分子生物學(xué)重點知識總結(jié)

1、分子生物學(xué)一、名詞解釋1.ORF 答:ORF是open reading frame的縮寫，即開放閱讀框架。在DNA鏈 上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始，到終止密碼為止的一個連續(xù)編碼 列，叫做一個開放閱讀框架。2 .結(jié)構(gòu)基因答：結(jié)構(gòu)基因(structural genes)可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA,并翻譯成多 肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或催化各種生化反應(yīng)的酶和激素等。3 .斷裂基因答：基因是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，一個基因不僅僅包 括編碼蛋白質(zhì)或RNA的核酸序列，還包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序 列、位于編碼區(qū)5端與3 端的非編碼序列和內(nèi)含子。真核生物 的結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開

2、但又連續(xù)鑲嵌而 成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白 質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因(split gene)。4 .選擇性剪接答：選擇性剪接(也叫可變剪接)是指從一個mRNA前體中通過不同 的剪接方式(選擇不同的剪接位點組合)產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu) 體的過程，而最終的蛋白產(chǎn)物會表現(xiàn)出不同或者是相互拮抗的功能和 結(jié)構(gòu)特性，或者，在相同的細胞中由于表達水平的不同而導(dǎo)致不同的 表型。5 .C值答：基因組的大小通常以其DNA的含量來表示，我們把一種生物體單 倍體基因組DNA的總量成為C值（C value）。6 .生物大分子答：生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達

3、到 上萬或更多的有機分子。常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、 糖類。7 .酚抽提法答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過改良， 以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細胞，經(jīng)蛋白酶 K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后， 根據(jù)不同需要進行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。8 .凝膠過濾層析答：凝膠過濾層析也稱分子排阻層析或分子篩層析，利用凝膠分子篩 對大小、形狀不同的分子進行層析分離，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì) 混合物最有效的方法之一。9 .多重PCR答：多重PCR技術(shù)是在一個反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增出

4、多 個核酸片段，由于每對引物擴增的片段長度不同，可用瓊脂糖凝膠電 泳或毛細管電泳等技術(shù)加以鑒別。10 .熒光域值答：熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光閾值的設(shè)置是基線熒光 信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。11 .退火答：溫度突然降至37-58時，變性的DNA單鏈在堿基互補的基礎(chǔ)上 重新形成氫鍵開始復(fù)性。12 .基因診斷答：基因診斷是通過檢測基因的結(jié)構(gòu)異常或其表達異常，對人體的健 康狀態(tài)和疾病做出診斷的方法。13 .實時熒光定量PCR答：實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利 用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通

5、過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模 板進行定量分析的方法。二、問答題1 .什么是SNP？試述研究SNP的意義。答：真核生物基因組中存在大量的DNA多態(tài)性。DNA多態(tài)性是指DNA 序列發(fā)生變異從而導(dǎo)致的個體間核苷酸序列的差異，主要包括單核苷 酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism ， SNP)和串聯(lián)重 復(fù)序列多態(tài)性(tandem repeats polymorphism)兩類。研究 SNP 的意義：SNP是由基因組DNA上的單個堿基的變異引起的DNA序列多 態(tài)性。據(jù)估計，人類基因組中每1kp就存在一個SNP位點，共有約 300萬個之多，遠多于其它類型的DNA多態(tài)性，是人群中個體差

6、異 最具代表性的DNA多態(tài)性，相當(dāng)一部分還直接或間接與個體的表型 差異、對疾病的易感性或抵抗能力、對藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。SNP被 認為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變。2 .簡要介紹質(zhì)粒并舉例說明其在分子生物學(xué)中的用途。答：質(zhì)粒(plasmid)是一類染色體外具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙 鏈DNA分子，屬染色體外基因組。質(zhì)粒與致病菌的毒力及耐藥性有 關(guān)，又是基因工程的常用載體，因而具有重要的研究和應(yīng)用價值。其在分子生物學(xué)中的用途有：1.質(zhì)粒DNA編碼多種蛋白質(zhì)，有 的與質(zhì)粒自身的復(fù)制和穩(wěn)定性有關(guān)，有的控制宿主細胞的各種性狀， 如各種抗性、代謝能力、致病性、接合轉(zhuǎn)移等。根據(jù)宿主的表型可識 別質(zhì)粒的存在，這

7、一性質(zhì)廣泛應(yīng)用于重組菌的篩選和鑒定。2.質(zhì)粒 的不相容性常用于質(zhì)粒的分類。基因工程中以質(zhì)粒為載體進行基因克 隆也是利用了質(zhì)粒的不相容性原理。3 .請介紹目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的基本技術(shù)流程并簡述其原 理。答：蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要兩條互補的實驗工作流程一一基于凝膠的 工作流程(Gel-based workflow)和基于液相色譜的工作流程(LC-based workflow)。在這兩種流程中，基于凝膠的工作流程是目 前使用的較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的工作流程，通過樣品制備、樣 品標(biāo)記、雙向電泳分離、圖像獲取、圖像分析，到摳點、酶切、點靶 和MALDI-TOF蛋白鑒定等一整套技術(shù)手段下來，如果還

8、加上操作自 動化，研究人員可以很方便的獲得蛋白質(zhì)性質(zhì)數(shù)據(jù)。而基于液相色譜 的工作流程則可以對在雙向電泳中難以分離鑒定的高相對分子量、低 相對分子量、極酸性、極堿性和疏水性強的蛋白質(zhì)進行有效的分離鑒 定。這兩種方法結(jié)合起來可以對復(fù)雜樣品進行預(yù)分離、對低豐度蛋白 進行富集，還可以完成蛋白酶解后多維液相分離(MDLC)。4 .簡述酵母雙雜交技術(shù)的原理及其用途。答：酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi) 蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告 基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋 白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)

9、控 轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的 參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，往往由兩個或兩個以上結(jié)構(gòu)上可以分開， 功能上相互獨立的結(jié)構(gòu)域(domain)構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain， DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，DNA-AD)。這兩個結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有功能，但 不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接 近時，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活 序列(upstream activating sequence， UAS)的下游啟動子，使啟 動子下游基因得到

10、轉(zhuǎn)錄?；诮湍鸽p雜交技術(shù)平臺的特點，它已經(jīng)被應(yīng)用在許多研究工作當(dāng) 中：1.利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能。2.利用酵 母雙雜交在細胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用。3.利用酵母雙雜交 篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響。4.利用 酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖(Genome Protein Linkage Map)。第4章/第8章1 .分子克隆技術(shù)包括哪些基本步驟？答：分子克隆技術(shù)的基本步驟大致包括：目的基因的獲取；載體 的選擇；目的基因與載體連接；重組DNA導(dǎo)入受體細胞；重組 體的篩選等；即分、切、接、轉(zhuǎn)、篩等過程。2 .目的基因和載體連接主要有哪些方法？答：目

11、的基因與載體構(gòu)建成重組體的方法主要有：1).粘性末端DNA 分子的連接2).平末端連接法3).通過同聚尾連接。3 .簡述分子克隆中常用的工具酶及其作用。答：在分子克隆技術(shù)中，常用的工具酶主要有：1.限制性核酸內(nèi)切酶， 它是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶； 2.DNA聚合酶I,它具有3種酶活性：1)5-3聚合酶活性；2)3- 5核酸外切酶活性；3)5-3核酸外切酶活性；3.反轉(zhuǎn)錄酶，其功能 主要有：1)逆轉(zhuǎn)錄作用2)核酸酶H的水解作用3)依賴DNA的DNA聚 合酶作用；4.DNA連接酶，它在DNA重組中的主要功能是催化兩個互 補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5磷酸基團與3

12、羥基形成磷酸 二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的兩條雙鏈DNA片段連接起 來，實現(xiàn)DNA的體外重組；5.堿性磷酸酶，它的作用是催化去除DNA、 RNA或dNTP上的5-磷酸基團；6.末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶，其功 能主要有：1)在載體或目的基因3末端加上互補的同質(zhì)多聚尾，形 成人工粘性末端，便于DNA重組連接。2)用于DNA 3末端的同位素 探針標(biāo)記；7.核酸酶S1,其作用是除去雙鏈DNA的粘性末端以產(chǎn)生 平末端、除去cDNA合成時形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu) 和DNA-RNA分子的雜交情況等。4 .舉例說明載體應(yīng)具備的基本要素。答：載體應(yīng)具備以下特征：1）能自我復(fù)制并具有較高的拷

13、貝數(shù)，并有 適宜的分子量，一般應(yīng) 10 kb； 2）帶有遺傳篩選標(biāo)記；3）有適當(dāng)?shù)?限制酶切位點，便于外源基因的插入和篩選。5 .簡述雙抗生素篩選和藍白斑篩選的原理。答：1.雙抗生素篩選的原理是：因大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性標(biāo) 記的特征（如Ampr、Tetr等），當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無 抗性細菌后，被轉(zhuǎn)化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌 斑，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。2.藍白斑篩選的原理:某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ 基因，該基因含一段編碼B-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸a- 肽的DNA片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細胞所

14、編 碼的缺陷型B -半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)a -互補，形成完整的B -半乳 糖苷酶。該酶能催化指示劑底物X-gal形成藍色菌落。當(dāng)外源基因 插入lacZ基因中MCS,laca-肽基因閱讀框架被破壞，細菌內(nèi)將無 B-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落。6 .有哪些常用的探針標(biāo)記物？答：常用的探針標(biāo)記物有：1.放射性同位素標(biāo)記，常用標(biāo)記探針的 同位素有32P、3H、35S、131I、125I等。2.非放射性標(biāo) 記，常用的非放射標(biāo)記物有辣根過氧化物酶（HRP）、熒光素、生物 素、光敏生物素、地高辛（DIG）等。7 .如何進行探針的標(biāo)記？答：1.放射性同位素標(biāo)記探針的的方法有缺口平移法、隨機引物法、

15、 末端標(biāo)記法和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法等。2.非放射性標(biāo)記核酸探針的方法分 為化學(xué)修飾標(biāo)記法和酶促反應(yīng)標(biāo)記法兩大類：化學(xué)修飾標(biāo)記法是 利用標(biāo)記物分子上的活性基團與探針分子上的某些基團發(fā)生化學(xué)反 應(yīng)，將標(biāo)記物直接或間接結(jié)合到探針分子上?；瘜W(xué)標(biāo)記法具有方法簡 單、成本低、標(biāo)記方法較通用，也是目前較為常用的標(biāo)記方法； 酶 促反應(yīng)標(biāo)記法是將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在單核苷酸分子上，然后利用酶促 反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子摻人到核酸探針分子中。這種標(biāo)記法具有靈 敏度高的優(yōu)點，但其標(biāo)記過程較復(fù)雜、成本較高。8 .影響核酸分子雜交的因素有那些？如何進行雜交條件的優(yōu)化？ 答：影響核酸分子雜交的因素有:雜交方法的選擇、探針的選擇、探 針

16、的濃度、溫度、雜交液的成分、反應(yīng)時間等。核酸分子雜交實驗條件的優(yōu)化有：1.探針的選擇：針對不同的雜交實 驗,選擇不同的核酸探針，在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或 cDNA雙鏈探針。但在檢測靶序列上的單個堿基改變時應(yīng)選用寡核昔 酸探針，在檢測單鏈靶序列時應(yīng)選用與其互補的DNA單鏈探針或 RNA探針。2.探針的標(biāo)記方法，選擇什么標(biāo)記方法視靈敏度和顯示方 法等實驗要求和條件而定。3.探針的濃度：隨探針濃度增加，雜交率 也增加，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。4.雜交最 適溫度，在實驗前必須首先確定雜交溫度。5.雜交反應(yīng)時間，一般雜交反應(yīng)要進行20 h左右。6.洗膜溫度，雜交后的最終

17、洗膜溫度一般 應(yīng)低于Tm值5- 12 進行。7.雜交液的優(yōu)化，通常用于DNA雜交 的標(biāo)準(zhǔn)雜交液為5 X SSC, 1.0%casein , 0.1%十二烷基肌氨酸， 0.02%十二烷基硫酸鈉。但除了以上成分外，必要的時候可以加一些 雜交促進劑。常用的有硫酸葡聚糖，它能促進DNA鏈之間的締合。聚合酶鏈反應(yīng)1、根據(jù)作用原理生物分子的分離純化有那幾類？答：根據(jù)作用原理生物分子的分離純化可分為：（1）根據(jù)分子極性大 小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級沉 淀法等；（2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；（3）根 據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據(jù)分

18、子 帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。2、什么原因易引起DNA降解，該如何解決？答：引起DNA降解的原因有：1）材料不新鮮或反復(fù)凍融2）未很好 抑制內(nèi)源核酸酶的活性3）提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷 4）外源核酸酶污染5）反復(fù)凍融。相應(yīng)的解決方法有：1）盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍 融；液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液2）在提取 內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量 3）細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔4）所有試劑用無菌水配制， 耗材經(jīng)高溫滅菌5）將DNA分裝保存于緩沖液中，避

19、免反復(fù)凍融。3、簡述PCR技術(shù)的基本原理答：PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留復(fù)制，是在模板DNA、引物 和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在反應(yīng) 中混合下列物質(zhì)：模板DNA、四種dNTP （包括dATP、dTTP、dGTP、 dCTP）、引物1、引物2、TaqDNA聚合酶、緩沖液及Mg2+（MgCl2）， 然后經(jīng)下列過程大量擴增靶DNA。基本的反應(yīng)分變性、退火、延伸等 三步完成。4、簡述PCR實驗中常見的問題及其對策。答：1）假陽性，預(yù)防假陽性可采取以下措施：（1）PCR前后工序分 室操作，試劑器材分室存放。（2）凡耐高溫的試劑器材均高壓滅菌。（3）Tip頭、Epp

20、endorf管等最好一次性使用。（4）操作人員必須戴 手套進行操作。（5）試劑小量分裝保存，用前先離心，防止開蓋時液 體濺出。2）非特異性PCR產(chǎn)物，造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因及其預(yù)防 措施有：（1）引物特異性不高，引物用量過多，應(yīng)調(diào)換引物或降低引 物用量。（2）TaqDNA聚合酶質(zhì)量不好或用量偏高，應(yīng)降低酶量或使 用質(zhì)量較好的酶。（3）Mg2+濃度過高，可適當(dāng)調(diào)節(jié)Mg2+濃度。（4） 退火溫度過低，退火及延伸時間偏長，可提高退火溫度，減少退火及 延伸時間，或者采用二溫循環(huán)PCR進行擴增。（5）熱循環(huán)次數(shù)過多， 適當(dāng)增加模板用量，減少循環(huán)次數(shù)。3）假陰性，可考慮以下原因并進行改進：（1）

21、引物設(shè)計是否合理， 有無二級結(jié)構(gòu)形成，尤其是引物3端應(yīng)無發(fā)夾結(jié)構(gòu)。（2）標(biāo)本中是 否有Taq酶抑制劑，Taq酶是否失活。（3）反應(yīng)體系中有無蛋白酶或 核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95以上加熱10分鐘使其 滅活。（4）反應(yīng)體系中是否有較難去除的蛋白質(zhì)抑制PCR系統(tǒng)，用蛋 白酶K重新處理?？色@預(yù)期結(jié)果。（5）循環(huán)溫度，特別是解鏈溫度是 否準(zhǔn)確，退火溫度是否過高。有些PCR儀指示溫度與實際溫度不符， 過高則酶在前幾個循環(huán)中迅速失活，過低則模板變性不徹底。（6）檢 測PCR產(chǎn)物的方法靈敏度不夠，如瓊脂糖凝膠電泳法敏感性較低。（7） 靶序列發(fā)生突變、缺失等。4）引物二聚體，形成原因有：（1）

22、兩個相同的或不同的引物分子之 間有較多的堿基配對，特別是引物3端有互補區(qū)。（2）引物模板比 例太高，可增加模板用量。（3）退火溫度過低。（4）熱循環(huán)次數(shù)過 多。5、簡述實時熒光定量PCR技術(shù)的基本原理？答：在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增 加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過 熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。基因診斷1 .基因診斷常用到的方法有哪些？答：基因診斷常用到的方法有：1）PCR、2）核酸雜交、3）基因芯片、 4）bDNA、5）NASBA、6）測序。

23、2 .TaqMan技術(shù)如何設(shè)計引物和探針？答：1） .TaqMan技術(shù)引物的設(shè)計原則：序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū) 段；避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免 引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；典型的引物18到24個核苷長（引物需 要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可 能性。）；Tm值在55 65, GC含量在40%60%；引物之間的TM相 差避免超過2；引物的3,端避免使用堿基A,引物的3,端避免出 現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基；為避免基因組的擴增，引物設(shè)計 最好能跨兩個外顯子；Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp 150bp；引物末端（最后5個核苷酸）

24、不能有超過2個的G和C。2 ） .TaqMan技術(shù)探針的設(shè)計原則：先選擇好探針，然后設(shè)計引物使 其盡可能的靠近探針；探針長度應(yīng)在15-45bp （最好是20-3060,以 保證結(jié)合特異性；探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)；盡量避開二級結(jié)構(gòu)； Tm值在65-70,通常比引物TM值高5-10 （至少要5）,以確保 在退火過程中探針先于引物與目的片段結(jié)合，GC含量在40% 70%； 探針的5,端應(yīng)避免使用G鳥嘌吟一一因為5G會有淬滅作用，而且 即使是被切割下來還會存在淬滅作用；整條探針中，堿基C的含量要 明顯高于G的含量一一G含量高會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對 的另一條鏈作為探針；為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序 列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計 引物探針。3 .如何對鐮刀形細胞貧血和地中海貧血進行基因診斷？答：1）、鐮狀細胞貧血的基因診斷原理在于它的血紅蛋白中的B珠蛋 白基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致B鏈第6位谷氨酸（密碼子GAG）變?yōu)槔i氨 酸（密碼子GTG）。因此，對鐮刀形細胞貧血的基因診斷方法可有： 1.利用PCR-RFLP的技術(shù)進行診斷：基于A-T的變換，改變了限制 性內(nèi)切酶的位點，