ISO6888食品和動物飼料的微生物學(xué)金黃色葡萄球菌檢驗

1、ISO 6888-1:1999食品和動物飼料的微生物學(xué) 血清凝固酶陽性葡萄球菌（金黃色葡萄球菌和其他球菌）序ISO是國際標(biāo)準(zhǔn)的全球性組織。準(zhǔn)備國際標(biāo)準(zhǔn)這項工作通常由ISO技術(shù)聯(lián)盟來完成。每一個團(tuán)體成員負(fù)責(zé)各自的學(xué)科。與ISO有合作的國際性機(jī)構(gòu)、政府與非政府機(jī)構(gòu)，也有參與這項工作。ISO與國際電子組織（IEC）在電子標(biāo)準(zhǔn)化方面有著密切的合作關(guān)系。國際性標(biāo)準(zhǔn)的起草原則在ISO/IEC 細(xì)則第三部分中有給出。起草的國際性標(biāo)準(zhǔn)被技術(shù)委員會采用是通過全體成員投票決定的。發(fā)布一個國際性標(biāo)準(zhǔn)需要至少75成員投贊成票。國際性標(biāo)準(zhǔn)ISO 6888-1 由ISO/IEC 34技術(shù)委員會（農(nóng)產(chǎn)品，小組委員會SC9，

2、微生物）起草的。ISO 6888-1的第一個版本，以及ISO 6888-2，取代ISO 6888：1983，做了計數(shù)上的修改。ISO 6888由以下部分組成，一般標(biāo)題為食品與動物飼料微生物學(xué)一般方法計數(shù)血漿凝固酶陽性葡萄球菌（金黃色葡萄球菌和其它種類）：第一部分：方法使用BP瓊脂培養(yǎng)基；第二部分：方法使用兔血漿纖維蛋白瓊脂培養(yǎng)基。0. 緒論0.1 由于食品與飼料的種類繁多，這個標(biāo)準(zhǔn)不一定適合某一類產(chǎn)品。在這種情況下，可使用不同的方法，但必須有絕對的技術(shù)上的理由。否則，要盡可能地完全遵循本標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)這個標(biāo)準(zhǔn)下一次回顧時，將會對這個標(biāo)準(zhǔn)的使用做數(shù)據(jù)統(tǒng)計，特殊產(chǎn)品偏離本標(biāo)準(zhǔn)使用也會做相關(guān)統(tǒng)計。同一類產(chǎn)

3、品的檢測方法也有可能不統(tǒng)一，國際性標(biāo)準(zhǔn)和/或國家標(biāo)準(zhǔn)也不一定完全與本標(biāo)準(zhǔn)相符合。希望相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)做回顧時，會遵循本標(biāo)準(zhǔn)做出相關(guān)的修改，以使只有已被證明的技術(shù)上的理由才能與本標(biāo)準(zhǔn)偏離。0.2 ISO 6888描述了兩種平行的方法（第一部分和第二部分）來檢測血漿凝固酶陽性葡萄球菌，其中以證明該菌產(chǎn)生腸毒素。其中較大可能是金黃色葡萄球菌，也有可能是中間鏈球菌或豬葡萄球菌。0.3 ISO 6888本部分的目的在于，葡萄球菌的證實基于血漿凝固酶的陽性反應(yīng)，但也有研究證明一些受損的金黃色葡萄球菌會出現(xiàn)血漿凝固酶弱陽性。這種細(xì)菌可能會和其它種類的細(xì)菌混淆，但它能通過后續(xù)的試驗區(qū)分開來，在本標(biāo)準(zhǔn)中沒有做說明，例如

4、溶葡球菌酶敏感性，產(chǎn)生溶血素、耐熱核酸酶，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸（見參考文獻(xiàn)2）。1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測人類食物或動物飼料產(chǎn)品的血漿凝固酶陽性葡萄球菌的檢測，通過計數(shù)BP平板35或37培養(yǎng)后的菌落數(shù)。2 參考標(biāo)準(zhǔn) 以下標(biāo)準(zhǔn)文件是本標(biāo)準(zhǔn)的參考標(biāo)準(zhǔn)。已過期的文獻(xiàn)，后來改善或修訂的，部分這種文獻(xiàn)已經(jīng)不適用。然而，有大部分學(xué)者正在爭取發(fā)布最新版的文獻(xiàn)如以下列出。對于無限期的文獻(xiàn)，最新版本都是適用的。ISO和IEC成員保存當(dāng)前有效國際性標(biāo)準(zhǔn)的記錄。ISO 6887-1，食物與動物飼料原料微生物學(xué)樣品準(zhǔn)備原則，微生物檢測樣品原液及十倍法稀釋第一部分：樣品原液和十倍法稀釋的指導(dǎo)準(zhǔn)則。ISO 7218，食物與動物飼

5、料原料微生物學(xué)微生物檢驗指導(dǎo)準(zhǔn)則。3 術(shù)語與定義 本標(biāo)準(zhǔn)中使用的相關(guān)術(shù)語與定義如下。3.1 血漿凝固酶樣品葡萄球菌在選擇性平板上的典型和/或不典型菌落，按照本標(biāo)準(zhǔn)操作呈現(xiàn)凝固酵素陽性反應(yīng)。3.2 血漿凝固酶陽性葡萄球菌計數(shù) 按照本標(biāo)準(zhǔn)操作，得出血漿凝固酶陽性葡萄球菌每克或每毫升樣品的含量。4 原理4.1 接種固體選擇性培養(yǎng)基表面，做兩個平行，如果為液體樣品，接種一定體積的樣品，如果是其它類型的樣品，接種一定體積的樣品懸液。在同樣的條件下，接種樣品或樣品懸液的十倍稀釋溶液，每個梯度兩個平行。4.2 在需氧條件下35或37培養(yǎng)，然后24h和48h檢查。4.3 計算每克或每毫升樣品中血漿凝固酶陽性葡

6、萄球菌的數(shù)量，稀釋梯度的選擇和平板上典型與不典型菌落的數(shù)量都有重要的意義，并通過凝固酵素試驗確證。5 稀釋液與培養(yǎng)基5.1 概要正確的實驗室操作，參照ISO 7218。5.2 稀釋液參照ISO 6887-1 和特殊產(chǎn)品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。5.3 BP瓊脂培養(yǎng)基注意：商業(yè)上可買到的培養(yǎng)基可以使用。必須參照廠商的說明書操作。5.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基5.3.1.1 成分胰消化酪蛋白酵母膏肉提取物丙酮酸鹽鈉L糖膠氯化鋰瓊脂水10.0g1.0g5.0g10.0g12.0g5.0g12g22g1000ml5.3.1.2 準(zhǔn)備將所有成分或培養(yǎng)基干粉溶解于水中并煮沸。如需要，調(diào)整pH值至7.2±0.2，在25

7、下。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至適當(dāng)容量的三角瓶中，每瓶100ml。121滅菌15min。5.3.2 配套試劑5.3.2.1 亞碲酸鹽鈉5.3.2.1.1 成分亞碲酸鹽鈉水1.0g100ml5.3.2.1.2 準(zhǔn)備 將亞碲酸鹽鈉充分溶解在水中，最小程度加熱。固體粉末應(yīng)該是易溶的。如果有白色的不溶物出現(xiàn)，丟棄該粉末。過濾0.22µm孔膜滅菌。在3±2保存期不超過1個月。如有白色混濁，丟棄它。5.3.2.2 蛋黃乳狀液注意：如果有商業(yè)的成品，可以使用。使用有完整外殼的新鮮雞蛋。用液體清潔劑將表面刷干凈。在流動水下沖洗干凈。然后在70乙醇中浸泡30s消毒，自然晾干，或者噴射酒精后用火焰滅菌。在

8、無菌環(huán)境下，打開雞蛋并將蛋黃從蛋白中分離出來。將蛋黃放入滅菌三角瓶中，加入四倍體積無菌水。充分混勻。在47水浴鍋中加熱2h，然后在3±2下保存18h24h，使之形成沉淀物。無菌的收集澄清液體至無菌容器中待使用。該乳狀液在3±2下最大保存期為72h。5.3.2.3磺胺二甲嘧啶溶液注意：該溶液僅使用于容易變化的樣品中。5.3.2.3.1 成分磺胺二甲嘧啶氫氧化鈉溶液（0.1mol/l）水0.2g10ml90ml5.3.2.3.2 準(zhǔn)備將磺胺二甲嘧啶溶解在氫氧化鈉溶液中，用水稀釋至100ml。過濾0.22µm孔膜滅菌。在3±2保存期不超過1個月。5.3.3 完

9、全培養(yǎng)基5.3.3.1 成分基礎(chǔ)培養(yǎng)基亞碲酸鈉溶液蛋黃乳狀液將磺胺二甲嘧啶溶液100ml1.0ml5.0ml2.5ml5.3.3.2 準(zhǔn)備融化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，水浴冷卻至47。然后，在無菌條件下，添加亞碲酸鈉溶液和蛋黃乳狀液，如有必要，添加將磺胺二甲嘧啶溶液。每一種溶液都必須水浴預(yù)熱至47。然后充分混勻。5.3.4 準(zhǔn)備瓊脂平板 傾注適當(dāng)量培養(yǎng)基至無菌平皿中，以獲得4mm厚度平板，并凝固。在使用之前，要烘干平板表面水分，可在2550培養(yǎng)箱中烘干。5.4 腦心浸液肉湯5.4.1 成分動物組織消化酶脫水牛腦溶液脫水牛心溶液葡萄糖氯化鈉無水磷酸氫二鈉水10.0g12.5g5.0g2.0g5.0g2.5g1

10、000ml5.4.2 準(zhǔn)備將各成分或脫水干粉培養(yǎng)基于水中，如需要可加熱。調(diào)整pH值至7.2±0.2，在25下。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至適當(dāng)容積的玻璃管中，每管5ml10ml。121滅菌15min。5.5 兔血漿使用商業(yè)成品并根據(jù)廠商說明再水化。如果購買不到成品兔血漿，用三倍體積無菌水稀釋滅菌的新鮮兔血。添加EDTA，使其在溶液中的含量為0.1，如果兔血中含有檸檬酸鉀或檸檬酸鈉。再水化或自制的兔血漿須立即使用。在使用之前，用血漿凝固酶陽性葡萄球菌做陽性質(zhì)控。6 設(shè)備及玻璃器皿一般的微生物實驗室設(shè)備（參照ISO 7218），特別的，增加以下幾項。6.1 干熱滅菌和濕熱滅菌設(shè)備6.2 培養(yǎng)箱，可恒溫

11、35±1或37±16.3 干燥箱或培養(yǎng)箱，可恒溫25±1和50±16.4 水浴鍋，可恒溫47±26.5 試管，三角瓶帶螺帽6.6 滅菌平皿，玻璃或塑料的6.7 接種針和接種環(huán)6.8 移液器，1ml，2ml和10ml，分割分別為0.1ml，0.1ml和0.5ml6.9 滅菌的涂布棒，玻璃或塑料的6.10 pH計7 取樣ISO 6888中并不涉及取樣。如果沒有相關(guān)的國際標(biāo)準(zhǔn)，建議需經(jīng)過多方同意。微生物實驗室接收到的樣品必須是真實代表樣品的，并在運輸和儲藏期間沒有損壞或改變微生物的性狀。8 樣品前處理參照樣品的相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行前處理。如果沒有相關(guān)的國

12、際標(biāo)準(zhǔn)，建議需經(jīng)過多方同意。9 程序9.1 測試部分，樣品原始懸液和稀釋參照ISO 6887-1，相關(guān)細(xì)節(jié)可參考各個樣品的標(biāo)準(zhǔn)。9.2 接種9.2.1如果樣品為液體，各吸取0.1mL樣液至兩個BP平板上，涂布平板，如果樣品為非固體，則吸取1：10稀釋度樣液0.1mL至BP平板上，依次類推，檢測1：100或更多的稀釋度。9.2.2若是樣品的金黃色葡萄球菌限度較低，可吸取1.0mL樣液涂布平板，得到更低檢出結(jié)果。1mL樣液可涂布到一個大的140mm直徑平板，或三個小的90mm平板上。9.2.3小心涂布平板，注意不要涂到平板的邊緣上。涂布完畢，蓋好平板，室溫靜置15min至干燥。9.3 培養(yǎng)35或3

13、7培養(yǎng)，24h和48h觀察結(jié)果。9.4 挑選平板及計數(shù)9.4.1 平板計數(shù)培養(yǎng)24h后，在平板背面標(biāo)識典型菌落。繼續(xù)培養(yǎng)24h，標(biāo)識新長出的典型菌落。（典型菌落為黑色或灰色，光亮凸起，培養(yǎng)24h后，直徑為11.5mm，培養(yǎng)48h后，直徑為1.52.5mm。周圍有部分不透明的渾濁圈。非典型菌落和典型菌落的大小一致，黑色光亮有乳白色邊緣，不帶渾濁圈，或者是灰色菌落。）挑取菌落總數(shù)小于300個，含有15150個典型或非典型菌落的平板計數(shù)。挑取5個菌落做證實試驗（若平板中只有典型菌落，則挑取5個典型菌落；若只有非典型菌落，則挑取5個非典型菌落；若同時存在典型和非典型菌落，則挑取5個典型菌落和5個非典型

14、菌落）。如果最低稀釋度平板上少于15個典型或非典型菌落，可按照9.4.3和10.2估計讀數(shù)。9.4.2若取1mL涂布到三個平板上，計數(shù)三個平板的菌落總數(shù)。9.4.3估計平板的金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)，保留存在典型或非典型菌落的平板，把所有菌落跳出做鑒定試驗。9.5證實試驗將挑選的菌落接種至腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基中，35或37培養(yǎng)24h。在0.3mL的培養(yǎng)液中加入0.1mL兔血漿，35或37培養(yǎng)。培養(yǎng)46h后，傾斜培養(yǎng)管檢查是否凝固。若為陰性反應(yīng)，延長培養(yǎng)時間至24h。10 結(jié)果表達(dá)10.1計算每個平板上金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)，記為abcAc×ccbncAnc+a=×cnc其中A

15、c選取做證實試驗的典型菌落數(shù)；Anc選取做證實試驗的非典型菌落數(shù)；bc血漿凝固酶陽性的典型菌落數(shù)；bnc血漿凝固酶陽性的非典型菌落數(shù)；cc平板上典型菌落總數(shù)；cnc平板上非典型菌落總數(shù)。10.2計算樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)，記為NNaV(n1+0.1n2)d其中a所有平板上陽性菌落的總數(shù)；V每個平板上接種體的體積，mL；n1第一個稀釋度被選用的平板數(shù)；n2第二個稀釋度被選用的平板數(shù)；d第一個稀釋梯度的稀釋度（如10-1）。11 精密度11.1 概述方法的精密度可表現(xiàn)為重復(fù)性和再現(xiàn)性，在ISO 5725-2中有定義。然而，ISO 5725-2中基于這個定義的計算，并不適用于所有微生物分析。因此

16、，本標(biāo)準(zhǔn)也參考ISO 16140，它已將微生物分析獨立開來。這些統(tǒng)計學(xué)的優(yōu)勢在于對極端評估不會過于敏感。這些評估在舊版的ISO 6888中有適用過。在附錄A中有多個實驗室對精密度進(jìn)行實驗的詳情。這項工作得出的結(jié)果不一定適用于所有的產(chǎn)品。精密度的數(shù)據(jù)由食品的三種類型不同程度的污染得出。11.2 重復(fù)性11.2.1 重復(fù)性限度兩個單獨樣品每克或每毫升的血漿凝固酶陽性葡萄球菌菌落數(shù)的log10數(shù)值之間的絕對差別，或者高的結(jié)果與低的結(jié)果之間的比率，通過同一操作人員使用同樣的儀器設(shè)備、同樣的方法、同樣的樣品原料，在盡可能短的時間內(nèi)重復(fù)操作得出，必須不超過重復(fù)性限度的5。11.2.2 全面的值以下給出的數(shù)

17、值能夠作為食品檢測的重復(fù)性限度（r）。這個r值已通過所有的矩陣確認(rèn)過的：r=0.28（表示兩個結(jié)果log10值的絕對差別）；r=0.19（高的結(jié)果與低的結(jié)果之間的比率）對于涉及到的原料（估計含量為5000CFU，見附錄A），以下參考值可使用：r=0.19(表示兩個結(jié)果log10值的絕對差別）；r=1.55（高的結(jié)果與低的結(jié)果之間的比率）例子：第一個結(jié)果為每克樣品中血漿凝固酶陽性葡萄球菌數(shù)為10000或10×104。在重復(fù)的條件下，高的結(jié)果與低的結(jié)果之間的比率必須小于或等于1.9。因此第二個結(jié)果必須在5263（10000/1.9）和19000（10000×1.9）之間。11.

18、3 再現(xiàn)性11.3.1 再現(xiàn)性限度 兩個單獨樣品每克或每毫升的血漿凝固酶陽性葡萄球菌菌落數(shù)的log10數(shù)值之間的絕對差別，或者高的結(jié)果與低的結(jié)果之間的比率，通過同樣的方法和同樣的樣品原料，在不同實驗室、不同人員操作、使用不同的設(shè)備，必須不超過再現(xiàn)性限度（R）的5。11.3.2 全面的值以下給出的數(shù)值能夠作為食品檢測的重復(fù)性限度（R）。這個R值已通過所有的矩陣確認(rèn)過的：R=0.43（表示兩個結(jié)果log10值的絕對差別）；R=2.7（高的結(jié)果與低的結(jié)果之間的比率）對于涉及到的原料（估計含量為5000CFU，見附錄A），以下參考值可使用：r=0.39(表示兩個結(jié)果log10值的絕對差別）；r=2.4（高的結(jié)果與低的結(jié)果之間的比率）例1：第一個實驗室結(jié)果為每克樣品中血漿凝固酶陽性葡萄球菌數(shù)為10000或10×104。在再現(xiàn)性的條件下，第一個實驗室和第二個實驗室的結(jié)果之間的比率必須小于或等于2.7。因此第二個結(jié)果必須在3.7×103（10×104/2.7）和2.7×104（10×104×2.7）之間。例2：如果一個實驗室想要得出最大的限度，可以看出它是遵循預(yù)先設(shè)定的限值的（例如105或5個log10）