觀察上次課實驗結(jié)果

1、1、觀察上次課實驗結(jié)果2、革蘭氏染色法(Grams stain) 3、細(xì)菌的基本形態(tài)觀察4、細(xì)菌的特殊構(gòu)造觀察5、抗酸染色（Acid-fast stain)6、破傷風(fēng)外毒素試驗、內(nèi)毒素毒力 試驗 實驗二實驗二觀察上次課實驗結(jié)果觀察上次課實驗結(jié)果自然界細(xì)菌的分布自然界細(xì)菌的分布 1 1、水中細(xì)菌的檢查、水中細(xì)菌的檢查 2 2、空氣中細(xì)菌的檢查、空氣中細(xì)菌的檢查 3 3、手指細(xì)菌的檢查、手指細(xì)菌的檢查 4 4、口腔中細(xì)菌的檢查、口腔中細(xì)菌的檢查平板分離培養(yǎng)法平板分離培養(yǎng)法斜面培養(yǎng)基接種法斜面培養(yǎng)基接種法液體培養(yǎng)基接種法液體培養(yǎng)基接種法半固體半固體( (高層高層) )培養(yǎng)基接種法培養(yǎng)基接種法細(xì)菌生化

2、反應(yīng)細(xì)菌生化反應(yīng) 噴嚏中的細(xì)菌平板分離培養(yǎng)法 結(jié)果觀察:主要觀察菌落特征大?。河弥睆?mm)表示。一般直徑1mm左右的為小菌落；直徑23mm的為中等大小菌落；直徑3mm以上的為大菌落。 形狀：圓形、卵圓形及不規(guī)則形等。邊緣：整齊、鋸齒狀、毛發(fā)狀等。表面：光滑、皺紋、濕潤、干燥等。隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。顏色：無色、白色、黃色、檸檬色等。透明度：透明、不透明、半透明等。結(jié)構(gòu)：均質(zhì)性、顆粒狀等。溶血性：不溶血、草綠色溶血環(huán)、透明溶血環(huán)。 觀察菌落時，不要將從空氣中落入培養(yǎng)基而生長的雜菌誤認(rèn)為目的細(xì)菌。雜菌一般生長于劃線痕跡以外，或為形狀異常的個別孤立菌落。為避免上述情況發(fā)生，在接種時，應(yīng)避

3、免空氣中的雜菌落人培養(yǎng)基。 目前臨床檢驗常使用全自動培養(yǎng)儀，大大提高了培養(yǎng)的效率和質(zhì)量。如全自動快速血培養(yǎng)儀(BactAlertl20)能從血液和體液中快速檢出需氧菌、厭氧菌、L型細(xì)菌和真菌，一般24h內(nèi)檢出率達(dá)85，48h內(nèi)檢出率達(dá)95以上。v平板劃線法菌落：在固體培養(yǎng)基上形成的，菌落：在固體培養(yǎng)基上形成的， 肉眼可見的，具有一定形態(tài)肉眼可見的，具有一定形態(tài) 結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體不同的菌落在大小、形狀、不同的菌落在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一定的特征。等方面具有一定的特征。-（可作為菌種鑒定的依（可作為菌種鑒定的依 據(jù)）據(jù)） 固體培

4、養(yǎng)基：菌落，菌苔 大腸桿菌平板菌落 斜面培養(yǎng)基接種法實驗結(jié)果 細(xì)菌生長為均勻一致的菌苔,為純種。若有孤立菌落出現(xiàn)，則可能是接種時受到污染。液體培養(yǎng)基接種法實驗結(jié)果 細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長有三種形式：混濁生長(如大腸桿菌)；沉淀生長(如乙型溶血性鏈球菌)；菌膜生長(如枯草桿菌)。 液體培養(yǎng)基：表面生長 均勻混濁生長 沉淀生長 半固體(高層)培養(yǎng)基接種法實驗結(jié)果 無鞭毛的細(xì)菌培養(yǎng)后，僅沿穿刺線生長，穿刺線增粗，培養(yǎng)基清亮；有鞭毛的細(xì)菌，沿穿刺線向周圍生長，穿刺線模糊不清，培養(yǎng)基混濁。 半固體培養(yǎng)基：無動力 有動力細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果觀察糖發(fā)酵： 細(xì)菌如分解糖時，則產(chǎn)酸，使指示劑變色(一般記錄符號是“+

5、”)；有些細(xì)菌在分解糖的同時還產(chǎn)生氣體，則倒立小管中有氣泡出現(xiàn)(記錄符號為“”)；如細(xì)菌不分解該糖時，指示劑不變色，不見培養(yǎng)液混濁(記錄符號為“-”)。葡萄糖 HCOOH 脫氫酶 CO2+H2 靛基質(zhì)試驗 取出后滴加數(shù)滴靛基質(zhì)指示劑于培養(yǎng)基的液面上，接觸面上形成玫瑰紅色看為陽性，仍呈黃色者為陰性。若顏色不明顯，可再加45滴乙醚，振蕩試管使乙醚分散于液體中，若培養(yǎng)液中有靛基質(zhì)存在，就可被提取至乙醚層中，顏色較為明顯。I-I-吲哚（吲哚（indolindol）試驗）試驗色氨酸色氨酸吲哚吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚 吲哚試劑吲哚試劑 - + 硫化氫產(chǎn)生試驗 乙型副傷寒桿菌、變形桿菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸

6、，生成硫化氫， 使培養(yǎng)基變成黑褐色。 +（FeS黑色） 尿素酶試驗 尿素分解試驗變形桿菌能迅速(24h)分解尿素而產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性而變成紫紅色，視為陽性反應(yīng)。 I M Vi C試驗 大腸埃希菌 + + - - 產(chǎn)氣桿菌 - - + + 雙糖含鐵培養(yǎng)基上層為固體乳糖 下層為半固體葡萄糖革蘭氏染色法(Grams stain) 實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模?初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法的初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法的 操作技術(shù)，理解其在鑒別細(xì)菌上的意義。操作技術(shù)，理解其在鑒別細(xì)菌上的意義。實驗原理 (1)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異。G+菌細(xì)胞壁肽聚糖層數(shù)多，且肽聚糖為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再經(jīng)乙醇脫水

7、，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致密，結(jié)晶紫腆復(fù)合物不易從細(xì)胞內(nèi)漏出，仍為紫藍(lán)色。而G-菌細(xì)胞壁較為疏松，肽聚糖層很薄，且為平面結(jié)構(gòu)，外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被乙醇溶解，使細(xì)胞壁通透性增高，結(jié)晶紫碘復(fù)合物容易漏出，使細(xì)菌被脫色，再經(jīng)石炭酸復(fù)紅染成紅色。(2) G+菌含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結(jié)晶紫碘結(jié)合成更大分子復(fù)合物，不易脫色；而G-菌中此種物質(zhì)含量甚少，故易于脫色。(3) G+菌等電點(pH約為2-3)比G-菌等電點(pH約為4-5)低，在同樣的pH染色環(huán)境中， G+菌所帶的陰電荷比G-菌多，故與帶陽電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較為牢固，不易脫色。 實驗材料 (1)葡萄球菌與大腸桿菌24h斜面培養(yǎng)物或

8、肉湯培養(yǎng)物。 (2)革蘭氏染色液包括結(jié)晶紫染液；盧戈氏碘液；乙醇(體積分?jǐn)?shù)為95)；稀釋的石炭酸復(fù)紅。 (3)生理鹽水、載玻片、接種環(huán)等。實驗方法 (一)涂片標(biāo)本的制作 (1)涂片。先將接種環(huán)火焰滅菌，稍冷卻后取菌液一滴，于載玻片上涂一層均勻的膜，直徑約1 cm。如用斜面培養(yǎng)物作涂片時，應(yīng)先取一滴生理鹽水，滴于玻片中央，再取少量純菌，混于鹽水中，然后再涂片。 (2)干燥。置于空氣中自然干燥，或置于火焰上方略加烘烤，使液體干燥。 (3)固定。將玻片(菌膜面朝上)從火焰中部反復(fù)通過3次，使細(xì)菌固著于載玻片上并殺死大部分細(xì)菌。 (二)染色 (1)初染。吸取結(jié)晶紫染液滴于涂膜上，染色1min，水洗。

9、(2)媒染。加盧戈氏碘液媒染1min，水洗。 (3)脫色。用體積分?jǐn)?shù)為95的乙醇脫色，脫色時輕輕搖動玻片，直到涂膜上的染色不再脫落為止，約2030s，迅速水洗。 (4)復(fù)染。滴加稀釋的石炭酸復(fù)紅染051min，水洗。 (三)觀察 干燥后(或用吸水紙吸干水分)，油鏡下觀察。 實驗結(jié)果： 染成紫藍(lán)色的為C+菌。染成紅色的為C-菌。 革蘭染色操作步驟注意事項注意事項 ： 1. 涂片務(wù)求均勻，切忌過厚。 2在染色過程中，不可使染液干涸。 3酒精脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會使陰性菌被染成陽性菌。另外，脫色時間的長短還受涂片厚薄的影響，一般做到取菌要少，涂膜薄

10、而均勻為好。 4被檢菌的菌齡一般最好在1824h之內(nèi)，因為被檢菌的培養(yǎng)條件、營養(yǎng)成分、菌齡的不同會影響染色結(jié)果，如C+菌的陳舊培養(yǎng)物也可出現(xiàn)革蘭氏染色陰性結(jié)果。大腸桿菌革蘭氏染色 染色顯示染色顯示革蘭氏陰性陽性細(xì)菌革蘭氏陰性陽性細(xì)菌細(xì)菌的基本形態(tài)觀察細(xì)菌的特殊構(gòu)造觀察 土壤中分離的熒光假單胞菌白喉桿菌白喉桿菌異染顆粒異染顆?？顾崛旧ˋcid-fast stain)目的：1、掌握抗酸染色法。2、掌握結(jié)核桿菌的形態(tài)、染色特點。原理： 抗酸性細(xì)菌如結(jié)核桿菌等，細(xì)胞壁中含有豐富的脂類，其中分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅結(jié)合成牢固的復(fù)合物，能抵抗3鹽酸酒精的脫色作用，而使菌體保持紅色，故稱抗酸染色法。 材料：肺結(jié)核患者痰液，抗酸染色液（石炭酸復(fù)紅、3鹽酸酒精、堿性美藍(lán)），載玻片，酒精燈，等。方法：1、涂片：用接種環(huán)挑取痰液涂片，在空氣中干燥，經(jīng)火焰固定。2、初染：用木夾持玻片，滴加石炭酸復(fù)紅液于涂膜上，于火焰高處徐徐加熱直至有蒸汽出現(xiàn)（不可沸騰）。當(dāng)染液蒸發(fā)時，應(yīng)將載玻片離開火焰，及時滴加染液。如此反復(fù)數(shù)次，維持約5min。玻片冷卻后水洗。3、脫色：用3鹽酸酒精脫色，至無紅色染液流下為止，一般需12min，然后水洗。4、復(fù)染：用堿性美藍(lán)液復(fù)染1mi