實驗一感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化

1、實驗一實驗一 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒及質(zhì)粒DNADNA的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?學習大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定的學習大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定的基本原理和操作技術(shù)?；驹砗筒僮骷夹g(shù)。二、實驗原理二、實驗原理u感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞(Competent Cells)(Competent Cells)：受體細胞經(jīng)過一些特殊方法：受體細胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，能允許外的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，能允許外源源DNADNA分子進入。分子進入。u轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(Transformat

2、ion)(Transformation)：將外源：將外源DNADNA分子引入受體細胞分子引入受體細胞, ,使之使之獲得新的遺傳性狀的一種手段獲得新的遺傳性狀的一種手段, ,它是微生物遺傳、分子遺傳、它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。u目前常用的轉(zhuǎn)化方法為目前常用的轉(zhuǎn)化方法為電轉(zhuǎn)化法電轉(zhuǎn)化法和和化學轉(zhuǎn)化法化學轉(zhuǎn)化法，電轉(zhuǎn)化法簡，電轉(zhuǎn)化法簡便易行，轉(zhuǎn)化效率高，但需要專門的電轉(zhuǎn)化儀；化學轉(zhuǎn)化不便易行，轉(zhuǎn)化效率高，但需要專門的電轉(zhuǎn)化儀；化學轉(zhuǎn)化不需要額外的設(shè)備，成本較低。需要額外的設(shè)備，成本較低。 u致敏過程：致敏過程：用理化方法誘導細胞進入

3、感受態(tài)的操作；用理化方法誘導細胞進入感受態(tài)的操作； 細菌處于細菌處于0 00 0C,CaClC,CaCl2 2低滲溶液中低滲溶液中, ,菌細胞膨脹成球形菌細胞膨脹成球形, ,外源外源DNADNA形成抗形成抗DNADNA酶的羥基酶的羥基- -鈣磷酸鹽混合物黏附于細胞表面鈣磷酸鹽混合物黏附于細胞表面, ,經(jīng)經(jīng)短時間短時間42420 0C C熱激處理熱激處理, ,促進細胞吸收促進細胞吸收DNADNA復合物；復合物；u復蘇：復蘇：細菌在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時間，使抗性的表細菌在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時間，使抗性的表型表達后再轉(zhuǎn)到含抗性的選擇性培養(yǎng)基上，長出來的菌落即型表達后再轉(zhuǎn)到含抗性的選擇性培

4、養(yǎng)基上，長出來的菌落即為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌落；為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌落；AmpAmpr r抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（- -內(nèi)酰胺酶）可特異地切割內(nèi)酰胺酶）可特異地切割AmpAmp的的- -內(nèi)內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力影響轉(zhuǎn)化效率的因素影響轉(zhuǎn)化效率的因素u 細菌的生長狀態(tài)細菌的生長狀態(tài)(5x10(5x107 7個個/mL)/mL)u 感受態(tài)細胞的質(zhì)量感受態(tài)細胞的質(zhì)量u 試劑的質(zhì)量試劑的質(zhì)量u 外源外源DNADNA的質(zhì)量與數(shù)量的質(zhì)量與數(shù)量u 器皿的潔凈度器皿的潔凈度u 污染污染盡量所有打開器皿蓋的操作都在超凈臺中進行盡量所有打開器皿蓋的操作都在超

5、凈臺中進行三、器材與試劑三、器材與試劑1.1.材料材料大腸桿菌菌株大腸桿菌菌株Top10Top10、重組重組質(zhì)粒。質(zhì)粒。2.2.設(shè)備設(shè)備恒溫搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺式高速離心機、超凈工作臺、低溫恒溫搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺式高速離心機、超凈工作臺、低溫冰箱、恒溫水浴鍋、分光光度計、微量移液槍、冰箱、恒溫水浴鍋、分光光度計、微量移液槍、1.5mL1.5mL離心管。離心管。3.3.試劑試劑LBLB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素母液液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素母液(Ampicillin, Amp)(Ampicillin, Amp)、含、含AmpAmp的的LBLB固固體培養(yǎng)基、體培養(yǎng)基、0.1mol/L CaCl0

6、.1mol/L CaCl2 2滅菌溶液，滅菌溶液，IPTG, x-galIPTG, x-gal。 四、實四、實 驗驗 流流 程程（一）感受態(tài)細胞的制備：（一）感受態(tài)細胞的制備：1. 1. 預培養(yǎng)：接一預培養(yǎng)：接一單菌落單菌落到到3mL LB3mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，37370 0C C、190rpm190rpm振蕩培振蕩培養(yǎng)過夜；養(yǎng)過夜；2. 2. 取取 0.4mL0.4mL預培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含預培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含40mL LB40mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，液體培養(yǎng)基的錐形瓶中， 37370 0C C、250rpm250rpm振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)2.52.53 3小時（小時（ODOD600

7、600 0.4 0.40.50.5）；）；3. 3. 將菌液轉(zhuǎn)移到將菌液轉(zhuǎn)移到1.5mL1.5mL離心管中，冰上放置離心管中，冰上放置10min10min；4. 4. 離心離心 5000rpm5000rpm，4 40 0C C，5min5min；5. 5. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置，使培養(yǎng)液流盡；倒出培養(yǎng)液，將管倒置，使培養(yǎng)液流盡；6. 6. 菌體加入菌體加入預冷預冷的的0.1 mol/L0.1 mol/L的的CaClCaCl2 2 1.0mL 1.0mL，輕吹輕吹并懸浮細胞，冰上并懸浮細胞，冰上10min10min；7. 7. 離心離心 5000rpm 5000rpm ，4 40 0C C，5m

8、in5min，去上清；，去上清；8. 8. 用冰預冷的用冰預冷的0.1 mol/L0.1 mol/L的的CaClCaCl2 2 100 100L L用槍用槍輕吹輕吹懸浮細胞，冰上操作；懸浮細胞，冰上操作；9.9.此為感受態(tài)細胞，若儲存則需加入此為感受態(tài)細胞，若儲存則需加入151530%30%甘油，可在甘油，可在-70-700 0C C或或-20-200 0C C凍存。凍存。（二）轉(zhuǎn)化及復蘇：（二）轉(zhuǎn)化及復蘇：1. 1. 取取 100 100 L L感受態(tài)細胞，加入重組感受態(tài)細胞，加入重組DNA 20 DNA 20 L L （50ng)50ng)； 取取 100 100 L L感受態(tài)細胞，加入感

9、受態(tài)細胞，加入20 20 L無菌水（陰性對照無菌水（陰性對照1 1）；）； 取取 100 100 L L感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞, ,加入對照加入對照DNA 20 DNA 20 L L （陰性對照（陰性對照2 2） 用槍頭用槍頭混勻混勻，冰上放置，冰上放置20min20min。 陰性對照的目的？陰性對照的目的？2. 422. 420 0C C循環(huán)水浴熱激循環(huán)水浴熱激9090秒秒3. 3. 冰浴冰浴2 2分鐘分鐘4. 4. 每管加每管加800800L LBL LB液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基，37370 0C C慢搖慢搖40min40min（120120140rpm140rpm）5. 45. 40 0C C，5000rpm5000rpm離心離心2min2min，棄去，棄去600600L L，取，取20205050L L菌液，加菌液，加4040L X-L X-galgal和和4 4L IPTGL IPTG，混勻后涂布在含，混勻后涂布在含AmpAmp的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)皿中6. 6. 倒置培養(yǎng)過夜（倒置培養(yǎng)過夜（ 37370 0C C）注意事項注意事項 1. 無菌操作無菌操作 2. 低溫操作（冰上操作）低溫操作（冰上操作） 3. 動作要輕柔動作要輕柔 1.如果陰性對照中長出菌落，可能的原因是什么