親合組織化學技術

1、第五章第五章 親合組織化學技術親合組織化學技術發(fā)展歷史發(fā)展歷史v6060年代：發(fā)現(xiàn)生物素和卵白素年代：發(fā)現(xiàn)生物素和卵白素v7070年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌A A蛋白蛋白-BRAB-BRAB、LABLAB、SPA-HRPSPA-HRP、ABCABCv親和組織化學：親和組織化學：19761976年年BayerBayer首次提出首次提出 包括植物凝集素和糖類、生物素和抗生物素、葡萄球菌包括植物凝集素和糖類、生物素和抗生物素、葡萄球菌A A蛋蛋白與白與IgGIgG、陽離子與陰離子、激素、維生素、糖及類脂質(zhì)作、陽離子與陰離子、激素、維生素、糖及類脂質(zhì)作用部位和

2、受體等用部位和受體等植物凝集素植物凝集素(Lectin)(Lectin)生物素生物素(Biotin)(Biotin)葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白蛋白(SPA) (SPA) SPAHRPSPAHRP法、法、ABCABC法和法和LABLAB法等。法等。親合組織化學技術親合組織化學技術v定義：定義：是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎，建立的組織細胞基礎化學技術。礎，建立的組織細胞基礎化學技術。v本質(zhì)：本質(zhì)：區(qū)別于一般的組織化學，非抗原抗體反應。區(qū)別于一般的組織化學，非抗原抗體反應。v優(yōu)點：優(yōu)點：敏感性高，有利于微量抗原（或抗體）在細胞或亞敏感性高

3、，有利于微量抗原（或抗體）在細胞或亞細胞水平的定位。細胞水平的定位。一一 抗生物素抗生物素生物素免疫細胞化學技術生物素免疫細胞化學技術 二二 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A技術技術 三三 凝集素組織化學技術凝集素組織化學技術四四 其它親和細胞化學其它親和細胞化學一、抗生物素一、抗生物素生物素免疫細胞化學技術生物素免疫細胞化學技術 ( (一一) ) 基本原理基本原理 親合素（抗生物素親合素（抗生物素/ /卵白素）卵白素） 是雞蛋白中含有的一種堿性蛋白，屬于糖蛋白是雞蛋白中含有的一種堿性蛋白，屬于糖蛋白; ;具有具有4 4個同維生素個同維生素H (H (生物素生物素) )親合力極高的結合點。親合力

4、極高的結合點。 鏈酶親合素鏈酶親合素 是一種從鏈酶菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，和親合素一樣，也有四個生物素結是一種從鏈酶菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，和親合素一樣，也有四個生物素結合位點，是一種親和力更高的生物素結合蛋白。合位點，是一種親和力更高的生物素結合蛋白。生物素（維生素生物素（維生素H H）是一種小分子的水溶性維生素，它與親合素鏈酶親合素之間有很強的親合是一種小分子的水溶性維生素，它與親合素鏈酶親合素之間有很強的親合力，較之抗體對抗原的親合力要高出力，較之抗體對抗原的親合力要高出100100萬倍，能夠彼此牢固結合而不影響萬倍，能夠彼此牢固結合而不影響彼此的生物學活性。彼此的生物學活性。 生物素、

5、親合素、鏈酶親合素：生物素、親合素、鏈酶親合素：能與熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結合。能與熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結合。 親合素、鏈酶親合素：親合素、鏈酶親合素：同一定濃度的生物素化酶混合后，形成親合素一生物同一定濃度的生物素化酶混合后，形成親合素一生物素一酶復合物。這種復合物可以和各種生物素標記抗體結合。素一酶復合物。這種復合物可以和各種生物素標記抗體結合。（二）幾種親合素（二）幾種親合素生物素染色技術生物素染色技術 v1 1 親合素一生物素親合素一生物素過氧化物酶復合物技術過氧化物酶復合物技術(ABC)(ABC)v2 2鏈酶親合素鏈酶親合素- -生物素生物素- -過氧化物酶復合物技術過

6、氧化物酶復合物技術(SABC(SABC法法) )v3 3標記生物素標記生物素抗生物素技術抗生物素技術(LAB)(LAB)v4.SP/SAP4.SP/SAP法法v5.Envision5.Envision法法v6.CSA6.CSA法法ABCABC復合物：復合物：復合物復合物1 1 親合素一生物素親合素一生物素過氧化物酶復合物技術過氧化物酶復合物技術(ABC)(ABC) 基本原理基本原理 是將親合素作為是將親合素作為“橋橋”與生物素化的抗體與生物素結合的酶與生物素化的抗體與生物素結合的酶（HRP)HRP)連接起來。連接起來。 第一抗體：第一抗體：為未標記特異性抗體，能結合組織中待測抗原；為未標記特異

7、性抗體，能結合組織中待測抗原； 第二抗體：第二抗體：為為生物素化的橋抗體生物素化的橋抗體，能與第一抗體結合；，能與第一抗體結合； 第三抗體：第三抗體：是結合了過氧化物酶的親合素復合物是結合了過氧化物酶的親合素復合物( (即即ABCABC) ) 。優(yōu)點：優(yōu)點：敏感性強（比敏感性強（比PAP高高20-40倍）；倍）；特異性強，背景染色淡；特異性強，背景染色淡；方法簡便，節(jié)約時間方法簡便，節(jié)約時間（比（比PAPPAP縮短縮短2h2h） ；由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結合的能力，可由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。用于雙重或多重免疫染色。 操作步驟操作步

8、驟 冰凍切片或石蠟切片均可。冰凍切片或石蠟切片均可。 冰凍切片：丙酮固定，冰凍切片：丙酮固定，PBS PBS 洗洗5min5min，更換，更換3 3次。次。 石蠟切片：脫蠟，系列酒精至水。石蠟切片：脫蠟，系列酒精至水。 第一抗體第一抗體孵育，過夜。孵育，過夜。 PBS PBS洗洗5min5min，更換，更換3 3次。次。 加加生物素標記的第二抗體生物素標記的第二抗體，孵育，孵育15min15min。 PBS PBS洗洗5min5min，更換，更換3 3次。次。 加加ABCABC復合物復合物室溫作用室溫作用15min15min。 PBS PBS洗洗5min5min，更換，更換3 3次。次。 用用

9、DABDAB顯色。顯色。 復染、封片、觀察。復染、封片、觀察。 結果結果 呈棕黃色為陽性表達，核被蘇木精染成淺藍色。呈棕黃色為陽性表達，核被蘇木精染成淺藍色。(4) (4) 注意事項注意事項 v消除內(nèi)源性生物素：消除內(nèi)源性生物素：染色前以染色前以0.010.01的親合素和的親合素和0.010.01生物素溶生物素溶液分別作用液分別作用20min20min以消除內(nèi)源性生物素活性，每次作用后用以消除內(nèi)源性生物素活性，每次作用后用PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，5min5min。v消除內(nèi)源性過氧化物酶：消除內(nèi)源性過氧化物酶：可用可用3 3 H H2 2O O2 2孵育孵育5-105-10分鐘以滅活內(nèi)

10、源分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水洗性過氧化物酶活性。蒸餾水洗3 3次。次。v試劑的保存：試劑的保存：溫度以溫度以44為佳，可達為佳，可達2 2年之久，在年之久，在2020時其生物時其生物活性反而在短期內(nèi)被破壞。活性反而在短期內(nèi)被破壞。 此外，生物素制劑之間相互親和性差異大，注意廠家和批號。此外，生物素制劑之間相互親和性差異大，注意廠家和批號。SABC法原理：原理： 一抗生物素化二抗一抗生物素化二抗SABCSABC復合物復合物SABCSABC復合物復合物 生物素標記的二抗生物素標記的二抗鏈霉卵白素連接鏈霉卵白素連接 生物素標記的酶。生物素標記的酶。優(yōu)點：優(yōu)點：敏感性略高于敏感性略高于SP

11、SP法，低背景和操法，低背景和操作簡便作簡便缺點：缺點：因體內(nèi)含有內(nèi)源性生物素，易產(chǎn)因體內(nèi)含有內(nèi)源性生物素，易產(chǎn)生非特異性染色。生非特異性染色。一抗一抗+ +生物素標記二抗生物素標記二抗+ +滴加試劑滴加試劑SABCSABC（鏈霉卵白素（鏈霉卵白素+ +辣根酶標記生物素辣根酶標記生物素)+)+辣根酶底物顯色辣根酶底物顯色2 2 鏈酶親合素鏈酶親合素- -生物素生物素- -過氧化物酶復合物技術過氧化物酶復合物技術(SABC(SABC法法) )SABCSABC試劑盒試劑盒( (含正常血清，生物素化二抗，含正常血清，生物素化二抗，SABCSABC等等) )操作程序操作程序1 1）載玻片防脫處理：可選

12、擇）載玻片防脫處理：可選擇APESAPES或或PolyLysinePolyLysine，烤片。，烤片。2 2）切片常規(guī)脫蠟至水。）切片常規(guī)脫蠟至水。3 3）3 3H H2 20 02 2 滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3 3次。次。4 4）抗原熱修復：將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液）抗原熱修復：將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0)(PH6.0)，電爐或，電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔510510分鐘后，反復分鐘后，反復1212次。次。冷卻后冷卻后PBSPBS洗滌。洗滌。5 5）滴加）滴加5 5BSABSA封閉液，室溫封閉液，室溫2020分鐘。甩去多余液

13、體，不洗。分鐘。甩去多余液體，不洗。6 6）滴加適當稀釋的）滴加適當稀釋的一抗一抗，371371小時左右或小時左右或202202小時左右。小時左右。 也可也可44過夜。過夜。PBS(pH7.27.6)PBS(pH7.27.6)洗洗2 2分鐘分鐘3 3次。次。 對照切片用對照切片用PBSPBS代替一抗。代替一抗。7 7）滴加）滴加生物素化二抗生物素化二抗，203720203720分鐘。分鐘。PBS(pH7.27.6)PBS(pH7.27.6)洗洗2 2分鐘分鐘3 3次。次。 8 8）滴加試劑）滴加試劑SABCSABC，203720203720分鐘。分鐘。PBS(pH7.27.6)PBS(pH7.

14、27.6)洗洗5 5分鐘分鐘4 4次。次。9 9）DABDAB顯色：使用顯色：使用DABDAB顯色試劑盒。取顯色試劑盒。取1ml1ml蒸餾水，加試劑盒蒸餾水，加試劑盒中中A A、B B、C C試劑各試劑各1 1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在控制反應時間，一般在5 5一一3030分鐘之間。蒸餾水洗滌。分鐘之間。蒸餾水洗滌。 1010）蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。）蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。結果結果 棕褐色為陽性結果，而細胞核染為淡藍色。棕褐色為陽性結果，而細胞核染為淡藍色。 注意事項注意事項 1 1）

15、染色背景過高：）染色背景過高： 在在SABCSABC反應之后，反應之后，DABDAB顯色之前，用加有顯色之前，用加有0.0l0.0l一一0.020.02TWEEN20TWEEN20的的PBS(pH7.27.6)PBS(pH7.27.6)洗滌切片洗滌切片4 4次，單純次，單純PBSPBS洗洗2 2次，次，然后然后DABDAB顯色。顯色。 2 2）抗原熱修復：）抗原熱修復：可選可選0.01M0.01M枸櫞酸鹽緩沖液；枸櫞酸鹽緩沖液； 也可以使用也可以使用PBSPBS、TBSTBS等多種緩沖液。等多種緩沖液。 3 3 標記生物素標記生物素抗生物素技術抗生物素技術(LAB)(LAB)v原理：原理： 第

16、第抗體：抗體：生物素標記；生物素標記； 第二抗體：第二抗體：酶標記抗生物素酶標記抗生物素( (親合素親合素) ) v操作步驟：操作步驟： 切片中加入切片中加入生物素標記一抗生物素標記一抗，室溫孵育，室溫孵育1 h1 h，。，。 0.01MPBS 0.01MPBS洗洗3 3次，每次次，每次5 min5 min。 20-50ug 20-50ugml ml HRP-HRP-抗生物素抗生物素液孵育。液孵育。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。 DAB DAB顯色。蒸餾水漂洗。顯色。蒸餾水漂洗。 蘇木精復染核。梯度乙醇脫水、透明、封片、鏡檢。蘇木精復染核。梯度乙醇脫水、透明、封片、

17、鏡檢。 應用不如應用不如ABCABC普遍，但手續(xù)較簡便，但靈敏度低。普遍，但手續(xù)較簡便，但靈敏度低。SPSP法（過氧化物酶標記的鏈霉卵白素法（過氧化物酶標記的鏈霉卵白素/ /過氧化過氧化物酶標記的堿性磷酸酶染色）物酶標記的堿性磷酸酶染色）原理：原理：一抗生物素化二抗酶標記的鏈一抗生物素化二抗酶標記的鏈霉卵白素霉卵白素優(yōu)點：優(yōu)點：高靈敏度、低背景、操作方高靈敏度、低背景、操作方便便缺點：缺點：不適用于內(nèi)源性生物素豐富不適用于內(nèi)源性生物素豐富的組織的組織v三步法（以三步法（以SPSP試劑盒為例）試劑盒為例） 石蠟切片脫蠟至水。石蠟切片脫蠟至水。 蒸餾水沖洗，蒸餾水沖洗，PBSPBS浸泡浸泡5 5分

18、鐘，如需采用抗原修復，可在此步后進行。分鐘，如需采用抗原修復，可在此步后進行。 3%H 3%H2 2O O2 2室溫孵育室溫孵育5-105-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBSPBS沖洗，沖洗，2 2分鐘分鐘3 3次。次。 5-10% 5-10%正常山羊血清封閉，室溫孵育正常山羊血清封閉，室溫孵育1010分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的比例稀釋的一抗一抗或一抗工作液，或一抗工作液，3737孵育孵育1-21-2小時或小時或44過夜。過夜。 PBS PBS沖洗，沖洗，2 2分鐘分鐘3 3次。次。 滴加適當比例稀釋的

19、滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗生物素標記二抗（1%BSA-PBS1%BSA-PBS稀釋），稀釋），3737孵育孵育10-10-3030分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，3737或室溫孵育或室溫孵育10-2010-20分鐘。分鐘。 PBS PBS沖洗，沖洗，2 2分鐘分鐘3 3次。次。 滴加適當比例稀釋的滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素辣根酶標記鏈霉卵白素（PBSPBS稀釋），稀釋），3737孵育孵育10-10-3030分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，3737或室溫孵育或室溫孵育10-201

20、0-20分鐘。分鐘。 PBS PBS沖洗，沖洗，2 2分鐘分鐘3 3次。次。 顯色劑顯色（顯色劑顯色（DABDAB或或AECAEC）。）。 自來水充分沖洗，復染，脫水透明（如需要）、封片。自來水充分沖洗，復染，脫水透明（如需要）、封片。原理：原理：將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體架聯(lián)接成一個多聚體 優(yōu)點：優(yōu)點：1 1 簡便、快速、敏感性是簡便、快速、敏感性是SPSP、SABCSABC法的幾十倍。法的幾十倍。2 2 人體組織中不含有這種多聚物，人體組織中不含有這種多聚物，從而避免了組織中生物素的干擾從而避免了組織中生物素的干擾缺點：缺點：因大分子穿透

21、核膜困難因大分子穿透核膜困難, ,對于核內(nèi)抗原的定位不能選用此法。對于核內(nèi)抗原的定位不能選用此法。Envision法法一抗一抗+二抗標記多聚螯合物酶二抗標記多聚螯合物酶EnvisionEnvision法法vEnVisionEnVision工作程序：工作程序：1 1） 脫蠟、水化組織切片。脫蠟、水化組織切片。2 2） 預處理組織切片（據(jù)一抗具體說明而定）預處理組織切片（據(jù)一抗具體說明而定）3 3） 蒸餾水漂洗，置于蒸餾水漂洗，置于PBSPBS中。中。4 4） 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（僅用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（僅用于EnVisionTM/HRPEnVisionTM/HRP）5 5） 蒸餾水漂洗，置

22、于蒸餾水漂洗，置于PBSPBS，1010分鐘分鐘6 6） 一抗一抗孵育孵育10-3010-30分鐘分鐘7 7） PBSPBS漂洗漂洗1010分鐘分鐘8 8） EnVisionEnVisionTMTM孵育孵育10-3010-30分鐘分鐘9 9） PBSPBS漂洗漂洗1010分鐘分鐘10) 10) 色源底物溶液孵育色源底物溶液孵育1010分鐘分鐘11) 11) 蒸餾水漂洗蒸餾水漂洗12) 12) 復染及封片復染及封片CSACSA法（催化信號放大法）法（催化信號放大法）原理：原理：是酪胺的過氧化物酶反應是酪胺的過氧化物酶反應(即即HRP催化酪胺催化酪胺鹽，形成共價鍵結合位點鹽，形成共價鍵結合位點)，

23、產(chǎn)生大量的酶，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結合，這樣結合，這樣在抗原在抗原抗體結合部位就有大量的生物素沉抗體結合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的鏈霉親和素積，與隨后加入的鏈霉親和素HRP結合，結合，如經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以網(wǎng)絡許許多如經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以網(wǎng)絡許許多多的酶分子，最后通過多的酶分子，最后通過DAB的顯色反應，的顯色反應，其敏感性得到幾何級放大。其敏感性得到幾何級放大。優(yōu)點：優(yōu)點：比比EnVision法敏感法敏感20100倍。倍。適合于實驗病理學和第一抗體昂

24、貴、抗原性適合于實驗病理學和第一抗體昂貴、抗原性較弱的較弱的IHC檢測以及抗原破壞嚴重、抗原量檢測以及抗原破壞嚴重、抗原量較少的組織細胞抗原的檢測方法較少的組織細胞抗原的檢測方法;核內(nèi)抗原的檢測（原為雜交）。核內(nèi)抗原的檢測（原為雜交）。 缺點：缺點：操作步驟多、孵育時間長，存在嚴重的內(nèi)源操作步驟多、孵育時間長，存在嚴重的內(nèi)源性干擾，背景染色有時較重。性干擾，背景染色有時較重。二、葡萄球菌蛋白二、葡萄球菌蛋白A A技術技術 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A(SPA)A(SPA)： 金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質(zhì)，作為橋抗體或標記抗體金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質(zhì)，作為橋抗體或標記抗體不受種屬特異性

25、的限制，它能和人及許多動物不受種屬特異性的限制，它能和人及許多動物IgGIgG結合，對結合，對IgGIgG免疫球蛋白亞型的結合有選擇性。免疫球蛋白亞型的結合有選擇性。 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A(SPA)A(SPA)技術原理：技術原理： 結合部位是結合部位是FcFc段，不影響抗體的活性；段，不影響抗體的活性； 結合力是雙價的，可同時結合兩個結合力是雙價的，可同時結合兩個IgGIgG分子；分子； 可將酶、熒光素、膠體金等標記在可將酶、熒光素、膠體金等標記在SPASPA上。上。 SPA SPA應用應用: :1 1 免疫球蛋白的制備和分析免疫球蛋白的制備和分析能和能和IgGIgG及其某些及其某些Fc

26、Fc段結合，可提純、分析免疫球蛋白制劑。段結合，可提純、分析免疫球蛋白制劑。2 2 應用于免疫細胞化學應用于免疫細胞化學結合力是雙價的，可作為橋抗體或標記抗體。且不受種屬特異性限制；結合力是雙價的，可作為橋抗體或標記抗體。且不受種屬特異性限制；分子量小，穿透力強。分子量小，穿透力強。3 3 應用于多種細菌、支原體和病毒的簡易快速診斷應用于多種細菌、支原體和病毒的簡易快速診斷SPASPA菌體為載體，結合特異性抗體成為一種吸附原，作協(xié)同凝集素，用于細菌體為載體，結合特異性抗體成為一種吸附原，作協(xié)同凝集素，用于細菌、病毒的定群和分型。菌、病毒的定群和分型。4 4 可作為固相吸附劑研究免疫復合物、膜抗

27、原、膜受體和膜可作為固相吸附劑研究免疫復合物、膜抗原、膜受體和膜IgIg SPASPA在免疫細胞化學染色中的應用在免疫細胞化學染色中的應用vSPASPA可被熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等標記，其中最常用可被熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等標記，其中最常用的酶為的酶為HRPHRPv1 SPA-HRP1 SPA-HRP用于間接法的染色用于間接法的染色 (1) (1) 切片脫蠟至水，切片脫蠟至水，3 3H H2 2O O2 2抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。 (2) (2) 水洗后，水洗后，PBSPBS漂洗。漂洗。 (3) (3) 加加一抗一抗，3737孵育孵育60min60min或或

28、44過夜。過夜。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。 (4(4) SPA-HRP) SPA-HRP室溫室溫30min30min。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。 (5) DAB(5) DAB顯色。顯色。 (6) (6) 蘇木精復染，脫水，透明，封固。蘇木精復染，脫水，透明，封固。2 SPA2 SPA用于用于PAPPAP法的染色法的染色 (1)(1)切片脫蠟至水，切片脫蠟至水，0.30.3H H2 20 02 2甲醇處理切片。甲醇處理切片。 (2)10(2)10卵蛋白卵蛋白TrisTris緩沖液處理緩沖液處理20min20min。 (3)(3)加加

29、第一抗體第一抗體3737孵育孵育60min60min或或44過夜。過夜。 (4)0.05M Tris-HCl(4)0.05M Tris-HCl，pH7.6pH7.6，洗滌，洗滌3 3次。次。 (5)(5)SPASPA(1ug(1ugm1)m1)孵育孵育15min15min，0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl溶液漂洗溶液漂洗3 3次。次。 (6)(6)PAPPAP復合物復合物( (無動物種屬限制無動物種屬限制) )孵育孵育15min15min。0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl溶液漂洗溶液漂洗3 3次。（次。（抗酶抗體抗酶抗體 + + 足量的酶足量的酶

30、 = = 形成穩(wěn)定的五角形復合物）形成穩(wěn)定的五角形復合物） (7)DAB(7)DAB顯色。顯色。 (8)(8)蘇木精復染，脫水，透明，封固。蘇木精復染，脫水，透明，封固。三、凝集素組織化學技術三、凝集素組織化學技術凝集素凝集素(1ectin)(1ectin)：從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，能凝集紅細胞。的蛋白，能凝集紅細胞。常用：常用：刀豆素刀豆素(ConA)(ConA)、麥胚素、麥胚素(WGA)(WGA)、花生凝集素、花生凝集素(PNA)(PNA)、 大豆凝集素大豆凝集素(SBA)(SBA)等等凝集素特性：

31、凝集素特性：凝集素具有多價結合的能力，能識別糖蛋白和糖肽，特別是細凝集素具有多價結合的能力，能識別糖蛋白和糖肽，特別是細胞膜中碳水化合物胞膜中碳水化合物抗原決定簇抗原決定簇，結合力為一專一性能，能與熒，結合力為一專一性能，能與熒光素、生物素、酶、膠體金及鐵蛋白等光素、生物素、酶、膠體金及鐵蛋白等示蹤物示蹤物結合，從而在結合，從而在光鏡、電鏡水平顯示其結合部位。因此凝集素可作為一種光鏡、電鏡水平顯示其結合部位。因此凝集素可作為一種探針探針來研究細胞膜上特定的糖基結構。來研究細胞膜上特定的糖基結構。凝集素受體是存在于細胞膜上的糖蛋白和糖脂中的寡糖，而凝集素受體是存在于細胞膜上的糖蛋白和糖脂中的寡糖

32、，而這種受體可區(qū)別細胞的類型和反映細胞在分化、成熟和在腫這種受體可區(qū)別細胞的類型和反映細胞在分化、成熟和在腫瘤細胞中的作用。瘤細胞中的作用。1 1 作為細胞分化成熟的標記作為細胞分化成熟的標記血細胞，特別是淋巴細胞的分群血細胞，特別是淋巴細胞的分群2 2 作為細胞特殊類型的標記作為細胞特殊類型的標記人視網(wǎng)膜人視網(wǎng)膜 視錐細胞（視錐細胞（PNA+PNA+）視桿細胞（）視桿細胞（PNA-PNA-）乳腺乳腺 乳腺上皮細胞（乳腺上皮細胞（PNA+PNA+）肌上皮細胞和間質(zhì)細胞（）肌上皮細胞和間質(zhì)細胞（PNA-PNA-）3 3 在腫瘤中凝集素結合的改變在腫瘤中凝集素結合的改變 PHAPHA胃癌診斷性標志

33、胃癌診斷性標志應用：應用：凝集素在免疫細胞化學中的應用方法：凝集素在免疫細胞化學中的應用方法： 1 1 直接法直接法 將標記物直接標記在凝集素上，與相應糖蛋白或糖脂結合。將標記物直接標記在凝集素上，與相應糖蛋白或糖脂結合。 (1) (1) 操作步驟操作步驟 1)1)切片脫蠟至水切片脫蠟至水( (或恒冷箱切片，冷丙酮固定，室溫干燥或恒冷箱切片，冷丙酮固定，室溫干燥) )。 2)32)3H H2 2O O2 2甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶101015min15min。3) 3) 過氧化物酶標記的花生凝集素過氧化物酶標記的花生凝集素，室溫，室溫30-60min30-60min。4) 0.01M PBS4) 0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。5) DAB5) DAB顯色。顯色。6) 6) 常規(guī)脫水、透明、封固。常規(guī)脫水、透明、封固。 (2) (2) 結果結果 陽性部位呈棕褐色陽性部位呈棕褐色 2 2 間接法間接法 細胞膜上的相應糖基細胞膜上的相應糖基+ +凝集素凝集素+ +標記的抗凝集素抗體標記的抗凝集素抗體操作步驟操作步驟