關(guān)于人-鼠嵌合抗體制備的可行性

1、關(guān)于人 - 鼠嵌合抗體制備的可行性1、 概 述人 -鼠嵌合抗體，即抗體的可變區(qū)來自鼠單克隆抗體，而恒定區(qū)則來自人的抗體。它是通過從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因， 與人 Ig 恒定區(qū)基因連接， 插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生。 嵌合抗體既保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力， 又大大減少了鼠源性在人體內(nèi)的免疫原性， 其半衰期明顯延長(zhǎng)， 且在介導(dǎo) CDC 及 ADCC 方面亦明顯增強(qiáng)。2、 市 場(chǎng)分析附表是中國(guó) SFDA 批準(zhǔn)上市和進(jìn)入臨床的治療型單抗藥物抗體名稱廠家靶抗原抗體類型適應(yīng)癥研發(fā)階段Muromonab-CD3強(qiáng)生CD-3鼠源抗移植排斥批準(zhǔn)上市Rituximab羅氏CD-20嵌

2、合B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤批準(zhǔn)上市Trastuzumab羅氏HER-2人源化乳腺癌批準(zhǔn)上市Basiliximab諾華CD-25嵌合抗移植排斥批準(zhǔn)上市Trastuzumab基因泰克HER-2人源化乳腺癌批準(zhǔn)上市OKT3武漢生物制品研究所CD-3鼠源抗移植排斥批準(zhǔn)上市抗人IL-8單克隆抗體乳膏東莞宏遠(yuǎn)逸士生物公司IL-8鼠源銀屑病批準(zhǔn)上市重組人源化抗人表皮因子受體單克隆抗體注射液百泰生物藥業(yè)公司人表皮因子受體人源化上皮源性腫瘤批準(zhǔn)上市碘131I美妥昔單抗注射成都華神集團(tuán)，第四軍醫(yī)大學(xué)鼠源肝癌批準(zhǔn)上市碘131I人鼠嵌合型腫瘤細(xì)胞核單克隆抗體注射液上海美恩生物技術(shù)公司嵌合抗腫瘤批準(zhǔn)上市重組人口型腫瘤壞死因

3、子受體抗體融合蛋白上海中信國(guó)健藥業(yè)公司腫瘤壞死因子人源化銀屑病和強(qiáng)直性脊柱炎批準(zhǔn)上市鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體濟(jì)南天康生物制品公司CD-3鼠源抗移植排斥臨床研究注射用抗腎病綜合癥出血熱病毒單克隆抗體（I型）武漢生物制品所，第四軍醫(yī)大學(xué)鼠源出血熱臨床W期抗人肝癌單抗Hepama 1中科院細(xì)胞所鼠源肝癌臨床研究抗乙型腦炎單抗北京生物制品所，第四軍醫(yī)大學(xué)鼠源乙型腦炎臨床研究注射用重組人口型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白上海美恩生物公司嵌合腫瘤臨床研究11 個(gè)，其中 5 個(gè)是國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品，我國(guó)上市的自行開發(fā)的治療性單抗藥物的有6 個(gè)，處于臨床研究階段的有5 個(gè)（表 6） 。其中，武漢生物

4、制品研究所抗腎移植單抗OKT3 （注射用鼠源性抗人T 淋巴細(xì)胞 CD3 抗原單克隆抗體） ， 也是最早批準(zhǔn)上市的國(guó)內(nèi)自行研制的抗體， 具有免疫抑制作用， 可逆轉(zhuǎn)對(duì)移植器官的排斥反應(yīng)； 由北京百泰生物藥業(yè)有限公司與古巴合作開發(fā)的 I 類癌癥治療新藥 “重組人源化抗人表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體” （商品名：泰欣生）于2005 年 4 月 11 日獲得國(guó)家I 類新藥證書。這是我國(guó)批準(zhǔn)的第一個(gè)人源化單克隆抗體藥物， 它的問世標(biāo)志著我國(guó)在癌癥靶向治療和人源化抗體藥物領(lǐng)域取得重大突破，該藥主要用于治療頭頸部、食管、肺部、乳腺、結(jié)直腸等部位的上皮源性腫瘤；由第四軍醫(yī)大學(xué)、成都華神集團(tuán)股份有限公司聯(lián)合研制的碘

5、131 I 美妥昔單抗注射液（商品名：利卡?。?，于 2005 年 4 月 20 日獲得國(guó)家I 類新藥證書。這是全球第一個(gè)用于治療原發(fā)性肝癌的藥物，也是我國(guó)第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗體類藥物。3、 應(yīng) 用嵌合抗體目前主要用于藥物治療方面， 與鼠抗相比， 嵌合抗體既保留了鼠源可變的高親和性，又具有人Fc 段的多種免疫殺傷功能，從而大大降低了人抗鼠抗體反應(yīng)的發(fā)生幾率，改善了臨床治療效果， 與其它小分子基因工程抗體相比， 嵌合抗體作為完成的抗體分子， 在體內(nèi)半壽期更長(zhǎng)，并具有人Fc 段的多種免疫殺傷功能。4、 技 術(shù)路線從雜交瘤細(xì)胞中提取總 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNAL.擴(kuò)增輕鏈、重鏈的 V區(qū)基因T#

6、J;克隆、測(cè)序分析L 3. U插入含信號(hào)肽及人Ig重鏈、輕鏈C區(qū)基因的真核表達(dá)載體U酶切鑒定、測(cè)序分析二 U 二r 1轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞口二檢測(cè)抗體特異性與人源性U制備腹水生產(chǎn)抗體tJ五、材料與儀器1 .材料大腸桿菌DH& ,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，T-A克隆載體T-Easy Vector,含信號(hào)肽及重鏈、輕鏈恒定區(qū)基因的質(zhì)粒pAc- r-CH3,分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞，真核表達(dá)載體pcDNA3.1 ,小鼠骨髓瘤細(xì)胞 Sp2/0。2 .主要試劑氨茉西林鈉，限制性內(nèi)切酶， T4 DNA連接酶，Taq DNA酶，Trizol RNA提取試劑 盒，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，瓊脂糖，嗅化乙錠 （EB）, dNTP

7、s, DNA Marker , DNA凝膠回 收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒，胎牛血清，無(wú)血清培養(yǎng)液，二甲亞碉 （DMSO）,轉(zhuǎn)染試劑 盒Lipofectamine TM 2000, MTX ,抗原，羊抗人IgG Fc片段-HRP酶標(biāo)抗體。3 .主要儀器低溫高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫?fù)u床，恒溫水浴箱，水平式電泳儀，PCR擴(kuò)增儀，紫外分光光度計(jì)，紫外透射儀，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，潔凈工作臺(tái)，酶標(biāo)儀。六、關(guān)鍵技術(shù)與方法1 .可變區(qū)基因克隆1.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞株約107個(gè)細(xì)胞，按口Trizol RNA提取試劑盒的說明書抽提細(xì)胞的總RNA,再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物

8、備用。1.2 擴(kuò)增輕鏈、重鏈的 V區(qū)基因根據(jù)Orlandi等（1989）設(shè)計(jì)的擴(kuò)增小鼠可變區(qū)基因的引物，以上述擴(kuò)增產(chǎn)物為模 板擴(kuò)增抗體基因的可變區(qū)。回收重鏈VH （約360 bp）、輕鏈VL （約330 bp）片段，插入T-easy載體，各送3份樣品測(cè)序。測(cè)序所得序列在GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分類及同源性分析。兩端加入酶切位點(diǎn)根據(jù)上述PCR產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物，再次進(jìn)行擴(kuò)增，以使抗體可變區(qū) 基因片段具有與載體相吻合的酶切位點(diǎn)，便于插入表達(dá)載體?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物備用。2 .嵌合抗體表達(dá)載體構(gòu)建改造含信號(hào)肽及人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因片段的單克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)含重鏈信號(hào)肽起始位點(diǎn)序列及酶切

9、位點(diǎn)Nhel的上游引物 HLF（KOZAK+4G ,即GCCGCC ATG G）,和含Xho I位點(diǎn)的下游引物 HLR ,以質(zhì)粒pAc- k-CH3為模板， 擴(kuò)增出重鏈信號(hào)肽基因片段；設(shè)計(jì)含Xho I和Kpn I位點(diǎn)上游引物 HCF,和含F(xiàn)urin（RKRR）序列及酶切位點(diǎn) Xba I的下游引物 HCR,以質(zhì)粒pAc-K-CH3為模板，擴(kuò)增 出重鏈恒定區(qū)基因片段片段；用Xho I連接上述片段得到含重鏈信號(hào)肽、MCS及重鏈恒定區(qū)的基因片段。設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn) Apa I的上游引物 LLF,和含EcoR I位點(diǎn)的下游引物 LLR ,以質(zhì) 粒pAc- k-CH3為模板，擴(kuò)增出輕鏈信號(hào)肽基因片段；設(shè)計(jì)含

10、EcoR I和Hind出位點(diǎn)上 游引物L(fēng)CF,和含Pme I的下游引物L(fēng)CR,以質(zhì)粒pAc-電CH3為模板，擴(kuò)增出輕鏈恒 定區(qū)基因片段片段；用EcoR I連接上述片段得到含輕鏈信號(hào)肽、MCS及輕鏈恒定區(qū)的基因片段。構(gòu)建含信號(hào)肽及人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因片段表達(dá)空載體用合成的含酶切位點(diǎn)（Xba I和Apa I ）的2A序列連接上述重、輕鏈，得到含信號(hào)肽及人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因的基因片段 LigC (Leader + Ig Constant)。然后與NheI和Pme I雙酶切過的pcDNA3.1-CA 大片段連接，即得到嵌合抗體真核雙表達(dá)載體pcDNA3.1-CA (chimeric antib

11、ody, CA )。-一辜 -胃口 一圖 一O4X -1 一 XWCO 發(fā)山 一注雷-工Emm-享-8二&口-?-咨Q 一一二U-?.i 一 3二品口 -工舟-MgLJU AS8山 -X菁 一0之 -OS -ctjqx 一萃pcDNA3.1 圖譜插入含鼠源Ig重鏈和輕鏈V區(qū)基因雙酶切表達(dá)載體 pcDNA3.1-CA和純化的VL ,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化目的片段后,連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出 pcDNA3.1-CA-VL 陽(yáng)性克隆，富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。然后，雙酶切表達(dá)載體pcDNA3.1-CA-VL和純化的VH ,分離純化相應(yīng) 的酶切片段，重復(fù)上述步驟，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pcDNA

12、3.1-CA-XX (抗原單詞的首字母)。3 .轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞接種適量Sp2/0細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12 h后用純化的載體pcDNA3.1-CA-XX DNA,采用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染，按試劑盒使用說明書進(jìn)行。設(shè)置空載體和無(wú)載體的細(xì)胞為對(duì)照。轉(zhuǎn)染72 h后，加含MTX的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。2周后將生長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆利用有限稀釋法單克隆化。4 .陽(yáng)性克隆鑒定與篩選以間接法用抗原和酶標(biāo)羊抗人 IgG Fc片段抗體檢測(cè)嵌合抗體的特異性及重組性。以適量抗原包被酶標(biāo)板， 加細(xì)胞培養(yǎng)上清反應(yīng)后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶標(biāo)抗體（經(jīng)鼠Ig吸附過）孵育，顯色后測(cè) A490吸光值。5 .抗體腹水生產(chǎn)腹腔種植轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞，57天后抽取腹水。一只種植雜交瘤細(xì)胞的小鼠有時(shí)可產(chǎn)生 多達(dá)10ml的腹水。報(bào)道稱從腹水中獲得的嵌合抗體產(chǎn)量可達(dá)12 mg/ml。七、時(shí)間及成本預(yù)算表1時(shí)間預(yù)算項(xiàng)目時(shí)間（周）載體構(gòu)建（外包，一次性）8雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)0.5RNA提取與反轉(zhuǎn)錄0.5引物合成1V區(qū)基因擴(kuò)增與克隆2V區(qū)基因測(cè)序1插入表達(dá)載體及鑒定2表達(dá)載體擴(kuò)增與抽提1轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞與篩選3嵌合抗體檢測(cè)與篩選1總計(jì)(First Time )20表2成本預(yù)算項(xiàng)目費(fèi)用（元）感受態(tài)細(xì)胞T-Easy Vect