哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床

1、 哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床Scientific research on asthma: from bench to bedside浙江大學(xué)附屬二院呼吸科浙江大學(xué)附屬二院呼吸科浙江大學(xué)呼吸疾病研究所浙江大學(xué)呼吸疾病研究所 沈華浩沈華浩哮喘最新定義：哮喘最新定義：支氣管哮喘支氣管哮喘( (簡(jiǎn)稱哮喘簡(jiǎn)稱哮喘) )是一種以嗜酸性粒細(xì)胞、是一種以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和肥大細(xì)胞和T T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的氣道淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥。這種炎癥使易感者產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性，慢性炎癥。這種炎癥使易感者產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性的喘息、呼吸困難、胸悶或咳表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)

2、作性的喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間和（或）清晨發(fā)作、加劇，嗽等癥狀，常在夜間和（或）清晨發(fā)作、加劇，常伴有廣泛多變的可逆性氣流受限，多數(shù)患者可常伴有廣泛多變的可逆性氣流受限，多數(shù)患者可自行或經(jīng)治療后緩解。自行或經(jīng)治療后緩解。 哮喘研究的動(dòng)物模型哮喘研究的動(dòng)物模型 Experimental models for asthma 應(yīng)用動(dòng)物模型的價(jià)值應(yīng)用動(dòng)物模型的價(jià)值建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的目的是更好地解釋人類(lèi)建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的目的是更好地解釋人類(lèi)疾病發(fā)病過(guò)程。通過(guò)動(dòng)物模型，我們可以探疾病發(fā)病過(guò)程。通過(guò)動(dòng)物模型，我們可以探討許多難以直接從臨床得到的疾病發(fā)病機(jī)理。討許多難以直接從臨床得到的疾病發(fā)

3、病機(jī)理。盡管各種動(dòng)物模型在體現(xiàn)人類(lèi)疾病上還存在盡管各種動(dòng)物模型在體現(xiàn)人類(lèi)疾病上還存在一定的缺陷，但不可否認(rèn)的是通過(guò)動(dòng)物模型一定的缺陷，但不可否認(rèn)的是通過(guò)動(dòng)物模型所得到的信息，使得我們對(duì)人類(lèi)疾病過(guò)程有所得到的信息，使得我們對(duì)人類(lèi)疾病過(guò)程有了更透徹清晰的認(rèn)識(shí)。了更透徹清晰的認(rèn)識(shí)。 人類(lèi)哮喘的特征人類(lèi)哮喘的特征氣道慢性炎癥：大量炎性細(xì)胞氣道慢性炎癥：大量炎性細(xì)胞 T T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等，它們釋放出嗜酸粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等，它們釋放出LTsLTs、PGsPGs、PAFPAF等炎性介質(zhì)，引起微小血管滲漏、支氣管等炎性介質(zhì)，引起

4、微小血管滲漏、支氣管黏膜水腫、腺體分泌增加、粘液栓形成等病理改變，黏膜水腫、腺體分泌增加、粘液栓形成等病理改變， 氣道高反應(yīng)性（氣道高反應(yīng)性（AHRAHR）：氣道對(duì)特異和非特異刺激的高反）：氣道對(duì)特異和非特異刺激的高反應(yīng)性，應(yīng)性， 如組織胺，乙酰甲膽堿。如組織胺，乙酰甲膽堿。氣道重建氣道重建 ：上皮脫落、上皮下基底膜膠原沉積、平滑?。荷掀っ撀?、上皮下基底膜膠原沉積、平滑肌肥大增殖、粘膜水腫、杯狀細(xì)胞及粘液腺增生分泌亢進(jìn)，肥大增殖、粘膜水腫、杯狀細(xì)胞及粘液腺增生分泌亢進(jìn)，氣道周血管擴(kuò)張，新生血管形成。氣道周血管擴(kuò)張，新生血管形成。 臨床研究哮喘受限制臨床研究哮喘受限制 一、肺組織標(biāo)本獲取不易，具

5、有一定危險(xiǎn)性。并一、肺組織標(biāo)本獲取不易，具有一定危險(xiǎn)性。并且僅能反映疾病發(fā)展中的某一點(diǎn)，不能全程反映且僅能反映疾病發(fā)展中的某一點(diǎn)，不能全程反映疾病過(guò)程。疾病過(guò)程。 二、二、BALFBALF的獲取更需疾病允許，尤其哮喘發(fā)作時(shí)的獲取更需疾病允許，尤其哮喘發(fā)作時(shí)難以獲取，不易將肺的結(jié)構(gòu)（病理）和功能（病難以獲取，不易將肺的結(jié)構(gòu)（病理）和功能（病理生理）結(jié)合起來(lái)。理生理）結(jié)合起來(lái)。 三、要明確參與三、要明確參與LARLAR過(guò)程的抗體類(lèi)型很不容易，過(guò)程的抗體類(lèi)型很不容易，因?yàn)槲覀儾豢赡軐⒛硞€(gè)特異抗原免疫病人而使其因?yàn)槲覀儾豢赡軐⒛硞€(gè)特異抗原免疫病人而使其產(chǎn)生相應(yīng)抗體或?yàn)槠漭斪⒖乖禺愋钥贵w。產(chǎn)生相應(yīng)抗體

6、或?yàn)槠漭斪⒖乖禺愋钥贵w。 四、不能冒著哮喘發(fā)作的危險(xiǎn)來(lái)探索引起哮喘發(fā)四、不能冒著哮喘發(fā)作的危險(xiǎn)來(lái)探索引起哮喘發(fā)作的抗原。作的抗原。 研究哮喘的動(dòng)物研究哮喘的動(dòng)物1 1 生來(lái)具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物：貓、馬。生來(lái)具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物：貓、馬。2 2 抗原激發(fā)前即具有抗原激發(fā)前即具有AHRAHR的動(dòng)物：狗、嚙齒類(lèi)動(dòng)物的動(dòng)物：狗、嚙齒類(lèi)動(dòng)物 。3 3 僅在抗原激發(fā)后方具有可逆性氣流阻塞和僅在抗原激發(fā)后方具有可逆性氣流阻塞和/ /或或AHRAHR的動(dòng)物：兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。的動(dòng)物：兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。 生來(lái)具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物生來(lái)具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物 馬亦存在自發(fā)性反復(fù)發(fā)作的

7、氣流阻塞。這是因?yàn)橹旅魻顟B(tài)的馬馬亦存在自發(fā)性反復(fù)發(fā)作的氣流阻塞。這是因?yàn)橹旅魻顟B(tài)的馬經(jīng)常暴露于含有真菌孢子的干草的緣故。經(jīng)常暴露于含有真菌孢子的干草的緣故。 相同點(diǎn)：相同點(diǎn)：哮喘類(lèi)型哮喘類(lèi)型 與人類(lèi)哮喘相似的特征與人類(lèi)哮喘相似的特征職業(yè)性哮喘職業(yè)性哮喘 暴露于抗原時(shí)癥狀明顯暴露于抗原時(shí)癥狀明顯 脫離抗原環(huán)境、癥狀緩解脫離抗原環(huán)境、癥狀緩解 AHRAHR可因脫離抗原而降低可因脫離抗原而降低變應(yīng)性哮喘變應(yīng)性哮喘 可逆性反復(fù)發(fā)作的氣流阻塞可逆性反復(fù)發(fā)作的氣流阻塞 發(fā)作后可緩解發(fā)作后可緩解 具有明確的過(guò)敏原具有明確的過(guò)敏原抗原激發(fā)誘導(dǎo)可逆性氣流阻塞和抗原激發(fā)誘導(dǎo)可逆性氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性的動(dòng)物氣道高

8、反應(yīng)性的動(dòng)物 兔兔 羊羊 豚鼠豚鼠 大鼠大鼠 小鼠小鼠 激發(fā)抗原的選擇激發(fā)抗原的選擇 1. Protein antigen e.g. OVA, Der p, Bet V2. House dust mite (HDM)3. Fungi e.g. Aspergillus fumigatus (extract or connidia)4. Parasites e.g. Schistosoma mansoni5. Worm e.g. Nippostrongylus brasiliensis6. Chemical compounds e.g. toluenediisocyanate激發(fā)抗原的選擇激發(fā)抗原

9、的選擇 The allergen source should reflect the human situation:1. HDM, pollen and fungi are natural allergens2. inhalation is the natural exposition route 3. extracts or pollen starch granula are better than purified protein, but, high degree of variance豚鼠曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于哮喘研究，直到1985年才首次在豚鼠哮喘模型上描述LAR時(shí)相，之后許多學(xué)者應(yīng)用豚鼠

10、研究了LAR。 Brattard Brattard （19851985）OVA+Al(OH)OVA+Al(OH)2 2致敏豚鼠致敏豚鼠(IP)(IP)，使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生，使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生OVAOVA特異性特異性IgEIgE和和IgG.IgG.在麻醉狀態(tài)下，氣管內(nèi)滴注在麻醉狀態(tài)下，氣管內(nèi)滴注OVAOVA微?？乖旅粑⒘？乖旅? , 6 6小時(shí)后可誘發(fā)出小時(shí)后可誘發(fā)出LARLAR，4848小時(shí)后消失。小時(shí)后消失。該模型中，該模型中，IARIAR時(shí)相產(chǎn)生的肺阻力大于時(shí)相產(chǎn)生的肺阻力大于2424小時(shí)后的小時(shí)后的LARLAR。對(duì)未致敏豚鼠或產(chǎn)生。對(duì)未致敏豚鼠或產(chǎn)生IgGIgG而非而非IgEIgE的致敏豚鼠

11、的致敏豚鼠進(jìn)行攻擊均不能誘發(fā)出進(jìn)行攻擊均不能誘發(fā)出LARsLARs，組織學(xué)表現(xiàn)：以嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的局限性組織學(xué)表現(xiàn)：以嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的局限性細(xì)支氣管炎，平滑肌收縮、粘膜下水腫和氣道粘細(xì)支氣管炎，平滑肌收縮、粘膜下水腫和氣道粘液形成在激發(fā)前液形成在激發(fā)前/ /后應(yīng)用激素可抑制后應(yīng)用激素可抑制LARLAR時(shí)相反應(yīng)，時(shí)相反應(yīng)，但并不能阻斷炎癥細(xì)胞的募集。但并不能阻斷炎癥細(xì)胞的募集。建立豚鼠哮喘模型有多種不同的方法（抗原建立豚鼠哮喘模型有多種不同的方法（抗原種類(lèi)、致敏方式等）、不同的麻醉方法和肺種類(lèi)、致敏方式等）、不同的麻醉方法和肺功能測(cè)定方法；結(jié)果表示也有不同的方法功能測(cè)定方法；結(jié)果表示

12、也有不同的方法（LARLAR出現(xiàn)的時(shí)間、出現(xiàn)的時(shí)間、LARLAR產(chǎn)生的次數(shù)、產(chǎn)生的次數(shù)、LARLAR強(qiáng)強(qiáng)度）。這說(shuō)明即使在同一品系動(dòng)物，應(yīng)用不度）。這說(shuō)明即使在同一品系動(dòng)物，應(yīng)用不同的方法可引起不同程度的氣流阻塞。重要同的方法可引起不同程度的氣流阻塞。重要的是在不同的背后存在相同之處。如在三組的是在不同的背后存在相同之處。如在三組實(shí)驗(yàn)中有兩組證明了在引起實(shí)驗(yàn)中有兩組證明了在引起LARsLARs方面抗原特方面抗原特異性異性IgEIgE比抗原特異性比抗原特異性IgGIgG更為重要。此外，更為重要。此外，所用實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明了所用實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明了EosEos的肺內(nèi)募集與的肺內(nèi)募集與LARLAR存在存在相關(guān)性。

13、相關(guān)性。應(yīng)用應(yīng)用OVAOVA主動(dòng)免疫致敏或應(yīng)用大鼠雜交瘤產(chǎn)生的主動(dòng)免疫致敏或應(yīng)用大鼠雜交瘤產(chǎn)生的 抗二硝基酚抗二硝基酚IgEIgE被動(dòng)免疫致敏。被動(dòng)免疫致敏。氣管內(nèi)給予特異性抗原。氣管內(nèi)給予特異性抗原。 24hr24hr后，后，OVAOVA致敏組致敏組BALBAL中多形核細(xì)胞明顯高于中多形核細(xì)胞明顯高于對(duì)照組，被動(dòng)免疫致敏組（對(duì)照組，被動(dòng)免疫致敏組（IgEIgE致敏組）應(yīng)用抗致敏組）應(yīng)用抗原霧化攻擊原霧化攻擊1 12hr2hr后后BALBAL中的多形核細(xì)胞明顯上中的多形核細(xì)胞明顯上升，升，24hr24hr恢復(fù)正常?；謴?fù)正常。對(duì)對(duì)IgEIgE致敏組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查顯示，攻擊致敏組進(jìn)行組織病理學(xué)

14、檢查顯示，攻擊2h2h后可見(jiàn)肺泡和間質(zhì)水腫，伴有局限性細(xì)支氣管周后可見(jiàn)肺泡和間質(zhì)水腫，伴有局限性細(xì)支氣管周?chē)嘈魏思?xì)胞浸潤(rùn)，炎癥在圍多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥在24hr24hr后消失。另外可后消失。另外可見(jiàn)間質(zhì)內(nèi)單核見(jiàn)間質(zhì)內(nèi)單核/ /巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。無(wú)論是主動(dòng)免疫致敏還是被動(dòng)免疫致敏大鼠，均無(wú)論是主動(dòng)免疫致敏還是被動(dòng)免疫致敏大鼠，均能建立起抗原特異性能建立起抗原特異性IgEIgE依賴的氣道炎癥。依賴的氣道炎癥。小鼠小鼠 小鼠模型已成為研究抗原誘導(dǎo)的氣道反應(yīng)性小鼠模型已成為研究抗原誘導(dǎo)的氣道反應(yīng)性的一個(gè)重要的模型，因?yàn)閷?duì)小鼠免疫系統(tǒng)認(rèn)的一個(gè)重要的模型，因?yàn)閷?duì)小鼠免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)廣泛全面，可以用

15、來(lái)研究識(shí)廣泛全面，可以用來(lái)研究T T細(xì)胞在細(xì)胞在AHRAHR發(fā)生發(fā)生發(fā)展中的作用。發(fā)展中的作用。 小鼠不僅可用常規(guī)方法激發(fā)，也可采用其他小鼠不僅可用常規(guī)方法激發(fā)，也可采用其他更簡(jiǎn)易的方法。如觀察靜脈給予更簡(jiǎn)易的方法。如觀察靜脈給予MCHMCH致氣道致氣道收縮所需濃度。收縮所需濃度。 小鼠小鼠3 3 正?；蚩乖旅舻男∈髿獾揽捎脕?lái)研究電正?；蚩乖旅舻男∈髿獾揽捎脕?lái)研究電刺激后神經(jīng)元介質(zhì)的釋放。如對(duì)某一品系刺激后神經(jīng)元介質(zhì)的釋放。如對(duì)某一品系的小鼠反復(fù)抗原暴露可使氣道對(duì)神經(jīng)刺激的小鼠反復(fù)抗原暴露可使氣道對(duì)神經(jīng)刺激的反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為達(dá)到的反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為達(dá)到5050最大收縮（最大收縮（ESES50

16、50）所需的電刺激頻率明顯降低，其原）所需的電刺激頻率明顯降低，其原因是反復(fù)抗原刺激后神經(jīng)元釋放因是反復(fù)抗原刺激后神經(jīng)元釋放AchAch能力增能力增強(qiáng)。強(qiáng)。 小鼠小鼠最初的小動(dòng)物模型之一采用了最初的小動(dòng)物模型之一采用了BALB/cBALB/c小鼠小鼠, , 動(dòng)物經(jīng)皮給予動(dòng)物經(jīng)皮給予 picryl chloride picryl chloride 致敏，后致敏，后滴鼻給予同一致敏原激發(fā)，于激發(fā)后滴鼻給予同一致敏原激發(fā)，于激發(fā)后2424至至4848小時(shí)可見(jiàn)支氣管周?chē)把苤車(chē)奘杉?xì)胞及小時(shí)可見(jiàn)支氣管周?chē)把苤車(chē)奘杉?xì)胞及淋巴細(xì)胞積聚，同時(shí)伴肺阻力增加，但無(wú)動(dòng)淋巴細(xì)胞積聚，同時(shí)伴肺阻力增加，但無(wú)動(dòng)

17、態(tài)順應(yīng)性改變。態(tài)順應(yīng)性改變。 小鼠小鼠A/JA/J小鼠以綿羊血紅細(xì)胞致敏激發(fā)可致小鼠以綿羊血紅細(xì)胞致敏激發(fā)可致AHRAHR及及明顯的肺明顯的肺EosEos炎癥，而使用抗炎癥，而使用抗CD4CD4單克隆抗體單克隆抗體阻斷阻斷CD4+TCD4+T細(xì)胞后細(xì)胞后AHRAHR及肺及肺EosEos炎癥均被抑制，炎癥均被抑制，可見(jiàn)該模型中氣道功能的改變依賴可見(jiàn)該模型中氣道功能的改變依賴 CD4CD4T T細(xì)胞，而細(xì)胞，而EosEos是該反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。是該反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。有兩種方法證實(shí)此模型存在氣道功能的改變。有兩種方法證實(shí)此模型存在氣道功能的改變。1 1、采用整體體積描記法：經(jīng)靜脈給予濃度依次增、采用整體

18、體積描記法：經(jīng)靜脈給予濃度依次增高的高的MCHMCH后發(fā)現(xiàn)氣流傳導(dǎo)（后發(fā)現(xiàn)氣流傳導(dǎo)（airway conductanceairway conductance）改變，致敏組較非致敏組對(duì)改變，致敏組較非致敏組對(duì)MCHMCH的反應(yīng)性明顯增高。的反應(yīng)性明顯增高。2 2、采用體外測(cè)定法：離體氣道平滑肌給予一定量、采用體外測(cè)定法：離體氣道平滑肌給予一定量的電流刺激，隨著刺激頻率的增加氣道收縮增強(qiáng)，的電流刺激，隨著刺激頻率的增加氣道收縮增強(qiáng)，結(jié)果致敏組小鼠的結(jié)果致敏組小鼠的ESES5050較非致敏小鼠明顯降低，其較非致敏小鼠明顯降低，其機(jī)理可能是電流刺激后致敏小鼠氣道副交感神經(jīng)末機(jī)理可能是電流刺激后致敏小鼠

19、氣道副交感神經(jīng)末梢釋放梢釋放ACHACH較非致敏小鼠多，同時(shí)伴較非致敏小鼠多，同時(shí)伴M M2 2毒蕈堿受體毒蕈堿受體功能喪失。功能喪失。 急性哮喘模型 Protocol Sensitization (i.p. OVA) Challenge (1%OVA ) 1st 2nd 1st 2nd 3rd Days 0 14 24 25 26 28 Analysis (Airways Inflammation) (Lung histology) (Th1/Th2 responses) Advantages of an acute allergic mouse model Similar to human

20、s- Airway hyperresponsivenss- Eosinophylia- Increased IgE- Goblet cell hyperplasia/metaplasia - Mucus hypersecretion- Mucosal Edema Advantages of an acute allergic mouse model Useful for basic research:- Role of eosinophils and CD4+ T-lymphocytes - Adhesion and chemotactic molecules and cell recruit

21、ment - Test conventional pharmacological agents- Transgenic and gene-targeted mouseBALB/cBALB/c和和 C57BL/6JC57BL/6J（B6B6）小鼠）小鼠. .近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因或基因敲除技術(shù)，已培育出數(shù)十種新的小鼠品或基因敲除技術(shù)，已培育出數(shù)十種新的小鼠品系系: : IL-5IL-5轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因:IL-5+/+:IL-5+/+， 如如NJ 1638 NJ 1638 和和 NJ 1720NJ 1720）. . IL-5 IL-5基因敲除（基因

22、敲除（IL-5-/-IL-5-/-）品系）品系. . IL-4-/- IL-4-/- 品系，品系， IFN-a -/- IFN-a -/- 品系，品系， CD4 -/-CD4 -/-、 CD8 -/-CD8 -/-、 T T細(xì)胞細(xì)胞 -/-/-， Eotaxin +/+Eotaxin +/+、 Eotaxin -/-Eotaxin -/-， IL-13 -/-IL-13 -/-，等。等。 特殊類(lèi)型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后特殊類(lèi)型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)比較氣道炎癥反應(yīng)比較 細(xì)胞細(xì)胞/細(xì)胞因子細(xì)胞因子 氣道上皮氣道上皮 氣道粘液氣道粘液 BAL AHR

23、 缺陷缺陷 病理病理 分泌亢進(jìn)分泌亢進(jìn) 嗜酸性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞 （Mch） B cells + + + +T cells (ab, gdb, gd) alphabeta+ T cells gammadelta+T cells + + +/- ?CD4+ cells CD8+ cells + + + +NK-T cells ND ND + NDEosinophils +/- +/- 野生小鼠野生小鼠 + + + + 特殊類(lèi)型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后特殊類(lèi)型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)比較氣道炎癥反應(yīng)比較 細(xì)胞細(xì)胞/細(xì)胞因子細(xì)胞因子 氣道上皮氣道上皮 氣道

24、粘液氣道粘液 BAL AHR 缺陷缺陷 病理病理 分泌亢進(jìn)分泌亢進(jìn) 嗜酸性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞 （Mch） (IL-5-/-) +/- +/- - -IL-4-/- +/- + +IL-13-/- +/- + +/-IFN-r-/- + + + +野生小鼠野生小鼠 + + + + 0 3 6 12 25 50 Methacholine Dose (g/kg)Effects of Huangqi and DXM on airway responsiveness in OVA-sensitized mice. Airway responsiveness was measured at 48h fol

25、lowing last OVA challenge. A The Mean dose response curves to nebulized methacholine (Mch). Airway reactivity (Penh, y-axis) in response to increasing doses of nebulized Mch (x-axis) was assessed by whole-body plethysmography . Data are expredded as the means SEM (n=8-10). * p 0.05 compared with sal

26、ine/saline mice. p 0.05 compared with saline-treated OVA challenged mice. 00.511.522.533.544.5Airway Obstruction (Penh)SalineOVAHuangqi- I.P 28DHuangqi-I.P 14DHuangqi- I.T 14DDXM Disadvantages of an acute allergic mouse model - No asthma spontaneously - No genetic and environmental factors - Airways

27、 insensitive for histamine - Hardly airway remodeling - No eosinophils in airways under basal conditions - Hardly airway remodeling and not a chronic disease 慢性哮喘模型/氣道重構(gòu)模型 Protocol Sensitization (i.p. OVA) Challenge (1%OVA ) Analysis (Airways Inflammation) (Lung histology) (Th1/Th2 responses) Advant

28、ages of a chronic allergic mouse model - Sustained AHR - Sustained inflammation - Smooth muscle & goblet cell hyperplasia - Airway remodeling Disadvantages of a chronic allergic mouse model - Time consuming - Expensive - Need more test-compound - AHR not always related to remodeling Conclusions

29、- The allergic models that should be used in different experiments are determined by the distinct research aims. - In general, a chronic model is in favor of an acutemodel since it mimics better the situation in humans哮喘動(dòng)物模型的局限性哮喘動(dòng)物模型的局限性任何疾病的動(dòng)物模型均有局限性。任何疾病的動(dòng)物模型均有局限性。1 1、不同種系之間存在的差別限制了動(dòng)物模型結(jié)果在人身上的、不同

30、種系之間存在的差別限制了動(dòng)物模型結(jié)果在人身上的應(yīng)用。比如人與動(dòng)物的氣道神經(jīng)支配就存在顯著差別，氣道平應(yīng)用。比如人與動(dòng)物的氣道神經(jīng)支配就存在顯著差別，氣道平滑肌中腎上腺素能神經(jīng)支配很少?；≈心I上腺素能神經(jīng)支配很少。2 2、所有品系均有其局限性。如，研究肺心病易在大動(dòng)物上進(jìn)、所有品系均有其局限性。如，研究肺心病易在大動(dòng)物上進(jìn)行，另一方面，詳細(xì)描述氣道病理又宜在小動(dòng)物身上進(jìn)行，研行，另一方面，詳細(xì)描述氣道病理又宜在小動(dòng)物身上進(jìn)行，研究影響氣道反應(yīng)性的免疫因子采用小鼠較為合適?？傊瑳](méi)有究影響氣道反應(yīng)性的免疫因子采用小鼠較為合適?？傊?，沒(méi)有一種模型可解決碰到的所有問(wèn)題一種模型可解決碰到的所有問(wèn)題 。

31、因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工作者在模。因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工作者在模擬人類(lèi)疾病過(guò)程的時(shí)候應(yīng)考慮到他們實(shí)驗(yàn)的局限性。擬人類(lèi)疾病過(guò)程的時(shí)候應(yīng)考慮到他們實(shí)驗(yàn)的局限性。哮喘動(dòng)物模型的局限性哮喘動(dòng)物模型的局限性3 3、雖然哮喘的病理過(guò)程大致可在動(dòng)物模型上得以體現(xiàn)，但、雖然哮喘的病理過(guò)程大致可在動(dòng)物模型上得以體現(xiàn)，但沒(méi)有一個(gè)可完全體現(xiàn)它的特點(diǎn)。如家兔模型中描寫(xiě)到速發(fā)和沒(méi)有一個(gè)可完全體現(xiàn)它的特點(diǎn)。如家兔模型中描寫(xiě)到速發(fā)和遲發(fā)反應(yīng)，但沒(méi)提到基底膜增厚和平滑肌增生。還有，沒(méi)有遲發(fā)反應(yīng)，但沒(méi)提到基底膜增厚和平滑肌增生。還有，沒(méi)有一個(gè)一個(gè)LARsLARs模型能表現(xiàn)在未受激發(fā)底情況下出現(xiàn)自發(fā)性氣道阻模型能表現(xiàn)在未受激發(fā)底情況下出現(xiàn)自發(fā)性氣

32、道阻塞和哮喘樣綜合癥。馬可以引起馬喘息病，在去除誘發(fā)的環(huán)塞和哮喘樣綜合癥。馬可以引起馬喘息病，在去除誘發(fā)的環(huán)境因素后可恢復(fù)到發(fā)作前水平。但人的哮喘氣道高反應(yīng)性的境因素后可恢復(fù)到發(fā)作前水平。但人的哮喘氣道高反應(yīng)性的存在往往要更長(zhǎng)一些。存在往往要更長(zhǎng)一些。4 4、在絕大多數(shù)的、在絕大多數(shù)的LARsLARs模型中氣道高反應(yīng)性的存在往往時(shí)間模型中氣道高反應(yīng)性的存在往往時(shí)間較短，增高幅度也不大。犬模型有持續(xù)存在的較短，增高幅度也不大。犬模型有持續(xù)存在的AHRAHR，但也沒(méi)，但也沒(méi)提到自然發(fā)生的氣道阻塞。因此，沒(méi)有一個(gè)模型能完全模仿提到自然發(fā)生的氣道阻塞。因此，沒(méi)有一個(gè)模型能完全模仿人的哮喘。人的哮喘。小

33、結(jié)小結(jié) - - 哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的應(yīng)用哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的應(yīng)用一、動(dòng)物模型局限性的存在不表示它不應(yīng)被采用，一、動(dòng)物模型局限性的存在不表示它不應(yīng)被采用，只是提醒我們?cè)谶\(yùn)用動(dòng)物模型時(shí)要考慮到它的局限只是提醒我們?cè)谶\(yùn)用動(dòng)物模型時(shí)要考慮到它的局限性。應(yīng)用動(dòng)物模型研究人類(lèi)疾病有它不可否認(rèn)的作性。應(yīng)用動(dòng)物模型研究人類(lèi)疾病有它不可否認(rèn)的作用。用。二、新的哮喘模型有使用基因突變模型來(lái)研究調(diào)節(jié)二、新的哮喘模型有使用基因突變模型來(lái)研究調(diào)節(jié)氣道反應(yīng)性的遺傳和生化機(jī)制。利用動(dòng)物模型研究氣道反應(yīng)性的遺傳和生化機(jī)制。利用動(dòng)物模型研究氣道反應(yīng)性發(fā)生的正常或者異常的過(guò)程可以進(jìn)一步氣道反應(yīng)性發(fā)生的正?；蛘弋惓５倪^(guò)程可以進(jìn)

34、一步探討出生后環(huán)境因素對(duì)探討出生后環(huán)境因素對(duì)AHRAHR的影響。的影響。小結(jié)小結(jié) - - 哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的應(yīng)用哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的應(yīng)用三、為更好地研究哮喘的免疫病理，一系列的動(dòng)物三、為更好地研究哮喘的免疫病理，一系列的動(dòng)物模型已被采用。許多動(dòng)物（如：家兔、綿羊、豚鼠、模型已被采用。許多動(dòng)物（如：家兔、綿羊、豚鼠、大鼠、猴子、狗、小鼠等）被某一抗原致敏激發(fā)后大鼠、猴子、狗、小鼠等）被某一抗原致敏激發(fā)后出現(xiàn)肺功能改變（出現(xiàn)肺功能改變（IARsIARs、LARsLARs、氣道反應(yīng)性增加）。、氣道反應(yīng)性增加）。四、雖然動(dòng)物模型模仿了人類(lèi)哮喘的很多特點(diǎn)，但四、雖然動(dòng)物模型模仿了人類(lèi)哮喘的很多特點(diǎn)

35、，但沒(méi)有一個(gè)模型能完全具有人類(lèi)哮喘的特征。但在很沒(méi)有一個(gè)模型能完全具有人類(lèi)哮喘的特征。但在很多方面還是可用動(dòng)物模型進(jìn)行研究，包括抗原暴露多方面還是可用動(dòng)物模型進(jìn)行研究，包括抗原暴露后的病理變化，各種免疫球蛋白、炎性細(xì)胞及介質(zhì)后的病理變化，各種免疫球蛋白、炎性細(xì)胞及介質(zhì)對(duì)氣道功能的影響。今后將開(kāi)展包括對(duì)氣道功能的影響。今后將開(kāi)展包括AHRAHR的遺傳學(xué)研的遺傳學(xué)研究、正?；虍惓獾拦δ馨l(fā)生過(guò)程等在內(nèi)的諸多方究、正?；虍惓獾拦δ馨l(fā)生過(guò)程等在內(nèi)的諸多方面的研究。面的研究。 哮喘的臨床研究哮喘的臨床研究一、人類(lèi)哮喘自然病程下的臨床研究一、人類(lèi)哮喘自然病程下的臨床研究 二、過(guò)敏原激發(fā)實(shí)驗(yàn)以模擬人類(lèi)哮喘

36、發(fā)病二、過(guò)敏原激發(fā)實(shí)驗(yàn)以模擬人類(lèi)哮喘發(fā)病的病理生理過(guò)程的病理生理過(guò)程 一、人類(lèi)哮喘自然病程下的臨床研究一、人類(lèi)哮喘自然病程下的臨床研究 哮喘自然史研究（流行病學(xué)調(diào)查）哮喘自然史研究（流行病學(xué)調(diào)查）Risk factors probably associated with infant wheezing Male gender Low birth weight. Environmental tobacco smoke. Virus infections.Incident Physician Diagnosed Asthma in Norrbotten over 3 Years, 1996-99

37、(n=2,100)At RiskRelative Risk MultivariateMale Sex 51%1.1 0.73-1.8 n.s.Family History 24% 2.8 1.8-4.46 3.3 2.7-3.9Birth weight (2.5kg) 4.2% 1.4 0.52-3.8 n.s.Cat at home ever 38% 0.49 0.28-0.83 0.55 -0.2-1.3*Type I allergy 20.6% 4.9 2.9-8.4 5.5 4.9-6.1 Cat 13.4%7.4 4.3-12 - Dog 8.7% 4.1 2.1-7.69 - *

38、Cat was a significant negative factor if Type I allergy was removed from the analysis. Perzanowski, M., et al. AJRCCM 2002.Reduced prevalence of hay fever, atopy and asthma among farmers children. In Switzerland: Braun-Fahrlnder et al Clin Exp Allergy 1999 In Germany: von Ehrenstein et al, Clin Exp

39、Allergy 2000 In Austria: Riedler et al, Clin Exp Allergy 2000 In Finnland: Kilpelainen et al Clin Exp Allergy 2000 In Canada: Ernst et al, Am J Resp Crit Care Med 2000 In Australia: Downs et al, Clin Exp Allergy 2001 European-wide: Leynaert et al,Am J Respir Crit Care Med 2001Results of a home based

40、 environmental intervention among urban children with asthma. Controlled trial of allergen specific avoidance for one year. Plus one year extension. 937 children age 5-11 in seven US cities Intervention Results Fewer symptom days first and second years (p0.001). Significant decline in dust mite and

41、cockroach allergen (p0.001). Reductions in dust mite and cockroach allergens on bedroom floor significantly associated with reduced complications of asthma. Morgan et al 04 New Eng J Med 351:1068 （一）最大呼氣流量（一）最大呼氣流量（PEFPEF）監(jiān)測(cè)）監(jiān)測(cè)（二）支氣管擴(kuò)張劑試驗(yàn)（二）支氣管擴(kuò)張劑試驗(yàn)（三）氣道激發(fā)試驗(yàn)（三）氣道激發(fā)試驗(yàn)（四）（四）無(wú)創(chuàng)性氣道炎癥指標(biāo)監(jiān)測(cè)無(wú)創(chuàng)性氣道炎癥指標(biāo)監(jiān)測(cè) （五）變

42、應(yīng)性指標(biāo)監(jiān)測(cè)：包括血清總（五）變應(yīng)性指標(biāo)監(jiān)測(cè)：包括血清總IgEIgE和特異性和特異性IgEIgE測(cè)定，過(guò)敏原皮膚試驗(yàn)，過(guò)敏原吸入激發(fā)試驗(yàn)測(cè)定，過(guò)敏原皮膚試驗(yàn)，過(guò)敏原吸入激發(fā)試驗(yàn)（六）支氣管粘膜活檢（六）支氣管粘膜活檢 2. 2. 哮喘病情評(píng)估哮喘病情評(píng)估 1 1、血液：嗜酸性粒細(xì)胞（、血液：嗜酸性粒細(xì)胞（EosEos）計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子）計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（蛋白（ECPECP）、嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化酶（）、嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化酶（EPOEPO）、可溶性白細(xì)胞）、可溶性白細(xì)胞介素介素-2-2受體測(cè)定；受體測(cè)定；2 2、尿：嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化酶、尿：嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化酶、9 9 ,11

43、,11b b- -前列腺素前列腺素F F2 2、白細(xì)胞、白細(xì)胞三烯三烯E E4 4；3 3、呼出氣體分析：一氧化氮、一氧化碳、碳?xì)浠衔?；、呼出氣體分析：一氧化氮、一氧化碳、碳?xì)浠衔铮? 4、呼吸冷凝物：過(guò)氧化氫、白三烯代謝物、硝基酪氨酸、呼吸冷凝物：過(guò)氧化氫、白三烯代謝物、硝基酪氨酸5 5、誘導(dǎo)痰：細(xì)胞分類(lèi)尤其、誘導(dǎo)痰：細(xì)胞分類(lèi)尤其EosEos絕對(duì)計(jì)數(shù)、可溶性介質(zhì)（絕對(duì)計(jì)數(shù)、可溶性介質(zhì)（ECPECP， 半胱氨酰白三烯等）半胱氨酰白三烯等）。無(wú)創(chuàng)性氣道炎癥指標(biāo)監(jiān)測(cè) 過(guò)敏原激發(fā)實(shí)驗(yàn)以模擬人類(lèi)哮喘發(fā)病的病理生理過(guò)程過(guò)敏原激發(fā)實(shí)驗(yàn)以模擬人類(lèi)哮喘發(fā)病的病理生理過(guò)程速發(fā)相哮喘反應(yīng)：特異性支氣管激發(fā)試驗(yàn)

44、中吸入變應(yīng)原后數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘出現(xiàn)的支氣管收縮反應(yīng)。可作為研究哮喘急性發(fā)作的模型。遲發(fā)相哮喘反應(yīng)：特異性支氣管激發(fā)試驗(yàn)中吸入變應(yīng)原后數(shù)小時(shí)至24小時(shí)出現(xiàn)的與IgE有關(guān)的哮喘反應(yīng)?？勺鳛檠芯肯獾缆匝装Y的模型。 Allergen-induced increases in IL-5 receptora-subunit expression on bone marrowderived CD34+ cells from asthmatic subjectsThe dual responders,but not the isolated early responders, developed a

45、significant increase in methacholine airway responsiveness 24 h after allergen challenge. Allergen-induced increases in IL-5 receptora-subunit expression on bone marrowderived CD34+ cells from asthmatic subjectsIn DR, but not IER asthmatics, a significant increase in the percent of CD34+ cells expre

46、ssing IL-5Ra was detected when pre-allergen bone marrow samples were compared with 24 h post-allergen aspirates.These data suggest that increased expression of IL-5Ra on CD34+ cells favors eosinophilopoiesis and may thus contribute to the subsequent development of blood and tissue eosinophilia, a ha

47、llmark of allergic inflammation. Sehmi et al. JCI, 1997. Allergen-induced fluctuation in CCR 3 expression on bone marrow CD34+ cells from asthmatic subjectsThe number of bone marrow CD34+CCR3+ cells is significantly increased in DR asthmatics who characteristically develop a late-bronchoconstrictor

48、response, sputum and blood eosinophilia and increased methacholine airway responsiveness 24hr after postallergen inhalation. However, a significantly attenuation in the numbers of CD34+CCR3+ cells was observed in ER asthmatics who do not develop a blood eosinophilia and airway responsiveness after p

49、ostallergen inhalation. Sehmi et al. Immunology, 2003. “IL-5 Story” 根據(jù)基礎(chǔ)研究的結(jié)果可以提出假說(shuō)和指導(dǎo)臨床實(shí)踐。但是動(dòng)物模型和人體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不總是一致的！“IL-5 Story”“Treatment of OVA-challenged animals with anti-IL-5 antibody during the sensitization protocol completely abolished the infiltration of eosinophils into the lung tissue and prevented the development of AHR” Hamelmann E. et al.: Am J Respir Crit Care Med. 1997 and 1999“Monoclonal antibodies directed against IL-5 have been used in at least four studies involving patients with asthma. Those preliminary studies have shown clear