WesternBlot實(shí)驗(yàn)步驟及關(guān)鍵分析解析

1、【分享】個(gè)人整理 Western Blot ! ! !1、丙烯酰胺和 N, N-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺) 的去離子水配制含有29%(w/v)內(nèi)稀酰胺和1%(w/v)N , N-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液 丙稀酰胺29g, N, N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶，4c 避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0,因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化 的。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。2、十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS, 1mlH2O去離子水配制， 室溫保存。3、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTr

2、is-HCL(pH8.8):18.15gTris 和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后4保存。4、濃縮膠緩沖液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于40mlH2O 中, 用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后4C保存。 這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化過硫酸俊形成自由基而加速兩種內(nèi)稀 酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。AP提供兩種內(nèi)稀酰胺聚合所必須 的自由基。去離子水配制數(shù) ml,臨用前配

3、制.6. 10%過硫酸俊溶液： 稱取1g過硫酸俊，加超純水溶解并定容至10ml,分 裝到1.5ml微量離心管中，凍存。7、SDS-PAGE加樣緩沖液：在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul, 總蛋白量100卜自8、Tris-甘氨酸電泳緩沖液：30.3gTris, 188g甘氨酸，10gSDS,用蒸儲(chǔ)水溶 解至1000ml,臨用前稀釋10倍。PH8.39、轉(zhuǎn)移緩沖液：2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS(可不加)，200ml 甲醇(臨用前加)，加水至總量1L010、麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅 S 2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g加水 至100ml用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋

4、10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。11、脫脂奶粉5%(w/v)。12、NaN3 0.02%疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。4.2.4 22.聚丙烯酰胺凝膠溶液:分離膠 12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml超純水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml30%丙烯酰月5溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 mlpH8.8、1.5mol/LTris 溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 mlTEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml10%過硫酸錢 0.05ml 0.

5、1 ml 0.15 ml濃縮膠：5% , pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml超純水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml30%丙烯酰月5溶液 0.3 ml 0.6 ml 1.0 mlpH6.8、1.0mol/LTris 溶液 0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml10%SDS 0.02 ml 0.04 ml 0.06 mlTEMED 0.002 ml 0.004 ml 0.006 ml10%過硫酸錢 0.02ml 0.04ml 0.06ml1 .配膠1 .注意一定要將玻璃板洗凈，最后用 ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下 傾斜置于干凈的紙巾晾干。2 .分離膠及濃縮膠均可事先配

6、好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲(chǔ)存液 避光存放于4C,可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的 熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.70.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可 用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用至U 0.3:1000,濃縮膠用0.8: 1000）即可3 .封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度 10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用 0.1%的SDS。封膠后切 記，勿動(dòng)。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及 ddH

7、2O沖洗干 凈，然后加少量0.1%的SDS,目的是通過降低張力消除殘留水滴。4 .灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用 0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正 ；若變形嚴(yán)重，可 在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。 30min后即可上樣，長(zhǎng)時(shí) 間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。2 .樣品處理1 .培養(yǎng)的細(xì)胞(定性)：(1)去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍(冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落)。 對(duì)于6孔板來說每孔加200300屋6080

8、C的IMoading buffer。(3) 100 C, 1min。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min,期間vortex 23次。用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0c后在1400016000g離心2min,再次挑絲。若無團(tuán)塊 也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用 1ml注射器反復(fù)抽吸來降低溶液粘滯 度，便于上樣。(6)待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。2.培養(yǎng)的細(xì)胞(定量)：(1)去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍(冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落)。加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上 1020min。(3)用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在 EP管后超聲(10

9、0200w)3s, 2次。(4) 12000g 離心，4C, 2min。取少量上清進(jìn)行定量。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上 樣最好，剩余溶液(溶于1 loading buffer)可以低溫儲(chǔ)存，-70 C 一個(gè)月，-20 C 周，4 C 12天，每次上樣前98 C , 3min。3.組織：(1)勻漿 對(duì)于心肝脾腎等組織可每50100mg力口 1ml裂解液，肺100200mg 加1ml裂解液?？墒謩?dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。（2） 12000g 離心，4C, 2min。取少量上清進(jìn)行定量。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loa

10、ding buffer后直接上樣 最好，乘你溶液（溶于1 Moading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70C 一個(gè)月，-20C一周， 4c 12天，每次上樣前98C, 3min。3 .電泳1 .上樣前將膠板下的氣泡趕走。2 .所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1 loadingbuffer上樣，Marker也用1 loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。3 .以初始電壓為45V時(shí)的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá) 65V時(shí)改為穩(wěn) 壓電泳。4 .在目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1cm以上結(jié)束。4 .轉(zhuǎn)膜1 .電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準(zhǔn)備：濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris

11、 3.0g , Gly 14.4g , M-OH 200ml ,加去離子水 至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每 50ml加入10%SDS180ul。浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再完全浸 入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。2 .取膠：將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興 趣的蛋白），左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序 鋪上膜與每側(cè)一張（干轉(zhuǎn)每側(cè)三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的 過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)

12、，以防止短路）3 .轉(zhuǎn)股：濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿 上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降 溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA, 4h。注意不同蛋白的要求不同。干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以 1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。負(fù)載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。5 .封閉及雜交1 .封閉：將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與 PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉 液中緩慢搖蕩一小時(shí)。必要時(shí)可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液） 觀察蛋白

13、條帶，再用去離子水和 TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白 marker 則可省略此步。2 .結(jié)合一抗：一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時(shí)每張 3Mcm2膜約需2ml 抗稀釋液。反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將 Western膜從 封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室 溫下輕搖孵育一小時(shí)或4c靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤(rùn)平皿以防止液體 過多蒸發(fā)。3 .洗滌：一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次 5-10min。4 .結(jié)合二抗：根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體， 按相應(yīng)比例稀釋（1:1000

14、1:10000）,室溫輕搖一小時(shí)。5 .洗滌：二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次 5-10min。6 .發(fā)光鑒定一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯 色法。1 .HRP-ECL 發(fā)光法：將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光 強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min ,清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定 Marker,進(jìn)

15、行分析與掃描。2 .AP-NBT/BICP 顯色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個(gè)EP管中, 每張39cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子 水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn) 時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。7 .增強(qiáng)敏感性若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度：1 .用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進(jìn)行曝光，可延長(zhǎng)曝光時(shí)間。2 .將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長(zhǎng)

16、，期間至少換2次液。3 .封閉 4060min4 . 一抗雜交，室溫1h。37 c 1h會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。5 . PBST或TTBS洗膜20min ,期間換2次液。6 .二抗雜交，37 c 1h07 . PBST或TTBS洗膜20min ,期間換2次液。8 .發(fā)光鑒定。9 .若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用 PBST或TTBS洗滌膜20min ,期間 換2次液。10 .三抗雜交，室溫1h。37c 1h會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。三抗即 抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時(shí)三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。11 .PBST或TTBS洗滌膜20min ,期間換2次液。12 .發(fā)光鑒定。八.

17、NC膜的多次使用一張NC膜可使用多次，對(duì)多種蛋白進(jìn)行雜交，步驟與七.增強(qiáng)敏感性”相近。1 .如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置差別較大則只需用 PBST洗滌掉發(fā)光液(10min M次)后從一抗雜交開始，后續(xù)步驟同前。2 .如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置較近則需更強(qiáng)的洗 滌，可用strip液(可用雜交袋)于室溫?fù)u動(dòng)洗滌30min60min ,然后用PBST洗 滌10min刈次，再?gòu)姆忾]開始，后續(xù)步驟同前。3 .對(duì)于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強(qiáng)度 更強(qiáng)的自配的strip液(可用雜交袋)于50 c洗滌30min ,然后用PBST洗滌 10min

18、M次，再?gòu)姆忾]開始，后續(xù)步驟同前。Western的原理幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電 泳凝膠上。變性的多肽與 SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合 SDS的 量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此 SDS多肽復(fù)合物在聚 丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑，借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物，則可測(cè)算出多肽鏈的分 子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩

19、沖系統(tǒng)中進(jìn)行，具電泳槽緩沖液 的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液，當(dāng)兩電極間接通電流后，凝膠中形成移 動(dòng)界面，并帶動(dòng)加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶(或稱積層)。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力， 故大大提高了 SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8),上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分離 膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有 0.1%的SDS(Laemmli,1970), 樣品和積層膠中的氯離干形成移動(dòng)界面的先

20、導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊 界，在移動(dòng)界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動(dòng)樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚，此處 pH值較高，有利于甘氨酸的離子化， 所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動(dòng)。從移動(dòng)界面中解脫后，SDS多肽復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動(dòng)穿過分離膠， 并被篩分而依各自的大小得到分離。電泳丙烯酰胺凝膠電泳通常用來查看蛋白混合物樣品的復(fù)雜程度和監(jiān)測(cè)純 化效果。這種方法分離效果極好，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規(guī)模， 因?yàn)殡S著膠厚度的增加，電泳時(shí)的熱效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重干擾蛋白的泳動(dòng)。Western bloting首先是要將電泳后分離

21、的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖 液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用 重物壓好，緩沖液就會(huì)通過毛細(xì)作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時(shí)會(huì)將蛋白質(zhì)帶 到NC膜上，NC膜可以與蛋白質(zhì)通過疏水作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。但是這種方 法轉(zhuǎn)移效率低，通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中的一小部分蛋白質(zhì)（10%-20%）。而電泳印跡 可以更快速有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)移。這種方法是用有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和 NC膜夾成 三明治”形狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選 擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)在電場(chǎng)力的作用下離開凝膠結(jié)合

22、到NC膜上。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠 /膜疊層浸入緩 沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一 種緩沖液。半干轉(zhuǎn)移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉(zhuǎn)相比，這 種方法要快（15-45分鐘）。轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱為一個(gè)印跡（blot）,用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。印跡首 先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水 結(jié)合位點(diǎn)，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋 白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它

23、的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。 處理過的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理， 二抗是指一抗的抗體，如一抗是從 鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié) 合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。目前有結(jié)合各種標(biāo)記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購(gòu)買，最常用的一種是酶連 的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶催化底物生成 有顏色的產(chǎn)物時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)位置。在酶連抗 體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）。堿

24、性磷酸酶可以 將無色的底物5-澳-4-氯呷咪磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶 可以將H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唾氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?4-氯蔡酚氧化 成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測(cè)辣根過氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過氧 化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾并發(fā)光，通過將印跡放在照 相底片上感光就可以檢測(cè)出辣根過氧化物酶的存在，即目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在了。除了使用抗體或蛋白作為檢測(cè)特定蛋白的探針以外，有時(shí)也使用其它探針如放射性 標(biāo)記的DNA,可以檢測(cè)印跡中的DNA結(jié)合蛋白。在Western bloting實(shí)驗(yàn)中，有另一種方法，就是直接標(biāo)記一抗，再用底物 顯色。

25、這種方法叫直接法，與用二抗的間接法相比有諸多不足， 標(biāo)記二抗可用于 很多種不同特異性的一抗，避免了標(biāo)記很多一抗的需要，同時(shí)因?yàn)橐豢菇Y(jié)合不止 一個(gè)二抗分子，所以二抗可以增強(qiáng)信號(hào)。所以一般情況下都采用間接法進(jìn)行檢測(cè)。Western bloting要注意的一些問題1、為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說服力都要設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)照分為：陽(yáng)性對(duì)照（最好有標(biāo)準(zhǔn)品（比如lactin, GAPDH）或陽(yáng)性血清）;陰性對(duì)照（測(cè)血時(shí)用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對(duì)照（不加一抗，用PBS代替）;無關(guān)對(duì)照（用無關(guān)抗體）2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當(dāng)?shù)谋壤?，一抗二?的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景3、實(shí)驗(yàn)

26、設(shè)計(jì)時(shí)所采用的抗原批次要一樣， 盡量的避免人為的帶來個(gè)體差異。 特別在做裂解液時(shí)更要注意所采用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實(shí)驗(yàn)帶 來不確定性。4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要特別注意幾點(diǎn)：凝膠要均一沒 有氣泡;積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會(huì)導(dǎo)致 膠易脆裂；拔梳子時(shí)要快，盡量保證點(diǎn)樣孔平整。5、電泳、轉(zhuǎn)膜時(shí)特別要注意正負(fù)極，電壓電流都不能過高；轉(zhuǎn)膜時(shí)土明治” 的疊放次序不錯(cuò)，同時(shí)要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在10度以下，冰浴 為宜。6、封閉時(shí)一般在室溫下 2h就夠了，但是要注意如果是生物素標(biāo)記的二抗 就不宜用牛奶，因?yàn)榕Ｄ讨泻猩锼兀?BS

27、A效果更好。7、加一抗二抗要嚴(yán)格保證反應(yīng)時(shí)間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈， 有利于降低背景；容易忽視的問題主要在于過硫酸俊 （AP） 一定要新鮮最好用小指管配 AP（寫日期）保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)打開使用多 次的AP都別用四.上樣電泳：上樣前蛋白樣品最好離心， 上樣量不宜過多，以免看結(jié)果時(shí)，每個(gè) 條帶都彎彎地 笑”你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說明控制電流，不要過多 重復(fù)使用電泳Buffer（別小氣，重復(fù)使用會(huì)降低緩沖能力的）。當(dāng)預(yù)染的Marker 告訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)到達(dá)最佳分辨區(qū) 一一分離膠的2/3處，OK,電泳 結(jié)束了。電泳結(jié)果檢查：如果要做

28、Western Blot ,是否需要先檢查電泳結(jié)果呢？能先 看看結(jié)果如何再進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜當(dāng)然最好?？捡R斯亮藍(lán)使用簡(jiǎn)便快速，可以分辨 1ug左右的條帶，是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋白 PAGE膠電泳染色方法?？墒怯捎诳捡R 斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過固定不可逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的Western Blot實(shí)驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步 一一同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般 也可以說明問題。所以最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法是：麗春紅S,直接染色轉(zhuǎn)移膜，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，充分脫色后不干擾 Western結(jié)果。麗春紅的檢測(cè)靈敏度和考馬斯亮 藍(lán)差不多。轉(zhuǎn)膜：經(jīng)過PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過轉(zhuǎn)股”步驟一一從PAGE膠轉(zhuǎn)移到

29、膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行 Western Blot的檢測(cè)和顯色， 而且為了防止沒有電場(chǎng)的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移要盡快進(jìn)行轉(zhuǎn)膜的首要是選股。Western Blot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes , NC）和PVDF膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做 蛋白印跡。選擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面 積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。┝?不影響后 續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）;c.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其 他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者

30、質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移 膜。NC膜尼龍膜PVDF膜靈敏度和分辨率高高高背景低較高低結(jié)合能力 80-110 ug/cm2 400 ug/cm2 125-200 ug/cm2（ 適合于 SDS 存在 下與蛋白質(zhì)的結(jié)合）材料質(zhì)地干的NC膜易脆軟而結(jié)實(shí)機(jī)械強(qiáng)度高溶劑耐受性無無有操作程序 緩沖液潤(rùn)濕，避免氣泡 緩沖液潤(rùn)濕 使用前100%甲醇潤(rùn)濕檢測(cè)方式 常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測(cè)不能用陰離子染料 常規(guī)染色，比較于NC膜，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用于ECL檢測(cè)，快速免疫檢測(cè)。適用范圍0.45um 一般蛋白0.2um 一分子量小于20kD蛋白0.1um 一分子量小于7kD蛋白 低濃

31、度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋 白多糖（主要用在核酸檢測(cè)中）糖蛋白檢測(cè)和蛋白質(zhì)測(cè)序價(jià)格價(jià)格較便宜便宜較貴1 .硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對(duì)蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能 力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光 （Luminol類）、常規(guī)顯色、 染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡(jiǎn)便，比如不需要甲醛預(yù) 處理，只要在無離子水面浸潤(rùn)排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到 NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間，不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于

32、需要多次重復(fù)清洗的用途 一一因?yàn)榻?jīng) 不起多次折磨”。選擇硝纖膜時(shí)要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的 大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小 于7KD的話最好選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜一一混有含醋 酸纖維（CM）的NC膜結(jié)合力會(huì)有所降低。另外提醒一句：由于 NC膜上結(jié)合的 蛋白會(huì)因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒淮?，因此在封閉時(shí)最好使用較溫和的Tween20,而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果最好）。一般而言，NC膜越純，其蛋白 結(jié)合能力就越高，所以要增加 WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是 個(gè)可以考慮的選擇。如果NC膜攙

33、雜一些醋化纖維素一一這在前面已經(jīng)提到，會(huì) 影響蛋白質(zhì)結(jié)合。Protran由于是純NC膜，比較脆，機(jī)械耐受力欠佳，需要小 心操作，如果擔(dān)心自己 粗手粗腳”，那么就可以考慮一下 Optitran或者Pall公 司的以耐受力著稱的 BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane 。卷膜肯定 是最實(shí)惠的選擇，只不過要自己動(dòng)手裁剪 一一切記，必須帶手套操作。2 . PVDF 膜與硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性 上都更優(yōu)越的性能。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是 80-100閨/cm2,而PVDF 膜結(jié)合量是100-200聞/cm

34、2（而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍!）。但是PVDF 膜最大的優(yōu)點(diǎn)不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測(cè)中成為理想選擇；而且單個(gè)凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的，特別是需要做 N端蛋白測(cè)序，在相當(dāng) 嚴(yán)酷”的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝 纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以 PVDF也是要 做蛋白測(cè)序的唯一選擇。但不適合熒光。 PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇 預(yù)處理（不超過15秒）再用緩沖液平衡，才能用，而且適用過程中萬一干了也要 同樣程序再處理（不過要真出現(xiàn)這種問題也是自己欠扁，誰(shuí)要你不小心呢，轉(zhuǎn)膜 前處理也就罷了，轉(zhuǎn)膜后再這樣處理

35、可能會(huì)影響后繼的抗體識(shí)別呢）。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對(duì)小分子蛋白有較好的攔截吸附， 背景可能會(huì)比前者稍高。卷膜經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，裁剪剩下的邊角料還可以用來做點(diǎn)雜交。再次強(qiáng)調(diào)的是，疏 水PVDF膜在用前必須經(jīng)過50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘， 待膜變成半透明后用純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS-PAGE）A:實(shí)際操作1 .做膠前的準(zhǔn)備1）檢查是否有足夠的、干凈的 spacer、comb和架子。2）檢查是否有新鮮的，足量10%APS ,沒有立刻重配。3）按將要檢測(cè)的抗體對(duì)應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計(jì)算出膠的濃度

36、，并算出分離膠各組分的用量。2 .制膠，電泳1）裝好架子。2）配分離膠，在膠上面加入一層蒸儲(chǔ)水，促進(jìn)膠更好的凝集。3）待分離膠凝集后，配制濃縮膠倒好后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。4）上樣，電泳。 上層膠用60-80V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時(shí)，用100-120V 電壓。電泳時(shí)間在1.5小時(shí)左右。B :注意事項(xiàng)及常遇到的問題1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。2）上樣蛋白量不應(yīng)超過30ug/mm2 （載荷面積：如果你的膠槽是5mm X1mm , 則載荷面為：1mm 5mm=5mm2）。3）gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好，過快表示TEMED、APS用量過多，此時(shí) 膠太硬易

37、龜裂，而且電泳時(shí)容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實(shí) 際不純或失效。4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特 別是甘油。5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底 部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。拖尾：樣品溶解不好。紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過多。五.三、轉(zhuǎn)移在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體 (膜)上。膜的選擇：印跡中常用的固相材料有 NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF 等。

38、我們選用PVDF(聚偏二氟乙烯)，其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及 具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P(0.45um)和 Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。A半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖 液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀つz上，所以其轉(zhuǎn)移條件比 較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時(shí)間短，效率高。1實(shí)驗(yàn)條件的選擇電流1mA-2mA/cm2 ,我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃 度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度 轉(zhuǎn)移時(shí)間80-140 8% 1.5-2.025-80 10

39、 1.515-40 12 0.75=膜=膠。2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。3）因?yàn)槟さ氖杷?，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中?膜也必須隨時(shí)保持濕潤(rùn)4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所 以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。5）轉(zhuǎn)移時(shí)間一般為1.5小時(shí)，（1mA-2mA/cm2 ,10% gel）,可根據(jù)分子量 大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流大小。B轉(zhuǎn)移后效果的鑒定1 .染膠用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉(zhuǎn)移的效 果。2 .染膜有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠?/p>

40、ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析 用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色 后膜就不能用于進(jìn)一步的分析。四、封閉（block）封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合，我們一般用 non-fat milk在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的Milk（TBST溶解）。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入 milk中 block（一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜），并清洗整理好用 過的濾紙，以便下次使用。 Block 4 C O/N,或RT 1小時(shí)。

41、五、孵育一抗A.先將需要檢測(cè)的抗體準(zhǔn)備好，并決定好它們的稀釋度。8 .配好5%的Milk（TBST溶解），按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀 釋，最好采用梯度稀釋。C.將稀釋好的抗體和膜一起孵育。一般采用RT 1小時(shí)，可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短時(shí)間。注意：為了便于后面分析結(jié)果，我們一般會(huì)選用已確定分子量大小而且純度 高的抗體作為marker與一抗同時(shí)孵育。六、洗滌用TBST先快速洗三次，把 milk盡快的wash掉。然后5mins *5。洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺。七、孵育二抗孵育RT1小時(shí)。一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1:5

42、000。二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。注意二抗的選擇有多種，要根據(jù)一抗來選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗八、洗滌用TBST先快速洗三次，把 milk盡快的wash掉。 然后5mins *5。洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深 淺，所以洗滌一定要干凈。九、顯色（HRP酶）9 .增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）Ecl顯色原理：魯米諾在免疫測(cè)定中既可用作標(biāo)記物， 也可用作過氧化物酶 的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用 下，發(fā)出熒光來。試驗(yàn)步驟：1）將兩種顯色底物1: 1等體積混合（一般各1ml/membrane）。2

43、）將混合物覆蓋在膜表面,1-2分鐘,搖晃使均勻。3）用保鮮膜把膜包起來，放入夾板中。4）在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光 1min。5）顯影、定影。6）根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間和曝光區(qū)域，得到最佳結(jié)果。注意：熒光在一段時(shí)間后會(huì)越來越弱。記得全程手套操作，一則避免手印污染影響結(jié)果，二則保護(hù)自己（未交聯(lián)的丙烯酰胺、甲醛等等雖不立即致命但都會(huì)慢慢毒害你的身體）1 .如果WB前沒有可參考的資料比如不知道是否有表達(dá)，比如抗體少 還要摸條件 隔釋度），可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點(diǎn)雜交摸條件，省點(diǎn) 時(shí)間省點(diǎn)試劑；2 .去掉積層膠后，預(yù)染的 Marker可用以識(shí)別膠上下方向和膜的正反面（預(yù)

44、染Marker如果照著說明書用量，有可能在電泳時(shí)看不到條帶，但轉(zhuǎn)膜時(shí)有濃縮 效應(yīng)而且背景白就可以看到了。如果要電泳能看到就要參考電泳的那個(gè)用量，或者多加12倍的量）;如果目標(biāo)蛋白小，指示劑也可以指示方向，但是如果蛋白 大，指示劑已經(jīng)跑出去了，就要留意分清膠上下方向，切個(gè)小角是常用的方法。 膜和濾紙一起裁最好（不過濾紙上下疊多了膜不好剪，硝纖膜容易裂，用利刀十尺 子+墊厚報(bào)紙劃比較容易）盡量和膠一樣大小，膠用純水沖洗一下后用電泳緩沖液 平衡過再量。我自己通常剪的時(shí)候會(huì)故意長(zhǎng)寬各比膠少1mm,保證膜和膠不會(huì)碰到對(duì)方背后的濾紙就好。3 .對(duì)于特別小的蛋白，tricine SDS-PAGE電泳有助于提

45、高蛋白大小在 1KD-20KD間的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的濃度也不用太高（可參考2004 年中國(guó)生物工程雜志上有一篇文章（有效分離1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方 法）4 .轉(zhuǎn)膜前膠要在轉(zhuǎn)移緩沖液里平衡一下防止膠變形，也有助于進(jìn)一步去掉 可能有礙轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì)。還有人在這一步浸泡幫助蛋白復(fù)性， 可以直接在膠上檢測(cè) 蛋白活性。5 .膜漂在水面（或者甲醇液面）讓液體從下通過膜上的孔滲上來以趕走膜內(nèi)空 氣，膜徹底浸潤(rùn)后顏色會(huì)變深一點(diǎn)，任何白點(diǎn)或者斑都是沒有完全浸潤(rùn)的標(biāo)志， 會(huì)影響轉(zhuǎn)膜的。最后浸沒入緩沖液里平衡。甲醇處理PVDF不要超過15秒。以后的步驟中不要讓膜干涸了。6 .電轉(zhuǎn)移緩

46、沖液通常用Tris glycine系統(tǒng)，如果是轉(zhuǎn)膜后有部分樣品要蛋白 測(cè)序，最好用CAPS緩沖液，減少甘氨酸對(duì)測(cè)序的污染。7 .半干電轉(zhuǎn)移（Semi-Dry）用經(jīng)過緩沖液飽和的濾紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)轉(zhuǎn)移槽，非常 節(jié)約試劑，而且效果也好。由于不用 泡”在緩沖液中，半干轉(zhuǎn)不單可用均一緩沖 體系，也可以做非均一轉(zhuǎn)移緩沖體系。半干轉(zhuǎn)可以在30分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)膜（每平方 厘米電流2.53.5mA ,恒流，冷庫(kù)。如果電流要求小可以延長(zhǎng)到 6090分鐘， 但要防止過熱。如果有那種溫度貼，可以貼上參考溫度），即使205KD這么大的 蛋白轉(zhuǎn)膜效率也高達(dá) 80%。各種大小的蛋白的轉(zhuǎn)移效率都 OK。半干轉(zhuǎn)可以上 下層疊2塊膠+膜

47、一起轉(zhuǎn)（面積還是按照單個(gè)計(jì)算），只要控制好單位面積的電流 強(qiáng)度，防止過熱就好了。8 .有人覺得轉(zhuǎn)膜加SDS有助于大分子蛋白轉(zhuǎn)膜，我個(gè)人持保留意見，因?yàn)?SDS等去垢劑影響硝纖膜和蛋白的結(jié)合，反而不好。9 .如果只做Western Blot,膜可以用麗春紅S染色并在脫色前照相，對(duì)后 面的免疫反應(yīng)影響不大。不要用考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑染色膜以免影響結(jié)果。如果有預(yù)染Marker需要用針或者筆扎眼記錄條帶位置，以免后面會(huì)洗掉而無法判 斷結(jié)果。預(yù)染 Marker也有助于判斷轉(zhuǎn)膜的效率和情況，如果比目標(biāo)分子大的 Marker都已經(jīng)轉(zhuǎn)過去了，那就 OK 了。10 .有人說在中性條件下電泳有助于蛋白測(cè)序， 如果

48、要蛋白測(cè)序需要提前一 大倒膠，并說預(yù)電泳6小時(shí)（有還原劑如Glycolate）后再倒積層膠。除了要做HPLC 分析應(yīng)該用麗春紅S而不要用考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑染色，其他的比如測(cè)序或 者PTH都可以選靈敏度高些的考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑。11 .轉(zhuǎn)印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依 稀可以看到透明的蛋白條帶，有時(shí)這種快速的方法可以不用染色識(shí)別條帶，避免染色膜影響后繼實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)膜后的封閉注意：12 .轉(zhuǎn)膜后，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限于封閉做的好不好。 脫脂奶是最常用的經(jīng)濟(jì)配方，用這種封閉劑由 于里面可能有痕量的生物素和堿性磷酸酶，

49、可能造成背景污染而不適合生物素一 親和素的檢測(cè)方法，脫脂奶也不適合堿性磷酸酶檢測(cè)（AP）方法。如果采用堿性磷 酸酶檢測(cè)系統(tǒng)，封閉劑最好用 6%酪蛋白+1%聚乙烯叱咯烷酮+10mmol/L EDTA 磷酸緩沖鹽加熱65度1小時(shí)確保堿性磷酸酶失活（可以加0.05%疊氮化鈉，新鮮 最好）。經(jīng)濟(jì)的脫脂奶配方和 AP兼容得不太好，再加上HRP的底物選擇范圍也 更寬，現(xiàn)在HRP是越來越普遍的選擇。但是疊氮鈉（NaN3）對(duì)辣根過氮化物酶 （HRP）有滅活作用，如果用HRP檢測(cè)系統(tǒng)則封閉液不要加疊氮化鈉為好。切記:封閉時(shí)間和封閉劑的量都要足夠。13.如果選用AP作為顯色方法，封閉時(shí)就要選擇 Tris緩沖體系，

50、不要用 PBS ,因?yàn)镻BS干擾AP。這些小孔的孔徑隨雙丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近 1 : 20時(shí)孔徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按 雙丙烯酰胺丙烯酰胺 為1: 29配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相差只有 3%的蛋白質(zhì)。分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲(chǔ)存液避 光存放于4C,可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的 熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.70.8:100,分離膠濃度越高 AP濃度越低，15%的分離 膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:

51、1000,15%的可用到0.3:1000 ,濃縮 膠用 0.8: 1000）膠濃度10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異 戊醇，也可以用0.1%的SDS）,封膠后切記，勿動(dòng)。如用醇封膠需用大量清水 及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS,目的是通過降低張力消除殘留 水滴。兩膠板之間的電泳液要滿.接好正負(fù)極，開始電泳，可先小電壓，約50V，大 約跑過濃縮膠后再改為100V.觀察MARKER的情況，適時(shí)終止電泳.建議說目的帶要跑到分離膠的2/3處比較好，但本人一直都在上1/3處，結(jié)果 也還可以.如果濃縮膠跑的好的話，幾個(gè)孔的蛋白會(huì)跑成一條直線.注意加樣時(shí)間要盡量

52、短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔 中加入等量的樣品緩沖液I未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù).梳子插入濃縮膠時(shí) 應(yīng)確保沒有氣泡，可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生，梳子拔出來時(shí)應(yīng)該小 心，不要破壞加樣孔，如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避 免針頭刺入膠內(nèi).10*電泳緩沖液：Tris7.58克，甘氨酸36克，SDS 2.5克，ddH2O定容到 250ML.不好溶，可用攪拌器.可重復(fù)使用，每次加一些新的進(jìn)去.但本人每次都是配新的，也不麻煩.轉(zhuǎn)膜:跑完電泳后，取出膠，可以一塊做考馬思亮藍(lán)R250染色約30分鐘，脫色液脫色，看看蛋白條帶跑的如何，上樣

53、量如何.另一塊可用做轉(zhuǎn)膜.放入轉(zhuǎn)移緩沖液中搖30分鐘左右（有次著急只晃了 10 分鐘，結(jié)果也挺好的）。NC膜，0.22um ,效果挺好的，MARKER易染上，麗 春紅也易著色，還一洗就掉。能比較清楚的了解轉(zhuǎn)膜效果。不同轉(zhuǎn)膜儀和電源轉(zhuǎn)膜的條件不同，我用的是 BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)（電壓不 過25V的那款），電源是BIO-RAD的PC200,70KD的我轉(zhuǎn)50分鐘，20V , 17KD 的轉(zhuǎn)20V, 30分鐘左右，條件不是很穩(wěn)定，有時(shí)半路打開蓋子看看MARKER轉(zhuǎn)的情況，但膜和膠的位置一定不能竄。也有人說用恒流，說 1.2-2MA/CM2我 看了一下，我的膠大約都是 5*3左右大的，20V一般電流

54、會(huì)是60-30MA之間， 要是這樣算的話，最高就跑膠 電泳Buffer重復(fù)利用的時(shí)候要注意，不能混濁，有 時(shí)候能用個(gè)3-4次，有時(shí)候第二次都不行了，事先前預(yù)電泳一下，看看氣泡的均 勻度;Buffer 一定要淹過梳子孔，否則就會(huì)發(fā)現(xiàn)今天的蛋白不會(huì)跑 ；跑的時(shí)候先用 低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，不要追求速度，慢慢跑條帶會(huì)分離的 更好，特別是對(duì)于高分子量的目的蛋白；1本實(shí)驗(yàn)室采用的脫脂奶粉已經(jīng)存放了近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質(zhì)量還是難以保證的。所以本人的試驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)了小斑點(diǎn)。 建議最好 使用BSA或?qū)Ｓ玫拿撝谭圻M(jìn)行封閉，雖然貴點(diǎn)，但還是有個(gè)好點(diǎn)的結(jié)果比較 好。2本人采用的

55、是過夜封閉方法，雖然時(shí)間長(zhǎng)，想想封閉效果應(yīng)該是沒有什么 問題，但是一定要注意封閉液是否蓋過了全部的膜， 不要漏掉任何一個(gè)小角落喲。3洗膜的時(shí)候，最好將膜放在平皿中，置于水平的試驗(yàn)桌面上，不時(shí)用手晃 動(dòng)一下平皿，這樣洗膜會(huì)比在脫色搖床上更完全。 因?yàn)樵诿撋珦u床上晃動(dòng)，有時(shí) 洗滌液不足以完全沒過膜，在最后顯色的時(shí)候，會(huì)發(fā)現(xiàn)液體流過的一道道痕跡， 使背景值增加。4其實(shí)在western blot中，以上操作都是小問題，最主要的是一抗的質(zhì)量和 待檢測(cè)蛋白的提取質(zhì)量。在試驗(yàn)之前，最好先用陽(yáng)性對(duì)照與一抗做免疫學(xué)沉淀檢 測(cè)（如ELISA）,看看其效價(jià)和質(zhì)量，以便確定在后來的雜交試驗(yàn)中一抗的選擇和 加量。另外，

56、在做雜交之前最好也先跑一塊PAGE膠，染色，檢測(cè)一下待檢蛋白的提取質(zhì)量。5在加一抗溫育之前，最好先將等量的一抗與野生型 （即陰性對(duì)照）的蛋白在 37攝氏度作用30分鐘，這樣可以封閉掉一抗的一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。6 一定不要忘記做陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照， 特別是陰性對(duì)照，不然結(jié)果出了什 么問題，就無從分析了。7全程做下來，最后的顯色就像是個(gè)一錘定音的時(shí)刻， 分外激動(dòng)，但也應(yīng)該 尤為專注，一旦目的條帶出現(xiàn)了，就要馬上對(duì)顯色進(jìn)行終止，要不然雜帶就要出來了?？焖?gòu)氐琢呀?，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強(qiáng)的裂解液， 甚至直接給loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadingbufferlOO度充分變性，再分裝保存。有些時(shí)候比蛋白酶抑制劑更有效。另一個(gè)感覺是樣品中目的蛋白的量，限于 WB的檢測(cè)下限問題，一般目的 蛋白量最好別低于1ng（雖然ECL法下限是0.1ng,即1OOpg）,最好在10ng以 上為好。這就要求在做 WB之前必須充分考慮目的蛋白的可能豐度，最好充分 的準(zhǔn)備工作然后設(shè)計(jì)細(xì)胞