分光光度計的測定優(yōu)秀課件

1、1 紫外-可見吸收光譜朗伯朗伯-比耳定律比耳定律紫外-可見分光光度計分析條件的選擇分析條件的選擇測定方法在醫(yī)學檢驗中的應用2紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) 按所吸收光的波長區(qū)域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。 它是利用物質(zhì)的分子或離子對某一波長范圍的光的吸收作用，對物質(zhì)進行定性定性分析分析、定量分析定量分析及結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析, 所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜。31 與其它光譜分析方法相比，其儀器設(shè)備和儀器設(shè)備和操作都比較簡單，費用少，分析速

2、度快操作都比較簡單，費用少，分析速度快;2 靈敏度高靈敏度高;3 選擇性好選擇性好;4 精密度和準確度較高精密度和準確度較高;5 用途廣泛用途廣泛。 4 1. 物質(zhì)對光的選擇性吸收 物質(zhì)對光光的吸收是選擇性選擇性的，利用被測物質(zhì)對某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，這就是光譜法的基礎(chǔ)光譜法的基礎(chǔ)。5 通過測定被測物質(zhì)對不同波長的光的吸收強度（吸光度），以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得出該物質(zhì)在測定波長范圍的吸收曲線吸收曲線。如圖3-1； 在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長max進行物質(zhì)含量的測定。 67 飽合有機化合物飽合有機化合物的電子躍遷類型為*，n* 躍遷，吸收峰一般出現(xiàn)在真空紫外區(qū)

3、，吸收峰低于200nm，實際應用價值不大。 不飽合機化合物不飽合機化合物的電子躍遷類型為n*，* 躍遷，吸收峰一般大于200nm。 8生色團：是指分子中可以吸收光子而產(chǎn)生電子躍遷的原子基團。人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團或結(jié)構(gòu)系統(tǒng)定義為生色團。見表3-1和3-2。助色團：是指帶有非鍵電子對的基團，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，但是當它們與生色團相連時，會使生色團的吸收峰向長波方向移動，并且增加其吸收強度。見表3-4。9紅移和紫移 在有機化合物中，常常因取代基的變更或溶劑的改變，使其吸收帶的最大吸收波長max發(fā)生移動。向長波

4、方向移動稱為紅移(表3-3)，向短波方向移動稱為紫移。1011鑭系和錒系元素的離子對紫外和可見光的吸收是基于內(nèi)層f電子電子的躍遷而產(chǎn)生的。其紫外可見光譜為一些狹長的特征吸收峰，這些峰幾乎不受金屬離子的配位環(huán)境的影響。 1. f電子躍遷吸收光譜12過渡金屬的電子躍遷類型為d電子電子在不同d軌軌道道間的躍遷，吸收紫外或可見光譜。這些峰強烈受配位環(huán)境的影響。 例如 cu2+以水為配位體，吸收峰在794nm處，而以氨為配位體，吸收峰在663nm處。此類光譜吸收強度弱，較少用于定量分析。2. d電子躍遷吸收光譜133. 電荷遷移光譜 某些分子既是電子給電子給體體，又是電子受體電子受體，當電子受輻射能激發(fā)

5、從給體外層軌道向受體躍遷時，就會產(chǎn)生較強的吸收，這種光譜稱為電荷遷移光譜。如 苯?；〈镌诠庾饔孟碌漠悩?gòu)反應。14 物質(zhì)的吸收光譜與測定條件有密切的關(guān)系。測定條件（溫度、溶劑極性、pH等）不同，吸收光譜的形狀形狀、吸收峰吸收峰的位置、吸收強度吸收強度等都可能發(fā)生變化。1.溫度 在室溫范圍內(nèi)，溫度對吸收光譜的影響不大。 152. 溶劑 注意如下幾點：（1）盡量選用低極性溶劑；（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學和光化學穩(wěn)定性；（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。3. pH值16 紫外-可見吸收光譜除主要可用于物質(zhì)的定量定量分析分析外，還可以用于物質(zhì)的定性分析、純度鑒定、結(jié)

6、構(gòu)分析。1.定性分析172.純度的鑒定 用紫外吸收光譜確定試樣的純度是比較方便的。 如蛋白質(zhì)與核酸的純度分析中，可用A280/A260的比值，鑒定其純度。 183.結(jié)構(gòu)分析 紫外-可見吸收光譜一般不用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結(jié)構(gòu)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)還是有一定價值。例如，某化合物在近紫外區(qū)內(nèi)無吸收，說明該物質(zhì)無共軛結(jié)構(gòu)和芳香結(jié)構(gòu)。19 設(shè)入射光強度為I0，吸收光強度為Ia,透射光強度為 It，反射光強度為Ir，則 I0= Ia+ It+ Ir由于反射光強度基本相同，其影響可相互抵消，上式可簡化為： I0= Ia+ It一、吸光度和透光度一、吸光度和透光度20吸光度吸光度:

7、為透光度倒數(shù)的對數(shù)，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It透光度：透光度：透光度為透過光的強度It與入射光強度I0之比，用T表示： 即 T= It/I021二、朗伯二、朗伯-比爾定律比爾定律朗伯-比爾定律：當一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即 A= cl 式中比例常數(shù)與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。 朗伯-比爾定律是紫外-可見分光光度法的理論基礎(chǔ)。22三、吸光系數(shù)當l以cm，c以g/L為單位，稱為吸光吸光系數(shù)系數(shù)，用 a表示。A= a cla的單位為L/(g.cm)23 當l以cm

8、，c以mol/L為單位，稱為摩爾摩爾吸光系數(shù)吸光系數(shù)，用 表示。 的單位為的單位為L/mol.cm，它表示物質(zhì)的濃度它表示物質(zhì)的濃度為為1mol/L，液層厚度為液層厚度為1cm時，溶液的吸光時，溶液的吸光度度。摩爾吸光系數(shù)24比吸光系數(shù)比吸光系數(shù)是指百分含量為1%， l為1cm時的吸光度值，用 表示。%11cmE%111 . 0cmrEM25四、偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光）入射光為非單色光（3）光程的不一致性。）光程的不一致性。 光源不是點光源，比色皿光徑長度不一致，光學元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。 實際

9、樣品的混濁，加入的保護膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發(fā)射等，均可吸光質(zhì)點的吸光特性變化大。26一、主要部件的性能與作用基本結(jié)構(gòu):光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測器檢測器信號顯示系統(tǒng)信號顯示系統(tǒng) 樣品樣品27 在紫外可見分光光度計中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源熱輻射光源和氣體放電光源 1 光源 熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。28單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準直鏡等部分。 2 單色器 單色器質(zhì)量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡棱鏡和光柵和光柵。29 吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料

10、可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。 3 吸收池 吸收池的種類很多，其光徑可在0.110cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。304 檢測器 檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴，F(xiàn)今使用的分光光度計大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。5 信號顯示系統(tǒng) 常用的信號顯示裝置有直讀檢流計，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動記錄和數(shù)字顯示裝置等。31二、紫外-可見分光光度計的類型 按其光學系統(tǒng)可分為單波長分光光度計和雙波長分光光度計。321.單波長單光束分光光度計 目前國內(nèi)廣泛采用721型分光光度計。具有結(jié)構(gòu)簡單、價格低廉、操作方便、維修也比較容易，適用于常規(guī)分析。 單波長單

11、光束分光光度計還有國產(chǎn)751型、XG-125型、英國SP500型和伯克曼DU-8型等。332.單波長雙光束分光光度計 單波長雙光束分光光度計有國產(chǎn)710型、730型、740型、日立UV-340型等就屬于這種類型。343.雙波長分光光度計雙波長分光光度計的優(yōu)點：是可以在有背景干憂或共存組分吸收干憂的情況下對某組分進行定量測定。國產(chǎn)WFZ800-5型、島津UV-260型、UV-265型等。35三、分光光度計的校正和檢驗1.波長校正2.吸光度校正3.雜散光的檢驗4.穩(wěn)定性的檢驗36 一、 儀器測量條件的選擇 1.適宜的吸光度范圍由朗伯-比爾定律可知： A=lg1/T=cl 微分后得： dlgT=0.

12、4343dT/T= -ldc 或 0.4343T/T= -lc37代入朗伯-比爾定律有： c/c=0.4343T/TlgT要使測定的相對誤差c/c最小最小，求導取極小得出： lgT=-0.4343=A即當A=0.4343時，吸光度測量誤差最小時，吸光度測量誤差最小。 最適宜的測量范圍為0.20.8之間。38 通常是根據(jù)被測組分的吸收光譜，選擇最強吸收帶的最大吸收波長為入射波長。當最強吸收峰的峰形比較尖銳時，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強峰或肩峰進行測定。 2.入射光波長的選擇393 狹縫寬度的選擇 為了選擇合適的狹縫寬度，應以減少狹縫寬度時試樣的吸光度不再增加吸光度不再增加為準。一般來說，

13、狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。40 對多種物質(zhì)進行測定，常利用顯色反應將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸收的物質(zhì)。常見的顯色反應有配位反應、氧化還原反應等。41這些顯色反應，必須滿足以下條件： 4.反應生成物的組成恒定。3. 反應生成的產(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性足夠的穩(wěn)定性，以保證測量過程中溶液的吸光度不變；2反應有較高的選擇性較高的選擇性，即被測組分生成的化合物吸收曲線應與共存物質(zhì)的吸收光譜有明顯的差別；1反應的生成物必須在紫外紫外-可見光區(qū)可見光區(qū)有較較強強的吸光能力吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；421酸度 顯色反應最適宜的酸度范圍可通過實驗來確定：測定某一固定濃度的試樣的吸光度隨酸度

14、的變化，以吸光度為縱坐標，溶液的PH值為橫坐標作圖。3.顯色時間和溫度2.顯色劑的用量43 測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對光的反消除其它成分及吸光池和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差射和吸收帶來的測定誤差。44參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有： 1溶劑參比溶劑參比 試樣簡單、共存其它成分對測定波長吸收弱，只考慮消除溶劑與吸消除溶劑與吸收池收池等因素； 2試樣參比試樣參比 如果試樣基體溶液在測定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時，可按與顯色反應相同的條件處理試樣，只是不加入顯色劑。453試劑參比試劑參比 如果顯色劑或其它試劑在測定波長有吸收，按顯色反應相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。 4. 平行操作參比平行操作參比 用不含被測組分的試樣，在相同的條件下與被測試樣同時進行處理，由此得到平行操作參比溶液。46一、 單組分定量方法 單組分是指樣品溶液中含有一種組分，或者是在混合物溶液中待測組分的吸收峰與其他共有物質(zhì)的吸收峰無重疊。其定量方法包括校準曲線法校準曲線法、標準對比法和吸收系數(shù)法。471 校準曲線法方法：配制一系列