活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

1、活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室活性評(píng)價(jià)室活性評(píng)價(jià)室2012-4-24實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、一、Western Blot二、二、Real-Time PCRWestern Blot實(shí)驗(yàn)器材：實(shí)驗(yàn)器材：電泳轉(zhuǎn)膜電源、電泳儀轉(zhuǎn)膜儀、搖電泳轉(zhuǎn)膜電源、電泳儀轉(zhuǎn)膜儀、搖床、紅光、暗室、移液槍、輔助玻床、紅光、暗室、移液槍、輔助玻璃儀器若干璃儀器若干試劑試劑:(操作過程中介紹操作過程中介紹)1、試劑準(zhǔn)備、試劑準(zhǔn)備 6、轉(zhuǎn)膜、轉(zhuǎn)膜2、樣品收集、樣品收集 7、封閉、封閉3、配膠、配膠 8、一抗、二抗孵育、一抗、二抗孵育4、上樣、上樣 9、洗滌、洗滌5、電泳、電泳 10、發(fā)光鑒定、發(fā)光鑒定實(shí)驗(yàn)步

2、驟：實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理：14891489565617177 714941494222211116 614991499272751514 41507015070777792921.001.00313128281.001.00656521211.0111.01175759393 掃描膠片成圖片文件，掃描膠片成圖片文件，BandScan分析條分析條帶灰度值，確定蛋白含量變化。帶灰度值，確定蛋白含量變化。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)器材：實(shí)驗(yàn)器材：普通普通PCR、Real-time PCR、電腦、電腦、 Real-time PCR配套軟件、各移液槍、配套軟件、各移液槍、EP管及其他

3、輔助器材管及其他輔助器材試劑：試劑：RNA提取試劑、提取試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、 Real-time PCR試劑試劑實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1、細(xì)胞培養(yǎng)，藥物處理、細(xì)胞培養(yǎng)，藥物處理2、RNA提取提取3、RNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄4、 Real-time PCRReal-time PCR體系體系SYBgreen 12.5l上游引物上游引物 0.25l下游引物下游引物 0.25lcDNA 12lH2O 6l（內(nèi)參及目的基因）（內(nèi)參及目的基因）例如：例如：Sample 處理前 處理后 Bax(MeanCt) GAPDH(MeanCt) E18161717.41.951.952 - Ct法：法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%Ct（處理后）（處理后）1617.4=1.4 Ct（處理前）（處理前）18171 Ct=Ct（處理后）（處理后）Ct（處理前）（處理前）1.412.4比率比率（處理后（處理后/處理前）處理前）=2Ct2（2.4） = 5.3 所以所以BaxBax基因在處理后表達(dá)水平是處理前的基因在處理后表達(dá)水平是處理前的5.35.3倍倍相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析2 2 - -CtCt法法F =2 待測(cè)組目的基因待測(cè)組目的基因平均平均Ct值值待測(cè)組內(nèi)參基因待測(cè)組內(nèi)參基因平均平均Ct值