熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)與檢測(cè)

1、綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)與檢測(cè) 一、背景介紹 1 .綠色熒光蛋白1955年，Davenport和Nicol在太平洋海里的一種發(fā)光生物一維多利亞水母(Aequoreavictoria)中發(fā)現(xiàn)并發(fā)表了熒光蛋白的生物發(fā)光現(xiàn)象，但是對(duì)生物發(fā)光現(xiàn)象的機(jī)理并不了解。 1962年，日本科學(xué)家下村修在水母中純化鑒定出了一種能催化化學(xué)發(fā)光的蛋白質(zhì)分子并將 其命名為aequorin , aequorin能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，從而產(chǎn)生出波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)色光(lmax=470nm),但是水母發(fā)出的光是獨(dú)有的綠色，因此水母發(fā)光的蛋白質(zhì)并非aequorin。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)和分離了一個(gè)受紫外線激發(fā)能發(fā)出綠色熒

2、光的蛋白質(zhì)一綠色熒光蛋白(GFP)。1971年，Morin和Hastings提出了 GFP這個(gè)名稱(chēng)。1985到1992年間，科學(xué)家 Douglas Prasher測(cè)定完成了 aequorin和GFP的基因和蛋白質(zhì)序列，并通過(guò)蛋白質(zhì)序列分析和核磁 共振分光術(shù)(NMR spectroscopy)確定了 GFP發(fā)光位點(diǎn)。1994年，美國(guó)科學(xué)家錢(qián)永健開(kāi)始改 造GFP,目前所用的大多數(shù)是錢(qián)永健實(shí)驗(yàn)室改造后的變種，有的熒光更強(qiáng)，有的可激活、變 色。1996年，解析得到了 GFP的晶體結(jié)構(gòu)，它的發(fā)光過(guò)程是也在日后的應(yīng)用中得到了解答。縱觀整個(gè)過(guò)程，從 1961年到1974年，下村修的研究遙遙領(lǐng)先，卻很少有人注

3、意。在 1974 年以后，特別是八十年代后，綠色熒光蛋白的研究得到了廣泛的重視和發(fā)展。綠色熒光蛋白，分子質(zhì)量約為28kDa,由238個(gè)氨基酸構(gòu)成，第 6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，經(jīng)共價(jià)鍵連接而成對(duì)羥苯甲基咪陛烷酮，它可以被光激發(fā)產(chǎn)生熒 光，是主要發(fā)光的位置。 綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個(gè)桶，發(fā)光的基團(tuán)位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一個(gè)裝有色素的“油漆桶”。其發(fā)光團(tuán)的形成不具有物種專(zhuān) 一性，發(fā)出的熒光穩(wěn)定，且不需要依賴(lài)其他基質(zhì)而發(fā)光。GFP的優(yōu)點(diǎn)很多：首先，它本身穩(wěn)定，不需要任何反應(yīng)底物和輔助因子，且無(wú)種屬限制，可在多種生物細(xì)胞中表達(dá)發(fā)出穩(wěn)定熒光，在45

4、0490nm藍(lán)光激發(fā)下，發(fā)光能保持 10min以上。其次，其分子量小，對(duì)目的基因的功能無(wú)任何影響，融合蛋白具有與GFP 一樣的熒光性質(zhì)，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。最后，GFP觀察方便，利用激光掃描共聚焦顯微鏡，甚至普通顯微鏡都可以觀察到活細(xì)胞內(nèi)蛋白的變化、活動(dòng)，用肉眼就可對(duì)辨別細(xì)胞是否表達(dá)及其表達(dá)水平。作為一種新型的報(bào)告基因，綠色熒光蛋白在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用：利用綠色熒光蛋白的特有發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白標(biāo)簽。就是利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與 GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化至合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，而后借助熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活體中標(biāo)記的蛋白質(zhì)。綠色熒光蛋白也可用于大規(guī)模藥物篩選。

5、另外，由于綠色熒光蛋白獨(dú)特的光信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及其在表達(dá)后易被周?chē)瘜W(xué)環(huán)境和蛋白之間的相互作用影響的特性，極適用于成為活細(xì)胞體內(nèi)的光學(xué)感受器。近年來(lái)，由于融合抗體具有發(fā)射熒光和與抗原結(jié)合兩種特性，所以將其用做免疫染色的檢測(cè)試劑，直接用于流式細(xì)胞儀、免疫熒光的標(biāo)記、腫瘤的檢測(cè)等。目前應(yīng)用較多的是 GFP的突變體一增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein ,簡(jiǎn)稱(chēng)EGFP）。EGFP將GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突變成為亮氨酸，從而發(fā)射 出的熒光強(qiáng)度比 GFP大6倍以上。所以，EGFP比GFP更適合作為報(bào)告基因來(lái)研究基因表達(dá)、 調(diào)控、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)在生

6、物體內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等EGFP （720bp）的基因片段：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGG CGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCA AGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGA CCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCC

7、CGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACG GCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAG CTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTAC AACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC CA

8、TCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAG CAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGAT CACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA2 .大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌質(zhì)粒是一類(lèi)獨(dú)立于染色體外自主復(fù)制的雙鏈、閉環(huán)DNA分子，大腸桿菌質(zhì)粒可分為結(jié)合轉(zhuǎn)移型和非結(jié)合轉(zhuǎn)移型兩種，非結(jié)合轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒在通常培養(yǎng)條件下不在宿主間轉(zhuǎn)移，整合到染色體上的頻率也很低，具有遺傳學(xué)上的穩(wěn)定性和安全性。又因其大小一般在2-50kb范圍內(nèi)，

9、適合于制備和重組 DNA的體外操作，因此幾乎所有的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)都 選用非結(jié)合轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒作為運(yùn)載外源基因的載體，這些表達(dá)載體通過(guò)對(duì)天然質(zhì)粒的改造獲 得。理想的大腸桿菌表達(dá)載體要求具有以下特征：（1）穩(wěn)定的遺傳復(fù)制、傳代能力，在無(wú)選擇壓力下能存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。（2）具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記。（3）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控的，抑制時(shí)本底轉(zhuǎn)錄水平較低。（4）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的 mRNA能夠在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止，轉(zhuǎn)錄過(guò)程不影響表達(dá)載體的復(fù)制。（5）具備適用于外源基因插入的酶切位點(diǎn)。復(fù)制子、篩選標(biāo)志、啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)是構(gòu)成表達(dá)載體的最基本元件。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，目前應(yīng)用最

10、廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。一個(gè)完整的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)至少要有表達(dá)載體和宿主菌兩部分構(gòu)成。為了改善表達(dá)系統(tǒng)的性能和對(duì)各類(lèi)外源基因的適應(yīng)能力，表達(dá)系統(tǒng)有時(shí)還需要有特定功能基因的質(zhì)粒或溶源化噬管體參與。到目前為止已經(jīng)成功發(fā)展了許多表達(dá)載體和相應(yīng)的宿主菌。由于大腸桿菌本身的蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工體系相當(dāng)不完善，因此不能對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾加工，這是大腸桿菌系統(tǒng)與其它表達(dá)系統(tǒng)相比存在的一個(gè)比較突出的缺陷。大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)包括：Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)，這是最早建立并得到廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)，它是以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。PL和PR表達(dá)系統(tǒng)，它是以入噬管體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL、PR為核

11、心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱(chēng)為PL和PR表達(dá)系統(tǒng)。T7表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌T7噬管體具有一套專(zhuān)一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱(chēng)為T(mén)7表達(dá)系統(tǒng)。此外還有其他表達(dá)系統(tǒng)，如營(yíng)養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型、pH調(diào)控型等。3 . SDS-PAGE 原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS, SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS,使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分

12、子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠使用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，一般凝膠分為低濃度的成層膠（濃縮膠）和較高濃度的分離膠。

13、 在電泳時(shí)，SDS-多肽復(fù)合物向兩膠界面遷移， 在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層， 極大地濃縮了樣品的體積， 使樣品在分離之前處于同一 起跑線。一般來(lái)說(shuō)，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的 pH范圍，凡是不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對(duì)蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測(cè)定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對(duì)于分子質(zhì)量小于 15kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統(tǒng)，也可以采用 Tris-tricine緩 沖系統(tǒng)。4 .蛋白分離與檢測(cè)蛋白質(zhì)的分離方法很多，依據(jù)分子大小分離的方法包括：透析和超過(guò)濾，透析指利用

14、蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜而與小分子分離；超濾是利用壓力或離心力使小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上而分離。密度梯度離心，蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。凝膠過(guò)濾，即分子排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子最先流出層析柱。根據(jù)溶解度分離的方法包括：鹽溶和鹽析，中性鹽在低濃度時(shí)可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類(lèi)離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強(qiáng)；當(dāng)離子強(qiáng)度增大到足夠高時(shí)，此

15、時(shí)與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀。根據(jù)所帶電荷分離的方法包括：電泳（凈電荷、分子大小、形狀） ，區(qū)帶電泳、聚丙烯 酰氨凝膠電泳（PAGE）、毛細(xì)管電泳離子交換層析。其余的方法還有吸附層析、親和層析、 高效液相層析（HPLC），快速蛋白液相層析（FPL。等。蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法包括：凱氏定氮法，它是樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。雙縮尿法，雙縮月尿 （NH3CONHCONH3 ）是兩個(gè)分子月尿經(jīng)

16、180c左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮月尿與 CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮月尿反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮月尿反應(yīng)。Folin酚試劑法，此法的顯色原理與雙縮月尿方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin -酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin 一酚試劑中的磷鋁酸鹽 一磷鴇酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鋁蘭和鴇蘭的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正

17、比。紫外吸收法，蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙 氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軻雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在 238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。5 . pET28a 質(zhì)粒pET28a質(zhì)粒作為表達(dá)載體,該質(zhì)粒含有弓II啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子,可以使目的基因得到高效表達(dá)。其N(xiāo)端含有Thrombin蛋白酶切位點(diǎn)。Pet28a的抗性是kana抗性，通常所用的表達(dá)菌株是 BL21 （DE3）, BL21 （DE3） Gold等BL21

18、（DE3）系列的宿主菌。pET28a, b, c的差異僅僅存在于多克隆位點(diǎn)處，Pet28a和pET28b , pet28c的載體的區(qū)別是差了一個(gè)核甘酸堿基，目的是便于在進(jìn)行克隆構(gòu)建的時(shí)候調(diào)整氨基酸讀碼框，使得基因都可以克隆到這個(gè)系列目的載體中去。pET28a:5' 測(cè)序引物及序歹U :T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'3'測(cè)序引物序歹U :T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'二.試驗(yàn)流程1 .實(shí)驗(yàn)器材及試劑超低溫冰箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫調(diào)速搖床、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、高速冷凍離心機(jī)、電子天平、水

19、浴鍋、低溫高速離心機(jī)、快速混勻器、EGFP-N3模板、菌株E. coliDH5、E. coli BL21、質(zhì)粒 pET28a、限制性?xún)?nèi)切酶 EcoRI , Hind m、T4 DNA 連接酶、DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒、小提試劑盒、DNA純化試劑盒及IPTG、PCR用試劑、卡那霉素、瓊脂糖及PCR合成引物等、蛋白月東、酵母浸出粉、瓊脂粉等2 .實(shí)驗(yàn)流程（實(shí)驗(yàn)中樣品用量根據(jù)提取的各種載體、質(zhì)粒的濃度相應(yīng)的改變）2.1 堿裂變法提質(zhì)粒2.1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)1）添加適量的抗菌素（Ap: 20 mg/mL母液終濃度50100 ug/mL ）（避免雜菌污染，防止質(zhì)粒的丟失）2）接種（20 mL+Ap 5

20、0 mL+Ap ）3）控制菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)（37c過(guò)夜培養(yǎng)或轉(zhuǎn)接 2 4%菌液至新鮮培養(yǎng)基中，37c繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期）。2.1.2 細(xì)胞裂解提取質(zhì)粒 DNA （4C操作，每100mg菌體量，加入）1）稱(chēng)離心管重 W1 ,加入約1/2離心管的菌液，與另一組同學(xué)配平，6000r/min離心5min。2）棄去上清液，再加入 5ml溶液I ,混勻，6000r/min離心5min ,棄去上清液，稱(chēng)離心管重量為W2 ,計(jì)算菌體量 Wo3） 1.0mL溶液I,充分渦旋震蕩，用溶液I再次配平。4） 2.0mL溶液H,輕柔顛倒混勻，冰浴 3-5min 。5） 1. 5mL溶液出，輕柔顛倒混勻，冰浴 5mi

21、n。6） 12000rpm , 15min ;小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，記錄體積V。7）加入2V冰乙醇，顛倒混勻；-20C,15min。8） 12000rpm , 15min ,棄上清。9）加入5mL70叱醇，12000rpm , 3min ,吸棄上清液。10）重復(fù)乙醇洗滌一次，37c風(fēng)干5-10min 。11）分次加入1mLTE溶液并車(chē)t移到Ep管中，得到質(zhì)粒 DNA粗提物。12）加入 50ulRNase （10mg/ml ）,終濃度為 50ug/ml , 37 c孵育 1-2h。2.1.3質(zhì)粒DNA的純化1） 1ml粗提物均分于兩個(gè) Ep管中，加入等體積 Tris飽和酚，混勻，12000

22、rpm離心5min。2）轉(zhuǎn)移上清 V1至新管，加入 V1的酚/氯仿/異戊醇混合液，混勻，12000rpm離心5min。3）轉(zhuǎn)移上清V2至新管，加入 V2的氯仿/異戊醇溶液，混勻，12000rpm離心5min。4）轉(zhuǎn)移上清 V3至新管，加入1/10V3的3MNaAc溶液（pH=5.2 ），再加入2V4（V4=V3+1/10V3 ） 的冰乙醇，混勻，-20C保存30min。5） 12000rpm 離心 14min ,棄上清。6）加入500ul70%乙醇洗滌，12000rpm 離心2min ,棄上清。7）重復(fù)洗滌一次，吸棄上清液，37c風(fēng)干5min。8）每管加入25ulTE溶解沉淀，合并，得到 50

23、ul純化質(zhì)粒DNA。2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.2.1 EGFP和質(zhì)粒 DNA的酶切加樣順序?yàn)椋篸dH2O-Buffer （緩沖液）-DNA-限制性?xún)?nèi)切酶 Hindm；在不同的1.5ml 無(wú)菌離心管中，按照表 1中I、n組樣量順序加入各組分（將少量的樣品加在管壁上，確 保加樣準(zhǔn)確）。1¥品混勻后，4000rpm離心1min ,將液體集中于管底。酶切后，可以用電泳檢測(cè)一下酶切的效果。表1.限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)體系加樣順序加樣序號(hào)反應(yīng)體系成分InpUC19 （各組）EGFP （商品）體積（Wl）體積（川1ddH2O13.070.0210X M buffer2.010.03DNA4.015.04H

24、indm（ 15U/ d）1.05.020.0100.0 （50+50 ）備注各組1份全班1份2.2.2載體與外源片段的連接取無(wú)菌 1.5mlEP管，加樣順序?yàn)椋篸dH 2O-Buffer-pUC19/Hind m - EGFP /Hind m-T4DNA Ligase（見(jiàn)表二）表2.T4連接酶反應(yīng)體系加樣順序加樣序號(hào)成分體積（口）1ddH2O3.2210X T4 Ligase Buffer1.03pUC19/ Hindm1.54EGFP /Hindm3.55T4DNA Ligase0. 810.02.3重組DNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、鑒定與篩選2.3.1感受態(tài)細(xì)胞的制備（注意冰浴、4 c離心）1 .倒

25、LB平板，劃線活化E.coliDH5 “，培養(yǎng)一段時(shí)間。挑取單菌落接種到5mlLB液體中，37 C 震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物按1%專(zhuān)接至新鮮20mlLB液體，37 C, 220rmp震蕩2-2.5h。2 .取2個(gè)干凈的Ep管（編號(hào)SG-1-1、SG-1-2 ）,各加入上述菌液1.5ml,4000rmp離心5min , 棄上清，再各加入 1.5ml菌液，4000rmp離心5min ,棄上清。3 .利用殘留液體渦旋細(xì)胞，然后加入800 M預(yù)冷的0.1M CaCl2,冰浴懸浮細(xì)胞，隨后4000rmp離心5min ,棄上清。4 .加入100 J冷0.1M CaCl2,輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min ,

26、之后將SG-1-2分裝50 J至SG-1-3 管中。2.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化按表3的序號(hào)順序加樣、操作。表3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟：1一 71234567實(shí)驗(yàn)設(shè)組感受態(tài)細(xì)胞（川管）DNA （日）冰浴熱擊冰浴復(fù)蘇/口加小涂布葉板實(shí)驗(yàn)組100連接物5.010min90s5minLB:0.9ml/管，0.5-1h麥+Ap5042100 42150 42200 42轉(zhuǎn)化對(duì)照50pUC19（自提）1.0麥+Ap5041細(xì)胞對(duì)照50麥+Ap5041麥5041備注預(yù)留一個(gè)空白麥+Ap平板； 共計(jì)：11 （麥+Ap）和1 （麥），倒置于37c恒溫箱中培養(yǎng)16-20h （本實(shí)驗(yàn)兩天后來(lái)觀察結(jié)果）。2.3.3 重組子的篩選與

27、培養(yǎng)1 .觀察幾天前的涂布培養(yǎng)結(jié)果并記錄，著重包括：菌落生長(zhǎng)情況、生長(zhǎng)的菌落的顏色、菌落數(shù)量的多少，并測(cè)量菌落的pH值。2 .從實(shí)驗(yàn)組的2個(gè)50ul的平板中挑出4個(gè)白色單菌落，在事先預(yù)留的空白麥 +Ap平板上分 區(qū)劃線培養(yǎng)。將接好菌的平板放在恒溫培養(yǎng)箱中。2.4 PCR反應(yīng)2.4.1 試劑盒法提質(zhì)粒1 .觀察上次劃線的平板中的菌落是否為白色。用燒好的鐐子夾著無(wú)菌牙簽劃取帶有重組 質(zhì)粒的E.coliDH5a （白色的菌落），將帶有質(zhì)粒的E.coli接種于5ml LB/抗生素培養(yǎng)液中，37 c搖床培養(yǎng)1216個(gè)小時(shí)。2 .取1.05.0ml的菌液，室溫下 10000xg離心1min收集細(xì)菌。3 .

28、倒棄培養(yǎng)基，加入 250ul Solution I/RNase A混合液，漩渦震蕩使細(xì)胞完全懸浮。4 .往重懸混合液中加入 250ul Solution n,輕輕顛倒混勻46次，此操作避免劇烈混勻裂 解液且裂解反應(yīng)不要超過(guò)5min。5 .加入350ul Solution m ,溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。6 .室溫下，皂10000xg離心10min。7 .轉(zhuǎn)移上清液至套有 2ml收集管的HiBind DNA 結(jié)合柱中，室溫下，10000xg離心1min , 倒去收集管中的濾液。8 .把柱子重新裝回收集管，加入 500ul HB Buffer ,按上述條件離心，棄去濾液。9 .把柱子重新裝回

29、收集管，加入 700ul DNA Wash Buffer ,按上述條件離心，棄去濾液。注意：濃縮的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用無(wú)水乙醇稀釋。10 .把柱子重新裝回收集管，10000xg離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)。注意:不要忽略次步一一這對(duì)去除柱子中殘留的乙醇至關(guān)重要。11 .把柱子裝在干凈的 1.5ml離心管上，加入 3050ul Elution Buffer到柱子基質(zhì)中，靜置 12分鐘，10000xg離心1min洗脫出 DNA。2.4.2 PCR 反應(yīng)在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前，可以用凝膠電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒，看一下重組質(zhì)粒的大小，再用PCR擴(kuò)增目的基因。以EGFP片

30、段為模板,設(shè)計(jì)上游引物：5' -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3 '，下游引物： 5' - GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3 '?？梢韵葘⒛０暹m當(dāng)稀釋?zhuān)瑢?shí)驗(yàn)要設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，可根據(jù)需求自主設(shè)計(jì)加入各組分后，分別取模板、上游和下游引物、Taq酶（5u/ul）、dd水、10 x Buffer、dNTP作為PCR反應(yīng)體系（可參照表 4力口），輕彈混勻加入的液體，快速離心集液于管底。將制備好的PCR體系放入PCR機(jī)器中，PCR的反應(yīng)程序如表5。表4. PCR體系的建立編R組分加量（ul）1dd水13.2210XBuffer2.03dNTP (2

31、.5mM each )1.64M13F (10uM)15M13R (10uM)16摸板(1-10ng/ul )1.07Taq 酶(5u/ul )0.2總體積20.0表5. PCR反應(yīng)程序項(xiàng)目溫度時(shí)間坎父性94 C3min變性94 C30s復(fù)性58 C30s延伸72 C60s終延伸72 C10min保存4 C2hr整個(gè)PCR反應(yīng)體系共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%勺瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。2.5重組表達(dá)載體的構(gòu)建2.5.1 EGFP基因和pET28 a表達(dá)載體的限制性酶切處理取上述經(jīng)PCR擴(kuò)增后的目的片段作為PCR反應(yīng)的模板，設(shè)計(jì)引入EcoRI酶切位點(diǎn)的上游引物(5' GGAG / A

32、ATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3 ')和弓 I 入 Hind 出酶切位點(diǎn) 的下游引物(5' CCGA / AGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC3 ' )。PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條 件同2.4.2。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。PCR后的EGFP片段進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下：30L 添加了酶切位點(diǎn)的 EGFP片段、5ul 10 Xbuffer、1ul EcoR I (20 U/L)、1ul Hind m (20 U/L),用無(wú)菌水將反應(yīng)液調(diào)至50 L后，于37c下保溫1 h,然后在65c條件下處理20min進(jìn)行熱失活。另一方面，將pET28a質(zhì)粒載體按上述方法進(jìn)行雙酶切?？梢杂铆傊悄z電泳對(duì)上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。2.5.2 pET28a-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建將上述含酶切位點(diǎn)的 EGFP片段與線性pET28a質(zhì)粒按2： 1比例、在45下C保溫5 min 后，置于冰浴中冷卻，冷