第八章 魏培海儀器分析高效液相色法課件

1、第八章第八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 高效液相色譜法：高效液相色譜法：以高壓輸出的液體以高壓輸出的液體為流動相的色譜技術(shù)。為流動相的色譜技術(shù)。High Performance Liquid ChromatographHPLC 高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 1. 高壓：對流動相施加高壓，使其迅速地通過色高壓：對流動相施加高壓，使其迅速地通過色譜柱液；譜柱液； 2. 高效：分離效率大高，甚至可實現(xiàn)手性分離；高效：分離效率大高，甚至可實現(xiàn)手性分離； 3. 高靈敏度：采用高靈敏度的檢測器高靈敏度：采用高靈敏度的檢測器; 4. 速度快：與經(jīng)典液相色譜法相比，高效液相色速度快：與經(jīng)典液相

2、色譜法相比，高效液相色譜法所需的分析時間較少，一般少于譜法所需的分析時間較少，一般少于 1h ； 5. 應用范圍更廣。應用范圍更廣。HPLC與經(jīng)典與經(jīng)典LC的比較的比較經(jīng)典液相色譜經(jīng)典液相色譜高效液相色譜高效液相色譜 常壓或減壓常壓或減壓 填料顆粒填料顆粒 柱效低柱效低 分析速度慢分析速度慢 色譜柱只用一次色譜柱只用一次 不能在線檢測不能在線檢測 高壓，高壓，1535MPa 填料顆粒小，填料顆粒小，250m 柱效高柱效高, n30000塊塊/m 分析速度快分析速度快 色譜柱可重復多次使用色譜柱可重復多次使用 能在線檢測能在線檢測相同點：具分離和分析功能，均可以在線檢測。相同點：具分離和分析功能

3、，均可以在線檢測。 不同點：不同點： 分析對象分析對象GC： 適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點較低的樣品，適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點較低的樣品，不適于高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及不適于高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品。高聚物的樣品。占有機物的占有機物的20%。HPLC：不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，：不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制， 適于適于溶解后能制成溶液的樣品；分子量大、溶解后能制成溶液的樣品；分子量大、 難氣化、熱難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品。穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品。 占有機物的占有機物的80%以上以上。流動相流動相GC：流動相為惰性氣體，如：

4、流動相為惰性氣體，如H2、N2、He、Ar； 組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用。組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用。HPLC： 流動相為液體；流動相為液體； 流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度，增加了額外因素，如流動相極擇性、改善分離度，增加了額外因素，如流動相極性、性、pH值、不同比例的兩種或兩種以上液體的配比。值、不同比例的兩種或兩種以上液體的配比。 流動相種類較多，選擇余地廣。流動相種類較多，選擇余地廣。GC：加溫操作。：加溫操作。 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。＃菏覝?；高壓（液體粘度大，峰展寬小

5、）。操作條件操作條件本章教學內(nèi)容本章教學內(nèi)容高效液相色譜儀高效液相色譜儀 ；液相色譜中的固定相和流動相；液相色譜中的固定相和流動相；液相色譜法的主要類型液相色譜法的主要類型 。本章知識目標本章知識目標熟悉液相色譜法的分離原理、分析對象熟悉液相色譜法的分離原理、分析對象；熟悉液相色譜儀的基本構(gòu)造；熟悉液相色譜儀的基本構(gòu)造；熟悉液相色譜中的固定相、流動相類型，掌熟悉液相色譜中的固定相、流動相類型，掌握其選擇方法握其選擇方法；了了解液相色譜法中常用的檢測器類型和結(jié)構(gòu)。解液相色譜法中常用的檢測器類型和結(jié)構(gòu)。本章能力目標本章能力目標 能根據(jù)基團頻率判斷官能團的存在能根據(jù)基團頻率判斷官能團的存在；能掌握用

6、液相色譜儀進行樣品組分的能掌握用液相色譜儀進行樣品組分的分離和定量方法分離和定量方法 。第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要部件：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分主要部件：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。輔助裝置輔助裝置：脫氣機、梯度洗脫裝置、自動脫氣機、梯度洗脫裝置、自動進樣裝置、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。進樣裝置、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。組成部件組成部件基本流程基本流程一、高壓輸液系統(tǒng)一、高壓輸液系統(tǒng) 包括：由貯液瓶、高壓泵、脫氣機、梯度包括：由貯液瓶、高壓泵、脫氣機、梯度洗脫等裝置。洗脫等裝置。 1 1溶劑脫氣裝置溶劑脫氣裝置 作用：防止溶解在溶劑（流動相、試樣）中作用：防止

7、溶解在溶劑（流動相、試樣）中的的N2、O2進入檢測器而使噪聲劇增。進入檢測器而使噪聲劇增。脫氣方式：氦氣鼓泡、脫氣方式：氦氣鼓泡、超聲波脫氣超聲波脫氣、真空脫、真空脫氣等。氣等。2 2高壓泵高壓泵作用：輸送流動相。無脈動或脈動極小，保作用：輸送流動相。無脈動或脈動極小，保證輸出的流動相具有恒定的流速證輸出的流動相具有恒定的流速 。要求：要求：具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等。調(diào)、耐腐蝕等。作用：作用：分離過程中改變流動相的組成分離過程中改變流動相的組成 ，使，使所所有峰都獲得最佳分離效果，分析時間縮短。有峰都獲得最佳分離效果，分析時間縮短。基本方式：

8、基本方式：高壓梯度、低壓梯度。高壓梯度、低壓梯度。2 2梯度洗脫梯度洗脫高壓梯度：高壓梯度： 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。后進入色譜柱。低壓梯度低壓梯度 ： 一臺高壓泵臺高壓泵, , 通過比例調(diào)節(jié)閥通過比例調(diào)節(jié)閥, ,將兩種將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。如雙元梯度、四元梯度等。壓泵中混合。如雙元梯度、四元梯度等。二、進樣系統(tǒng)二、進樣系統(tǒng)進樣方式：進樣方式： 隔膜注射器進樣隔膜注射器進樣 停留進樣停留進樣

9、 閥進樣閥進樣 自動進樣器進樣自動進樣器進樣 1 1隔膜注射器進樣隔膜注射器進樣 色譜柱頂端裝一耐壓彈性隔膜，進樣時色譜柱頂端裝一耐壓彈性隔膜，進樣時用微量注射器刺穿隔膜將試樣注入色譜柱。用微量注射器刺穿隔膜將試樣注入色譜柱。 優(yōu)點：裝置簡單、價廉、死體積小。優(yōu)點：裝置簡單、價廉、死體積小。 缺點：是允許進樣量小，重復性差，只缺點：是允許進樣量小，重復性差，只能用于低壓系統(tǒng)能用于低壓系統(tǒng)(10MPa,( 流動相極性流動相極性分離順序：分離順序：極性小的組分先出柱；極性小的組分先出柱； 極性大的組分后出柱。極性大的組分后出柱。分離對象：分離對象：適于分離極性組分適于分離極性組分 反相色譜反相色譜

10、固定液極性固定液極性 流動相極性流動相極性分離順序：分離順序：極性大的組分先出柱；極性大的組分先出柱； 極性小的組分后出柱。極性小的組分后出柱。分離順序：分離順序：適于分離非極性組分適于分離非極性組分三、三、 離子交換色譜離子交換色譜 固定相固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂 流動相流動相：陰離子陰離子離子交換樹脂作固定相離子交換樹脂作固定相酸性水溶液酸性水溶液 陽離子陽離子離子交換樹脂作固定離子交換樹脂作固定相相堿性水溶液堿性水溶液基本原理基本原理：組分在固定相上發(fā)生反復離子交換反應，：組分在固定相上發(fā)生反復離子交換反應，基于基于組分與離子

11、交換劑之間親和力的差異進行分離。組分與離子交換劑之間親和力的差異進行分離。應用應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。選擇性系數(shù)選擇性系數(shù)注：注：Ks與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動相性與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動相性質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān) 以陽離子離子交換為例：以陽離子離子交換為例： RSO3-H+ + X+ RSO3-X+ + H+3333 SmSSSmSmRSO XHRSO XXKRSO HXRSO HH四、四、 離子色譜離子色譜 傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個難于解決傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個難于

12、解決的問題：的問題：(1)(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；(2)(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測方法。方法。1.1.離子色譜法原理離子色譜法原理 離子色譜法：以離子交換樹脂為固定相，離子色譜法：以離子交換樹脂為固定相，以電解質(zhì)溶液為流動相，用于分離陰陽離子。以電解質(zhì)溶液為流動相，用于分離陰陽離子。離子色譜中，應用最為廣泛的的檢測器離子色譜中，應用最為廣泛的的檢測器為電導檢測器。為消除流動相中強電解質(zhì)背為電導檢測器。為消除流動相中強電解質(zhì)背景離子對檢測器的干擾，常設置一個抑制柱，景離子對檢測器的干擾，常設

13、置一個抑制柱，稱為雙柱型離子色譜法或化學抑制型離子色稱為雙柱型離子色譜法或化學抑制型離子色譜法。譜法。2.2.離子色譜法基本裝置離子色譜法基本裝置離子色譜連續(xù)抑制裝置圖離子色譜連續(xù)抑制裝置圖(以測定陰離子為例以測定陰離子為例)分離分析分離分析BrBr- -為例為例分離柱上發(fā)生離子交換：分離柱上發(fā)生離子交換：ROHNa BrRBrNa OHNaOH洗脫：洗脫：分離柱上流出分離柱上流出Na+ （大量）（大量） 、Br-、OH-（大量）（大量）抑制柱上發(fā)生離子交換：抑制柱上發(fā)生離子交換：2RHNa OHRNaH ORHNa BrRNaH Br進入檢測器：進入檢測器：H2O、HBr 雙柱；薄殼型陰離子

14、交換樹脂分離柱雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3250mm), 流動相：流動相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量，流量138 mL/hr。（1 1）分析速度快）分析速度快 可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個試樣的分析；可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個試樣的分析；（2 2）分離能力高）分離能力高 在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3 3）分離混合陰離子的最有效方法）分離混合陰離子的最有效方法（4

15、 4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱五、五、 離子對色譜離子對色譜 原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配； 陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；氧化十六烷基三甲銨作為對離子； 陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；離子； 反相離子對色譜：非極性的疏水固定相反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18(C-18柱柱) )，含有，含有對離子對離子Y Y+ +的甲醇的甲醇- -水或乙腈水或乙腈- -水作為流動相，試樣離子水作為流動相，試樣離子X X- -進入進入流動相后，生成疏水性離子對流動相后，生成疏水性離子對Y Y+ + X X - -后；在兩相間分配。后；在兩相間分配。六、六、 排阻色譜色譜排阻色譜色譜 固定相固定相：凝膠：凝膠( (