表達天氣熱的愛情說說：全世界只有一個自己

1、第六章 化學(xué)檢測n根據(jù)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)而對物質(zhì)進行定量、定性測定。n應(yīng)用最早、最廣泛的檢測技術(shù)n簡便、快速、操作容易http:/ 糖類的化學(xué)檢測n糖類包括多糖、雙糖、單糖n單糖和某些雙糖具有游離羰基還原糖n多糖和蔗糖等無還原性非還原糖n糖類化學(xué)檢測主要是利用游離羰基的還原性質(zhì)，與試劑（氧化劑）進行氧化還原反應(yīng)而進行測定的。n非還原糖必須轉(zhuǎn)化為還原糖再進行測定n最常用的試劑：斐林（Fehling）試劑n基本組成：A：CuSO4溶液 B: NaOH和酒石酸鉀鈉溶液 使用時A、B等體積混合(生成酒石酸鉀鈉銅）n酒石酸鉀鈉銅是氧化劑，可與還原糖的游離羰基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而進行糖的測定。定糖常用方法n1

2、 蘭愛農(nóng)（Lane-Eynon）法n次甲基藍（亞甲基藍、四甲基藍）法、置換法、直接滴定法n反應(yīng)終點用次甲基藍指示劑顯示（還原糖滴定斐林試劑，由于次甲基藍氧化能力比二價銅弱，待二價銅全部還原后，過量1D還原糖使次甲基藍還原，藍色消失）n多糖或其他非還原糖需轉(zhuǎn)化為還原糖后再滴定 如淀粉，可用酸解或酶解操作要點n（1 ）斐林試劑的標定n（a）標定預(yù)備試驗 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，2D1次甲基藍溶液，用標準葡萄糖液滴定至藍色消失，耗標準葡萄糖液（0.1或0.2）V1mL。n（b）標定nA、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）搖勻，從滴定管中預(yù)先加入（V1-

3、1)mL標準葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，2D1次甲基藍溶液，用標準葡萄糖液滴定至藍色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標準葡萄糖液的總毫升數(shù)V0n(2) 定糖n（a）定糖預(yù)備試驗nA、B各5mL10mL樣品糖液（250mL三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，2D1次甲基藍溶液，用標準葡萄糖液滴定至藍色消失，耗標準葡萄糖液（0.1或0.2）V2mL。n（b）定糖nA、B各5mL10mL樣品糖液（250mL三角瓶中）搖勻，補加（V0-V2）mL水，并從滴定管中預(yù)先加入（V2-1)mL標準葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，2D1次甲基藍溶液，用標準葡萄糖液滴定至藍色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消

4、耗標準葡萄糖液的總毫升數(shù)Vn(3) 計算n還原糖含量（以葡萄糖計） （V0-V) c (1/10 )nn注意：n（a）AB分開儲存，防止Cu+變化，臨用混合n（b）單標移液管吸液準確，外壁也需擦干凈n（c）體積需控制在一定范圍內(nèi)，對pH有影響n（d）煮沸時間要一致n（e）注意指示劑加入時間和加入量一致n（f）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min內(nèi)完成）n（g）產(chǎn)物Cu2O不穩(wěn)定，次甲基藍變色也不穩(wěn)定，暴露于空氣或沸騰顏色變化，滴定過程不能搖動，不可中途中止加熱 n斐林試劑快速法：斐林試劑快速法：n在斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽）反應(yīng)終點為藍色消失，淡黃色出現(xiàn)。反應(yīng)終點比蘭愛農(nóng)法更為明

5、顯。2 碘量法nI2 NaIO(氧化劑），其氧化能力較弱，僅適用于醛糖的測定，與酮糖不起反應(yīng)n操作要點：n（1）標準硫代硫酸鈉溶液配制，0.05 mol/L，沸騰后冷卻水配制，存放在棕色瓶中，一周后用標準重鉻酸鉀標定。n（2）標準碘液配制，0.1mol/Ln（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸鈉滴定試劑中全部碘n碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液15mL0.1 mol/LNaOH5mL空白液，搖勻后暗反應(yīng)15min1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至淺黃色，加0.2mL0.5淀粉液作指示劑，滴定至藍色消失，記錄V0n(4)樣品滴定：以5mL樣品液代替空白液， V1

6、n(5) 計算：n醛糖含量 （V0 V1）C M nn注意：暗反應(yīng)后需酸化再滴定，滴定時開始輕搖（碘揮發(fā)），后再搖（淀粉吸附碘）n配合次甲基藍法測定某些糖含量（如果糖）配合次甲基藍法測定某些糖含量（如果糖）3 銅試劑法n將還原糖與二價銅離子反應(yīng)生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸鈉滴定反應(yīng)液中剩余的碘而測定樣品還原糖的含量。n（1）銅試劑的配制 主要提供二價銅離子及碘n（2）標準曲線的制作n（a)標準葡萄糖液的配制 0.1%或0.05（根據(jù)所用銅離子試劑定）n（b)三角瓶編號 1 2 3 4 5 6 葡萄糖標準液（mL ) 0 1 2 3 4 5 蒸餾水（mL ) 5 4 3 2 1 0 銅試

7、劑（mL ) 5 5 5 5 5 5 沸水浴10min，冷卻至室溫n（c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振蕩，待紅色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸鈉滴定至終點，記錄耗用量Vn(d) 繪標準曲線n葡萄糖含量（mg）為縱坐標，（V0-V)為橫坐標二 蛋白質(zhì)和氨基酸的化學(xué)檢測n蛋白質(zhì)含氮量幾乎恒定，平均16n測出N含量6.25，即為蛋白質(zhì)量n 含氮量 每gN相當P肉、蛋、豆 16 6.25n面粉 17.6 5.70n奶品 15.7 6.38n花生 18.2 5.50n鮭精蛋白 31.5 3.17蛋白質(zhì)常用檢測方法1 定氮法（經(jīng)典的，仲裁的）常用凱氏定氮法或微量凱氏定氮法（1）原理消化、蒸餾、吸收

8、、滴定計算（2）操作要點 (a) 消化：凱氏定氮瓶，樣品K2SO4-CuSO4、濃H2SO4, 通風(fēng)廚內(nèi)進行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。n(b)蒸餾：防止漏氣n(c)吸收：5mL2H3BO3甲基紅溴甲酚綠幾滴或一定量標準酸溶液（如25mL 0.05mol/L H2SO4)n(d)滴定計算： H3BO3吸收：0.01mol/LHCl滴定至綠色 淡紫紅色 樣品中的總氮量（mg)=（A-B)C14n 標準硫酸接收：0.1mol/L標準NaOH滴定，甲基紅黃色終點 樣品中總氮量=（C1V1-C2V2) 14nn粗蛋白含量樣品的總氮量粗蛋白含量樣品的總氮量6.252 雙縮脲試劑法測定蛋白質(zhì)n縮

9、脲CuSO4、NaOH 紫紅色化合物nA C縮脲n蛋白質(zhì)含有兩個以上脲鍵，有雙縮脲反應(yīng)n蛋白質(zhì)（多肽） CuSO4 （ NaOH） 銅鈉雙縮脲絡(luò)合物nA Cp，與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無關(guān)nTris緩沖液干擾P的測定，測定范圍110 mg/mLn操作：n（1）雙縮脲試劑的配制 CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、0.1%KIn (2) 標準曲線的制作1標準酪蛋白(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸餾水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0雙縮脲試劑 (mL) 4 4 4 4 4 4室溫反應(yīng)30min測A540n (3)樣品測定 1mL4mL雙縮脲試劑 ，30m

10、in，測A5403 福林酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量n雙縮脲法的發(fā)展，靈敏100倍，需時較長，對雙縮脲反應(yīng)有干擾的物質(zhì)對其影響更大，酚類和檸檬酸也有干擾。n堿性銅試劑雙縮脲反應(yīng)n稀釋的苯酚試劑與酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反應(yīng)呈藍色n兩種呈色反應(yīng)可疊加n操作：n（1）福林酚試劑的配制n甲液：堿性銅試劑（A、NaOH、NaCO3, B、CuSO4和酒石酸鉀鈉)n乙液：稀釋的苯酚試劑n（2）標準蛋白溶液配制n結(jié)晶牛血清蛋白溶于0.9NaCl或用酪蛋白（凱氏定氮法測定含量）n（3）標準曲線制作n（4）樣品測定n1mL樣品（含P15500 g）5mL甲液，室溫10min，乙液0.5mL，混勻，室溫30min

11、，測A500750蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測n概念：免疫化學(xué)檢測、抗體、抗原、凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)n檢測方法：n（1）凝集反應(yīng)n效價測定，細菌、病毒分類n（2）沉淀反應(yīng)n沉淀反應(yīng)、界面（環(huán)狀）試驗、免疫擴散、免疫電泳、免疫親和層析、免疫熒光檢測等氨基酸含量測定方法n1 茚三酮顯色法n微酸性條件下，氨基酸茚三酮反應(yīng)生成紫色化合物，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物n取1mL樣品溶液（含氨基酸0.150ug)加1mL緩沖液（pH5.06.7），再加1mL茚三酮顯色液，100 水浴15min，自來水冷卻后，加入3mL60乙醇溶液，測定OD570，脯氨酸或羥脯氨酸測OD4402 甲醛滴定法測

12、定氨基酸n氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能用一般酸堿指示劑通過氫氧化鈉來測定。n加進甲醛生成羥甲基衍生物，可以用堿滴定。n注意：需用過量中性甲醛。三 核酸的化學(xué)檢測n根據(jù)核酸所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等進行檢測。n1 定磷法測定核酸含量n（1）核酸的消化n（2）磷的測定 定磷試劑，45 水浴25min，冷卻至室溫測OD650 無機磷標準液作標準曲線n（3）核酸含量的計算一般DNA含磷9.5,RNA含磷9.2，RNA量（總磷量無機磷量）10.9DNA量 （總磷量無機磷量）10.52 二苯胺法測定DNA含量nDNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍色反應(yīng)，在595nm處有最大吸收峰。在40400 g范圍內(nèi)，OD595與DNA濃度成正比。少量乙醛可提高反應(yīng)靈敏度。n（1）二苯胺試劑的配制n（2）標準曲線制作n（3）樣品DNA含量測定3 地衣酚法測定RNA含量n核糖核酸在濃鹽酸和三氯化鐵的存在下，與3，5二羥甲苯（地衣酚）反應(yīng)，生成綠色物質(zhì)。一定濃度范圍內(nèi)，OD670與RNA濃度成正比。所有戊糖均可進行此反應(yīng)，注意干擾（如DNA）。n操作： 地衣酚試劑配制；標準曲線制作；樣品RNA測定