大黃蒽醌類衍生物論文：5種大黃蒽醌類衍生物的同時(shí)測(cè)定及應(yīng)用架片的研制及其釋藥影響因素的研究

1、 大黃蒽醌類衍生物論文:5種大黃蒽醌類衍生物的同時(shí)測(cè)定及應(yīng)用【摘要】目的建立同時(shí)測(cè)定大黃藥材中5種蒽醌類衍生物(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的方法,優(yōu)化大黃蒽醌的超聲提取工藝。方法采用反相高效液相法,色譜柱:Waters C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 m;流動(dòng)相:甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液 (352;柱溫:25 ;流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm。結(jié)果5種游離蒽醌均具有較寬的線性范圍且呈良好的線性關(guān)系(R2=0.998 70.999 7,平均回收率為92.79%99.28%,日內(nèi)精密度為0.65%1.71%,日間精密度為2.5

2、2%3.46%。結(jié)論該方法成功應(yīng)用于大黃活性物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化,根據(jù)所建立的方法測(cè)得的5種游離蒽醌含量,確定了大黃蒽醌的最佳超聲提取工藝為:以70%乙醇為溶劑、料液比為130 (gml、超聲提取2次、每次提取20 min?！娟P(guān)鍵詞】超聲提取;大黃; RP-HPLC;蒽醌 Abstract:ObjectiveTo develop a method for the simultaneous determination of five anthraquinone derivatives (aloe-emodin, rhein, emodin, chrysophanol and physcion in

3、 rhubarb, and to optimize the ultrasonic extraction conditions.MethodsRP-HPLC on a Waters C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 m was used. The mobile phase was methanol-acetonitrile-0.01% phosphoric acid solution (3:5:2, at a flow rate of 1.0 ml/min, and the detection wavelength was 225 nm. ResultsThe

4、linear ranges of the five free anthraquinones were wide, showing good linear correlations with correlation coefficients (R2 of 0.9987 to 0.9997. The average recoveries were from 92.79% to 99.28%. While the intra-day and inter-day precision were 0.65%1.71% and 2.52%3.46%, respectively.ConclusionThrou

5、gh the contents of five anthraquinone derivatives obtained by the developed RP-HPLC method, the optimum ultrasonic extraction conditions are determined as follows: using 70% EtOH as extracting solvent, the sample is extracted two times and each time for 20 min by a ultrasonic processor, when the sol

6、id to liquid ratio is 1:30 (g/ml.Key words:Ultrasonicextraction; Rhubarb; RP-HPLC; Anthraquinones大黃Radix et Rhizoma Rhei為蓼科植物掌葉大黃Rheum Palmatum L.,唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim. ex Balf 或藥用大黃Rheum officinale Baill的干燥根和根莖,味苦、性寒。臨床研究證實(shí),大黃具有抗衰老、降血脂、抗腫瘤和抗炎、瀉下作用及抗菌性、止血性等多種生物學(xué)活性1。其主要有效成分為蒽醌類衍生物,包括蘆薈大黃素、大黃酸、

7、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚以及與葡萄糖結(jié)合成苷。5種蒽醌是大黃以及衍生中藥大黃屬2質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。大黃中蒽醌的分離和測(cè)定方法有薄層色譜法(TLC3,高速逆流色譜法(HSCCC4,5,膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(MEKC6,毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE7,高效液相色譜法(HPLC8,加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC9。高效液相色譜正是以其穩(wěn)定、可靠、高效的特點(diǎn)成為中藥研究的最普遍和常用的分析方法。本文建立了同時(shí)測(cè)定大黃藥材中5 種蒽醌衍生物(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的RP-HPLC法,旨在確定大黃蒽醌的最佳超聲提取工藝,同時(shí)可應(yīng)用于大黃藥材及其制劑質(zhì)量的定量評(píng)價(jià),為大黃藥材的有效開發(fā)和

8、利用提供依據(jù)。1 儀器與材料Agilent 1100型高效液相色譜儀(四元梯度泵,DAD檢測(cè)器,HP Chem Station 色譜工作站,美國(guó)安捷倫科技,上海BRANSONSB2200超聲波發(fā)生器,D1810C型電子分析天平(上海申生科技有限公司,R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司,萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;四川產(chǎn)大黃藥材購(gòu)于湖南國(guó)杏中藥飲片有限責(zé)任公司,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定為正品。藥材于40 干燥、粉碎過40目篩,貯于干燥器中置暗處保存?zhèn)溆?甲醇、乙腈、磷酸均為江蘇漢邦科

9、技有限公司生產(chǎn)的色譜純,二次蒸餾水,乙醇、醋酸乙酯、石油醚、正己烷等均為北京化工廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?2 方法與結(jié)果2.1 HPLC-DAD分析條件色譜柱為Waters PAH C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 m;柱溫:25;進(jìn)樣量:20 l;流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm。流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液 (352。試樣過0.45 m的微孔濾膜后進(jìn)行HPLC分析。2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液精密稱取5種對(duì)照品適量,加甲醇配制成含蘆薈大黃素(135 g/ml,大黃酸(105 g/ml,大黃素(90 g/ml,大黃酚(90 g/m

10、l,大黃素甲醚(75 g/ml的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液。于4 下冷藏,備用。2.2.2 工作標(biāo)準(zhǔn)液臨用前精密吸取適量加甲醇配制成每1 ml分別含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為13.5,10.5,9,9,7.5 g的工作標(biāo)準(zhǔn)液。2.3 樣品溶液制備稱取0.5 g 大黃細(xì)粉,用15 ml溶劑(正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水進(jìn)行超聲提取, 抽濾,濾液于40 下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,后用甲醇溶解定容于10 ml容量瓶中,于4 下冷藏,備用。 2.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)2.4.1 色譜分離在擬定的色譜條件下,得到蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的

11、標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖1a 以及大黃藥材樣品的色譜圖(圖1b 。由圖1可知,樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚與相鄰組分的分離度Rs>1.5 ,達(dá)到基線分離。2.4.2 線性關(guān)系取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣3次,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸,各組分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1。表1 5種標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍,線性方程和回歸系數(shù)(略2.4.3 精密度考察精密度分為日內(nèi)精密度和日間精密度。對(duì)同一工作標(biāo)準(zhǔn)液在日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次,得日內(nèi)精密度,結(jié)果測(cè)得峰面積的RSD為蘆薈大黃素0.65%,大黃酸1.09%,大黃素0.98%,大黃酚1

12、.39%,大黃素甲醚1.71%;在連續(xù)3 d內(nèi)分別測(cè)定5次得日間精密度,結(jié)果測(cè)得峰面積的RSD為蘆薈大黃素3.46%,大黃酸2.52%,大黃素3.26%,大黃酚3.15%,大黃素甲醚3.06%。 2.4.4 重復(fù)性考察在上述色譜條件下,對(duì)同一批樣品按樣品溶液的制備方法平行制備6份,分別進(jìn)樣20 l,進(jìn)樣測(cè)定,按外標(biāo)法測(cè)定含量并計(jì)算RSD,蘆薈大黃素2.52%,大黃酸2.20%,大黃素2.10%,大黃酚2.07%,大黃素甲醚2.89%。2.4.5 準(zhǔn)確性(加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的大黃藥材細(xì)粉適量,精密加入對(duì)照品適量,振搖,其余按樣品溶液的制備方法,在上述相同色譜條件下分別進(jìn)樣,按外標(biāo)法測(cè)定其含

13、量,計(jì)算加樣回收率和RSD。結(jié)果見表2。表2 測(cè)定方法回收率結(jié)果(略2.5 方法的應(yīng)用-最適超聲提取工藝的確定稱取0.5 g 大黃細(xì)粉,用50ml溶劑(正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水進(jìn)行超聲提取30 min, 抽濾,濾液于40 下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,后用甲醇溶解定容于10 ml容量瓶中,于4 下冷藏,備用。在上述色譜條件下對(duì)各提取液進(jìn)行HPLC分析,測(cè)定其中5種游離蒽醌含量。結(jié)果見表3。表3 溶劑對(duì)游離蒽醌提取率的影響(略表3結(jié)果表明,正己烷等低極性溶劑提取大黃游離蒽醌效率低,而甲醇,乙醇提取率高,在水中提取效率很低,且 提不出大黃酸,這是因?yàn)槠湓谒?/p>

14、中溶解性小。大黃游離蒽醌中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素在以80%甲醇作為提取溶劑時(shí),提取率最高;大黃酚、大黃素甲醚在以甲醇作為提取溶劑時(shí),提取率最高;游離蒽醌提取效率次高的為70%乙醇?？紤]到甲醇有毒,不宜用于食品和藥物的加工,而乙醇從自然得來,成本低等諸因素,我們認(rèn)為70%乙醇最合適。以70%乙醇為提取溶劑,其他條件不變,考察不同超聲提取時(shí)間(10,20,30,40,60 min對(duì)5種游離蒽醌提取率的影響:蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素在20 min時(shí)提取率最高(2.092,2.913,2.497 mg/g,大黃酚、大黃素甲醚在40 min提取率最高(5.069 mg/g、1.294 mg/g,

15、在20 min時(shí)次之(5.042 mg/g,1.286 mg/g,綜合考察選擇20 min為提取時(shí)間。以同樣的方法,分別考察了不同料液比(15,110, 120,130,140,150 g/ml以及超聲提取次數(shù)對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示,5種大黃游離蒽醌在130料液比時(shí)提取效率最高;超聲提取兩次最為合適。3 結(jié)論 本文建立了同時(shí)測(cè)定大黃藥材中5種蒽醌類衍生物(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的RP-HPLC法,該方法測(cè)定5種游離蒽醌的日內(nèi)和日間精密度RSD分別在0.65%1.71%和2.52%3.46%之間,準(zhǔn)確度高;回收率在92.79%99.28%之間;具有寬線性范圍和良好

16、的線性關(guān)系(R2在0.998 70.999 7之間。所建立的方法應(yīng)用于大黃活性物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化,確定了大黃蒽醌的最佳超聲提取工藝為:以70%乙醇為溶劑、料液比為130 (gml、超聲提取2次、每次提取20 min。本實(shí)驗(yàn)為大黃的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1WHO.WHO Monographs on Selected Medicinal Plants M. World Health Organization, Geneva, 1999: 231.2Kuo Ching-Hua, Sun Shao-Wen. Analysis of nine rhubarb anthraquin

17、ones and bianthrones by micellar electrokinetic chromatography using experimental designJ. Anal Chim Acta, 2003, 482: 47.3Singh Narendra P, Gupta Ajai P, Sinha Arun K, et al. High-performance thin layer chromatography method for quantitative determination of four major anthraquinone derivatives in R

18、heum emodiJ.J Chromatogr A, 2005, 1077: 202.4Yang Fuquan, Zhang Tianyou, Tian Guilian, et al. Preparative isolation and purification of hydroxyanthraquinones from Rheum officinale Baill by high-speed counter-current chromatography usingpH-modulated stepwise elutionJ. J Chromatogr A, 1999, 858: 103.5

19、Liu Renmin, Li Aifeng, Sun Ailing. Preparative isolation and purification of hydroxyanthraquinones and cinnamic acid from the Chinese medicinal herb Rheum officinale Baill by high-speed counter-current chromatographyJ. J Chromatogr A, 2004, 1052: 217.6Shang Xiaoyu, Yuan Zhuobin. Determination of six components in Rhubarb by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography using a mixed micellar s