流式細胞儀培訓20100414

1、會計學1流式細胞儀培訓流式細胞儀培訓20100414主要內(nèi)容主要內(nèi)容 流式細胞儀概述流式細胞儀概述 流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的工作原理 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用 檢測的一般步驟檢測的一般步驟 一、流式細胞儀概述一、流式細胞儀概述 流式細胞儀種類流式細胞儀種類BD FACSVantageBD-Calibur Epics AltraEpics Altra Beckman Coulter流式細胞儀的定義流式細胞儀的定義 流式細胞儀是指，使細胞（或其他粒子）以單個方式依次高速通過激發(fā)光束，采集細胞被光照時產(chǎn)生的各種信號，對信號進行處理，并對各參數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析的一種儀器。 利用流式細胞儀通

2、過檢測熒光信號來檢利用流式細胞儀通過檢測熒光信號來檢測細胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞測細胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞核）的物理、化學特性并通過這些特性對細核）的物理、化學特性并通過這些特性對細胞或顆粒進行定量。胞或顆粒進行定量。u 檢測表面標記物檢測表面標記物u 檢測胞漿標記物檢測胞漿標記物u 檢測胞核內(nèi)標記物檢測胞核內(nèi)標記物u 檢測可溶性蛋白檢測可溶性蛋白流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)（FLOW CYTOMETRY）流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)前向散射前向散射側(cè)向散射側(cè)向散射流式細胞儀顯微鏡流動的細胞靜止的細胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布可以揭示細胞

3、內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息特殊的顯微鏡特殊的顯微鏡 高速測定細胞，大樣本計數(shù)高速測定細胞，大樣本計數(shù) 檢測稀有細胞檢測稀有細胞 多參數(shù)分析多參數(shù)分析 自動化自動化 細胞分選細胞分選流式細胞儀的主要特點流式細胞儀的主要特點 二、流式細胞儀工作原理二、流式細胞儀工作原理 流式細胞儀工作原理流式細胞儀工作原理流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源，經(jīng)過流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號被光電二極管和光和激發(fā)熒光。這兩種信號被光電二極管和光電倍

4、增管接收，之后轉(zhuǎn)換為電信號，再通光電倍增管接收，之后轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號，最后由計算機進行計算機識別的數(shù)字信號，最后由計算機進行計算處理。計算處理。Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流動室流動室Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide Scatter

5、Detector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (PE)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流動室流動室488nm氬離子激光器氬離子激光器633nm氦氖激光器氦氖激光器大功率水冷紫外激光器大功率水冷紫外激光器光路光路 - 濾片特性濾片特性l 長通濾片長通濾片 允許長于設(shè)定波長的光通過允許長于設(shè)定波長的光通過l 短通濾片短通濾片 允許短于設(shè)定波長的光通過允許短于設(shè)定波長的光通過l 帶通濾片帶通濾片 允許一定帶寬的波長通過允許一定帶寬的波長通過l 當以當以 4545o o 角角放置濾片時放置濾片時, ,該

6、濾片可以通過一定波長的光該濾片可以通過一定波長的光, ,同同時也可以阻斷并折射該波長以下的光時也可以阻斷并折射該波長以下的光 ，這種方式的濾片這種方式的濾片稱為二向色性濾片稱為二向色性濾片( ( dichroic filter)dichroic filter)630 nm BandPass FilterWhite Light Source光信號收集光信號收集 光信號分離，導向，各探測通道光信號分離，導向，各探測通道PMTPMT接收并轉(zhuǎn)化為電信號。接收并轉(zhuǎn)化為電信號。二色鏡二色鏡 1 2 3帶通濾波片帶通濾波片光電倍增管光電倍增管激光束激光束細胞細胞收集透鏡收集透鏡前前向向散散射射光光側(cè)向散射光

7、側(cè)向散射光，熒光，熒光數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理FSC SSC FL1 FL2 FL3對數(shù)對數(shù) 線性線性 線性線性 線性線性 對數(shù)對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號光信號電信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果（面積，峰高，寬度）（面積，峰高，寬度）顆粒度顆粒度細胞大小細胞大小流式細胞儀產(chǎn)生的信號非熒光信號非熒光信號FL1 FITC,GFP(PMT2)FL2 PE (PMT3)FL3 ECD,PI (PMT4)FL4 PC5,APC (PMT5)熒光信號熒光信號u細胞表面的抗原細胞表面的抗原( (或細胞膜受體或細胞膜受體) )與相關(guān)的與相關(guān)的熒光抗體結(jié)合，形成帶有熒光的抗原抗體熒光抗體結(jié)合，形成帶有熒

8、光的抗原抗體復合物。復合物。u通過流式細胞儀測定其熒光量，即可得通過流式細胞儀測定其熒光量，即可得到細胞群的不同抗原位點表達情況。到細胞群的不同抗原位點表達情況。原原理理488nm488nm空冷激光空冷激光 ： FITCFITC、PEPE、ECDECD、PC5PC5、PIPI、7AAD7AAD、 PerCP PerCP 、EGFP EGFP 、EYFP EYFP 、AO AO 、TO TO 、Fluo3Fluo3633nm633nm空冷激光：空冷激光： APCAPC、APC-CY7 APC-CY7 、CY5 CY5 90-490-4水冷激光：水冷激光：UVUV（333-364nm333-364

9、nm） HOECHST 33342HOECHST 33342、DAPI DAPI 三、流式細胞儀應(yīng)用三、流式細胞儀應(yīng)用 流式細胞儀應(yīng)用流式細胞儀應(yīng)用 淋巴細胞免疫功能測定淋巴細胞免疫功能測定 干細胞研究干細胞研究 細胞增殖與凋亡檢測細胞增殖與凋亡檢測 細胞周期及倍體分析細胞周期及倍體分析 細胞活性分析細胞活性分析 細胞分選細胞分選 淋巴細胞亞群淋巴細胞亞群 活化的活化的T淋巴細胞淋巴細胞 抗原特異性免疫細胞抗原特異性免疫細胞 調(diào)控性調(diào)控性T細胞細胞 樹突狀細胞樹突狀細胞 先天免疫細胞先天免疫細胞細胞免疫功能測定細胞免疫功能測定 細胞群細胞群 CDCD抗原抗原 T T細胞細胞 CD2 CD3 C

10、D4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B B細胞細胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系細胞髓系細胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK NK細胞細胞 CD16 CD56 CD57 CD94CD16 CD56 CD57 CD94 血小板血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62

11、p CD63 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-fCD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 內(nèi)皮細胞內(nèi)皮細胞 CD105 CD106 CD109CD105 CD106 CD109 細胞因子受體細胞因子受體 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126CD25 CD115 CD117 CD122 CD126CDCD抗原及其相關(guān)細胞群抗

12、原及其相關(guān)細胞群淋巴細胞亞群數(shù)量檢查項目和意義淋巴細胞亞群數(shù)量檢查項目和意義疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低AIDS降低降低嚴重降嚴重降低低增高增高降低降低SARS降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低慢性活動性肝慢性活動性肝炎、肝硬化炎、肝硬化降低降低正?；蛘；蛟龈咴龈呓档徒档徒档徒档湍[瘤腫瘤降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低用熒光標記抗體用熒光標記抗體抗體特異性地結(jié)合細抗體特異性地結(jié)合細胞上對應(yīng)的抗原胞上對應(yīng)的抗原表達該抗原的細胞被表達該抗原的細胞被標記上熒光；標記上熒光；抗原表達多的細胞熒抗原表達多的細胞熒光強度強

13、光強度強陽性細胞百分陽性細胞百分比或濃度比或濃度靶蛋白濃度靶蛋白濃度淋巴細胞淋巴細胞CDCD抗原的流式細胞檢測抗原的流式細胞檢測 造血系統(tǒng)干細胞造血系統(tǒng)干細胞 腫瘤干細胞腫瘤干細胞 間充質(zhì)干細胞間充質(zhì)干細胞 神經(jīng)干細胞神經(jīng)干細胞 脂肪干細胞脂肪干細胞 干細胞研究干細胞研究熱門研究熱門研究(腫瘤腫瘤)干細胞干細胞l 腫瘤組織無限制的增殖在于腫瘤干細胞的存在腫瘤組織無限制的增殖在于腫瘤干細胞的存在l 目前研究的腫瘤干細胞來源于前列腺、乳腺等腫瘤目前研究的腫瘤干細胞來源于前列腺、乳腺等腫瘤l 腫瘤干細胞數(shù)量稀少，常規(guī)方法很難檢測腫瘤干細胞數(shù)量稀少，常規(guī)方法很難檢測l 目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞和正常細

14、胞在目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞和正常細胞在HOECHEST 33342染料攝取方面有重大差別染料攝取方面有重大差別l 故流式細胞儀是分析和檢測腫瘤干細胞的重要工具故流式細胞儀是分析和檢測腫瘤干細胞的重要工具 干細胞能表達干細胞能表達ABCG2ABCG2泵蛋白，在泵蛋白，在HOECHST 33342HOECHST 33342染染色時能將該染料泵出，因此分析不能被該染料染色時能將該染料泵出，因此分析不能被該染料染色的細胞群時可以發(fā)現(xiàn)一群不能染色的細胞既是色的細胞群時可以發(fā)現(xiàn)一群不能染色的細胞既是干細胞，因此能夠在眾多腫瘤細胞中區(qū)分出腫瘤干細胞，因此能夠在眾多腫瘤細胞中區(qū)分出腫瘤干細胞。干細胞。腫瘤干

15、細胞中的研究應(yīng)用腫瘤干細胞中的研究應(yīng)用- -Hoechst 33342 side populationHoechstHoechst+Vera.Side Population CellsG1S phaseG2MG112 1DNA含量含量 DNA 含量含量細胞周期時相細胞周期時相G0/1G2/MS細胞數(shù)細胞數(shù)細胞周期分析細胞周期分析PIEthidium BromideAcridine OrangeDAPI (UV excitable)Hoechst 33342 (viable, UV excitable)不能主動進入細胞，需要固定打孔488nm激發(fā)為脂溶性，主動進入細胞UV激發(fā)常用的常用的DNA

16、染料染料DNA含量及細胞周期分析含量及細胞周期分析 細胞周期分析細胞周期分析: :在細胞周期在細胞周期(G0(G0，G1G1，S S，G2 G2 ，M)M)的各個時期，的各個時期，DNADNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標記化。通過核酸染料標記DNADNA，并由流式細胞儀進行分，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%G0/G1%，S%S%及及G2/M%G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。也可利用細胞周期蛋白（增殖活性。也可利用細胞

17、周期蛋白（CYCLINCYCLIN）、）、Ki67Ki67、核增殖抗原（、核增殖抗原（PCNAPCNA）等，對細胞周期進行精）等，對細胞周期進行精確的分期：確的分期：G0G0、G1G1、S S、G2G2、M.M.G0/G1SG2/M流式細胞儀分選流式細胞儀分選u電荷式分選是當前的主流分選模式電荷式分選是當前的主流分選模式u高速分選是保證結(jié)果的基本條件高速分選是保證結(jié)果的基本條件u高純度和高活性是分選的基本要求高純度和高活性是分選的基本要求u可選的激光要多樣化（空冷、水冷、固體；不同可選的激光要多樣化（空冷、水冷、固體；不同的波長；真正的紫外）的波長；真正的紫外）u提供多種分選流動室提供多種分選

18、流動室u光路穩(wěn)定，紫外激光功率大光路穩(wěn)定，紫外激光功率大u流式分選和磁珠分選的差別和聯(lián)系流式分選和磁珠分選的差別和聯(lián)系488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector電荷式細胞分選電荷式細胞分選細胞分選的主要技術(shù)指標細胞分選的主要技術(shù)指標 分選速度：分選速度： 25000個細胞個細胞/秒秒 分選純度：分選純度：98% 分選后細胞存活率：分選后細胞存活率：97%Before SortingAfter Sorting 三、流式細胞儀檢測的三、流式細胞儀檢測的一

19、般步驟一般步驟 設(shè)置檢測方案（PROTOCOL)染色標本（同型對照，補償管，檢測抗體）同型對照管調(diào)電壓電壓不變，補償管調(diào)補償電壓不變，補償不變，上檢測管檢測后直接閱讀結(jié)果檢測的一般步驟檢測的一般步驟電壓調(diào)節(jié)利用同型對照：設(shè)置背景電壓調(diào)節(jié)利用同型對照：設(shè)置背景l(fā) 電壓電壓 voltsl 增益增益 Gain設(shè)定陰性和陽性信號強度的設(shè)定陰性和陽性信號強度的臨界點臨界點 Need to do when we measure signals from more than 1 fluorescence. FITC520BPPE575BP4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE

20、/ECD/PC5PEFITCPE+ cellsFITC + cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signalFor Pure PE+ cells,= FITC signal - % PE signalAfter compensationPEFITCPE+ cellsFITC + cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cellsX-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cellsPEFITCPE+ cellsFITC + cellsOVER compensation淋巴細胞單核細胞中性粒細胞PIPIAnnexinAnnexinV V細胞凋亡檢測細胞凋亡檢測PIAnnexin-VG0/G1SG2/M流式細胞儀種類流式細胞儀種類BD FACSVantageBD-Calibur Epics AltraEpics Altra Beckman Coulter流式細胞儀顯微鏡流動的細胞靜止的細胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布可以揭示細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息特殊的顯微鏡特殊的顯微鏡