工培養(yǎng)。 同時在傳染病的診斷、 生物制品的研制、 發(fā)酵生產(chǎn)，以及利用細(xì)菌等作為工具進(jìn)行的其它學(xué)科的研究中 （如遺傳學(xué)、 基因工程等），都離不開培養(yǎng)基的應(yīng)用和細(xì)菌的人工培養(yǎng)。;.微生物學(xué)實驗報告實驗三自然界中微生物的分離與純化一、目的要求1、學(xué)習(xí)并掌握從自然界中分離微生物的方法。2、掌握細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌的分離純化方法；二、基本原理土壤是微生物生活的大本營， 是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同， 一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多； 其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥、偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中放線菌數(shù)量較多；酵母菌在一

19、般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實驗從土壤中分離細(xì)菌、放線菌和霉菌；自面肥或酒曲或果園土分離酵母菌。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。 常用的是平板分離法和劃線分離法， 純化該微生物， 直至得到純菌株。平板分離法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上， 經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落， 即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。 該法雖然操作繁瑣，但可獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗（如活菌制劑） ，以及食品、飲料和水等的含菌指數(shù)或污染程度

20、的檢測。三、實驗材料（一）菌源1、土樣：選定采土地點后，鏟去表土層 23 cm，取 310 cm 深層土壤 10 g ，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內(nèi)，封好袋口，并記錄取樣地點、環(huán)境及日期。土樣采集后應(yīng)及時分離，凡不能立即分離的樣品，應(yīng)保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌相的變化。（二）培養(yǎng)基（制平板）1、馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g、蛋白胨 5.0 g、磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 1.0 g 硫酸鎂 (MgSO4·7H2O) 0.5 g 、孟加拉紅 33.4 mg 、蒸餾水 1000 mL、 121 30 min 滅菌。（三）無菌水配制無菌水，分裝于 250 mL錐形瓶，每瓶裝

21、99 mL），每瓶內(nèi)裝 44 粒玻璃珠。分裝試管、每管裝 9 mL（每組 4 支），121滅菌 20min。（四）其他物品：無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌玻璃涂棒、稱量紙、藥勺、橡皮頭、 10酚溶液。四、操作步驟（一）稀釋涂布平板分離法（ 1）制備土壤稀釋液稱取土樣 10 g ，放入到盛有99 mL 無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的1三角瓶中，置搖床振蕩1020 min，使土壤均勻分散成土壤懸液（10 ）。用 1 mL;.吹 3 次，振蕩均勻（ 10 2）。用同樣方法依次制成 102 104 的土壤稀釋液（為避免稀釋過程誤差，進(jìn)行微生物計數(shù)時，最好每一個稀釋度更換一支移液管） 。（ 2）涂布法分離依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化的培養(yǎng)基， 待平板冷凝后， 用無菌移液管分別吸取上述 10-1 、 10-2 、10-3 、10-4 四個稀釋度菌懸液 0.2 mL ，依次滴加于相應(yīng)編號已制備好的培養(yǎng)基平板上， 用無菌玻璃涂棒涂勻 （一定要多涂幾遍， 涂到菌液均勻分布為止，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破） 。將平板倒置于恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察結(jié)果。（二）平板菌落形態(tài)及個體形態(tài)觀察從不同平板上選擇不同類型菌落用肉眼觀察，觀察各種霉菌菌落的形態(tài)特征。五、實驗記錄1、樣品來源：