王鏡巖生物化學講義蛋白質PPT學習教案

1、會計學1王鏡巖生物化學講義王鏡巖生物化學講義 蛋白質蛋白質52.552.57 721.521.516160.80.80 0101020203030404050506060百分含量（W%）百分含量（W%）蛋蛋 白白 質質 元元 素素 組組 成成C CH HO ON N其其它它CHON其它50556.57.319241519微量蛋白質的元素組蛋白質的元素組成成第1頁/共121頁特點：含氮量較恒定，一般在16%左右蛋白質系數(shù)蛋白質系數(shù)6.25 蛋白質含量 = 樣品含氮量6.25 微量元素百分率（%） 微量元素百分率（%）Fe00.8S0.232.4Cu IZn P00.8Mn第2頁/共121頁第二節(jié)

2、第二節(jié) 氨基酸氨基酸COOH|H2N C H|R非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸氨基酸氨基酸蛋白氨基酸蛋白氨基酸基本（常見）氨基酸基本（常見）氨基酸稀有（不常見）氨基酸稀有（不常見）氨基酸一、結構特點與分類：1.結構特點結構特點：所有20 種基本氨基酸的結構通式為特點特點：-氨基酸 (脯氨酸除外) L-氨基酸（甘氨酸除外）第3頁/共121頁中文：如 甘氨酸；英文：三字母符號（Gly）和單字母符號（G）2.分類分類：分類原則在生理pH條件下，氨基酸R基的帶電性。 據(jù)此原理，20種氨基酸共分為四組： 非極性R基氨基酸 極性不帶電荷R基氨基酸 帶負電荷R基氨基酸 （酸性氨基酸） 帶正電荷R基氨基酸（堿性氨基

3、酸）表示表示：第4頁/共121頁3.稀有氨基酸稀有氨基酸：蛋白質合成后在基本氨基酸基礎上經加工修飾而生成的氨基酸。4羥基脯氨酸羥基脯氨酸NHCOOHNHCOOHOHNH2CH2CH2CH2CH2CHCOOHNH2賴氨酸賴氨酸OH5羥基賴氨酸羥基賴氨酸OH第5頁/共121頁二、必需氨基酸（8種）： 人體不能自我合成，必須從外界中攝取的氨基酸人體不能自我合成，必須從外界中攝取的氨基酸賴氨酸 Lys、蘇氨酸 Thr、亮氨酸 Leu、異亮氨酸 Ile、苯丙氨酸 Phe、甲硫氨酸 Met、纈氨酸 Val、色氨酸 TrpGO第6頁/共121頁氨基酸氨基酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸苯丙氨酸色氨酸甲硫氨酸脯氨

4、酸三字母三字母 符號符號 Ala Val Leu Ile Phe Trp Met Pro單字母單字母符號符號 A V L I F W M P非非 極極 性性 R 基基 氨氨 基基 酸酸 結構結構式式CHCOONH3_+NH2COO_+CHCOONH3_+CHCOONH3_+CHCOONH3_+CHCOONH3_+CHCOONH3_+CHCOONH3_+CH3SCH2CH3CH2CHCH3CH3CH3CHCH3CH2CH2CHCH3CH2CH3CH2第7頁/共121頁NH2COCH2CH2CHCOO|NH3HCHCOO|NH3HOCH2CHCOO|NH3 |CH3HOCHCHCOO|NH3HSC

5、H2CHCOO|NH3CH2HOCHCOO|NH3NH2COCH2CHCOO|NH3結構式結構式氨基酸氨基酸甘氨酸絲氨酸蘇氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰胺谷氨酰胺三字三字母母 符號符號 Gly Ser Thr Gys Tyr Asn Gln單字單字母母 符號符號 G S T C Y N Q 極 性 不 帶 電 荷 R 基 氨 基 酸 第8頁/共121頁NH3CH2CH2CH2CH2CHCOO|NH3NH2CNHCH2CH2CH2CHCOO|NH3NH2|HNNH+CH2CHCOO|NH3OOCCH2CH2CHCOO|NH3OOCCH2CHCOO|NH3氨基酸氨基酸天冬氨酸谷氨酸三字母三字母 符號符號

6、 Asp Glu單字母 符號 D E K R H Lys Arg HIs賴氨酸精氨酸組氨酸酸 性 R 基 氨 基 酸 堿性R 基氨基酸 結構結構式式第9頁/共121頁三、氨基酸的理化性質1.1.一般性質一般性質：溶解度：可溶于水、稀酸、稀堿中 旋光性：丙氨酸 +1.8、半胱氨酸 -16.5、 脯氨酸 -86.0 熔點：大部分在200以上，丙氨酸297、絲氨酸2802.2.兩性解離和等電點兩性解離和等電點：氨基酸由酸性基團和堿性基團，可以發(fā)生兩性解離：RCHCOO-NH3+RCHCOO-NH2RCHCOOHNH3+k1k2R+RR酸 堿 第10頁/共121頁等電點定義：某一氨基酸的凈電荷等于零時

7、的溶液pH值為該氨基酸的等電點不同的氨基酸有不同的等電點等電點時的特點：溶解度下降用途用途：可根據(jù)氨基酸的等電點來分離不同氨基酸，如味精生產時將pH值調到3.22，谷氨酸沉淀下來。氨基酸理化性質氨基酸理化性質第11頁/共121頁pI計算法：計算法： pI=（pK左+pK右 ）/2 pK左 : pI處左側pK 值， pK右 :pI處右側pK 值。 如：甘氨酸的兩性解離為：酸 堿 HCHCOOHNH3+HCHCOONH2HCHCOONH3R+R-+R+k1k2pK1 =2.34 pk2 =9.60 pI=(2.34+9.60)/2=5.97氨基酸理化性質氨基酸理化性質第12頁/共121頁CHCOO

8、NH3(CH2)4NH3H+CHCOONH3(CH2)4NH3+CHCOONH3(CH2)4NH+22CHCOONH(CH2)4NH2k2k1k3R+R+ _R_R+_賴氨酸的兩性解離為：與等電點有關的pK值為：pK2 =8.95 pK3 =10.53 pI=9.74 一、二、三組氨基酸：pI=（pK1+pK2 ）/2 第四組氨基酸：pI=（pK2 +pK3 ）/2氨基酸理化性質氨基酸理化性質第13頁/共121頁3. 吸收光譜吸收光譜：所有20種基本氨基酸在可見光區(qū)都無光吸收，在近紫外區(qū)三種芳香氨基酸具有紫外吸收，即：苯丙氨酸257nm、酪氨酸275nm、色氨酸280nmGO氨基酸理化性質氨基

9、酸理化性質第14頁/共121頁氨基酸表觀解離常數(shù)和等電點氨基酸表觀解離常數(shù)和等電點氨基酸 pK1(COOH) PK2(NH3+) PK3(R 基) pI 甘氨酸 丙氨酸 纈氨酸 亮氨酸 異亮氨酸 絲氨酸 蘇氨酸 天冬氨酸 天冬酰胺 谷氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 賴氨酸 組氨酸 半胱氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 脯氨酸 2.34 2.34 2.32 2.36 2.36 2.21 2.63 2.09 2.02 2.19 2.17 2.17 2.18 1.82 1.71 2.28 1.83 2.20 2.38 1.99 9.60 9.69 9.62 9.60 9.68 9.15 10.43

10、9.82 8.80 9.67 9.13 9.04 8.95 9.17 8.33 9.21 9.13 9.11 9.39 10.63 3.86（COOH） 4.25 (COOH) 12.48 (胍基) 10.53（氨基） 6.00（咪唑基） 10.08（OH） 10.07 (OH) 5.97 6.02 5.97 5.98 6.02 5.68 6.53 2.97 5.41 3.22 5.65 10.76 9.74 7.59 5.02 5.75 5.48 5.66 5.89 6.30 第15頁/共121頁 用途：可用于氨基酸的定性和定量測定 脯氨酸是亞氨基酸，只有一步反應，反應產物為。水合茚三酮還原

11、茚三酮氨基酸產物（藍紫色,m = 570nm ）OOOHHOOOHOH+NH3+OOOONOOOHOH+RCHCOOHNH2OOOHH+RCOH+CO2+NH34. 氨基酸的重要化學反應 （1）茚三酮反應）茚三酮反應氨基酸理化性質氨基酸理化性質第16頁/共121頁（2）Sanger反應反應 氨基酸與二硝基氟苯（DNFB）反應，生成二硝基苯代氨基酸（DNP氨基酸）NO2O2NF NH2 CH COOHRO2NNO2NH CH COOHRHF+二硝基氟苯氨基酸DNP氨基酸(黃色)室溫用途：測定肽鏈N-端氨基酸氨基酸理化性質氨基酸理化性質第17頁/共121頁（3）Edman反應反應 異硫氰酸苯酯與氨

12、基酸反應生成PTH氨基酸NCS+NH2CHCOOHNH2NCNHCHCOHOHNCNHCHCOCH3NO2H+異硫氰酸苯脂（PITC）弱堿PTC氨基酸PTH氨基酸氨基酸理化性質氨基酸理化性質用途：蛋白質一級結構序列測定第18頁/共121頁 5.氨基酸的分離方法氨基酸的分離方法（1）分配層析）分配層析 固定相，流動相ABRf = B/A Rf ：遷移率氨基酸理化性質氨基酸理化性質層析缸層析濾紙層析液流動相：正丁醇固定相：水溶劑前沿點樣線原點氨基酸色點第19頁/共121頁樣品1樣品2被交換離子洗脫液+（2）離子交換層析）離子交換層析氨基酸理化性質氨基酸理化性質離子交換劑配對離子氨基酸平衡離子第20

13、頁/共121頁第三節(jié)第三節(jié) 肽肽 一、概念：二、書寫方式：左右，N C，可用英文或中文簡寫，中間用一短杠相連，氨基端加“H”，羧基端加“OH”，每一個氨基酸要叫氨基酸殘基。 例： H-丙-甘-谷-精苯丙-組-OH H-Ala-Gly-Glu-ArgPhe-His-OH 主肽鏈 多肽鏈中由共價鍵連接成的連續(xù)的鏈狀結構 肽單位 主肽鏈中的重復單位N 端C 端肽單位肽單位NH2CHCRNHCHCROONHCHCORNHCHCRNHCHROCOOH第21頁/共121頁由于有巰基，所以有氧化還原反應 GSH + GSH GSSG + 2H+ +2e-谷胱甘肽是生物體內重要的氧化還原物質，對細胞起到了保護

14、作用，另外，還是其他細胞保護劑的還原劑三、重要的寡肽及其作用 谷胱甘肽（GSH）：谷氨酸半胱氨酸甘氨酸CHHOOCCH2CH2CNH2NHCHCCH2SHONHCH2COOHO第22頁/共121頁第23頁/共121頁第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質結構蛋白質結構一、一、一級結構一級結構：定義定義：蛋白質的多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵位置 特點特點：基礎結構，穩(wěn)定結構 牛胰島素的一級結構（局部）：牛胰島素由A、B兩條肽鏈組成，A鏈20個氨基酸殘基，B鏈30個氨基酸殘基 二、二級結構二、二級結構：（：（1）概念概念：二級結構定義在規(guī)則氫鍵指導下局部多肽鏈在空間的排列方式 由于單鍵可以自由旋轉，所以從理

15、論上說肽鏈有無數(shù)種構象，但實際上，蛋白質的二級結構只有少數(shù)幾種，這是由于肽鏈在形成空間結構時要受到多種因素的限制，這些因素有：SSH-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser- AH-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- BSS第24頁/共121頁CNOHCC肽鍵平面由于肽鍵的雙鍵性質，使得形成肽鍵的N、C原子以及它們相連的四個原子形成一個平面，這個平面就叫肽鍵平面。形成的原因：p共軛，肽鍵不能自由旋轉 結果：形成剛性平面第25頁/共121頁OCCNCOHRNHCOCCNCOHRN

16、HH二面角 和兩個構象角稱為二面角NNOOCCCCCHH第26頁/共121頁非鍵合原子之間最小接觸距離 （nm） C N O H C N O H 0.32 0.29 0.27 0.28 0.27 0.27 0.24 0.24 0.24 0.20 0.27 非鍵合原子之間最小接觸距離第27頁/共121頁 螺旋：要點：單鏈、右旋，一圈3.6殘基，上升0.54nm，形成51氫鍵且全部平行，R基指向外側（2）種類（4類）：第28頁/共121頁折疊：肽鏈伸展，形成鏈間氫鍵（成為片層），R-基處于片層上下第29頁/共121頁反平行折疊CNCCNCOHOHCNCCNCOHOHCNOHCNCCNCOHOHCN

17、CCNCOHOHCNOH平行折疊折疊有平行和反平行兩種第30頁/共121頁 轉角（回折）：肽鏈180旋轉，氫鍵連接；無規(guī)則卷曲轉角第31頁/共121頁卵溶菌酶無規(guī)則卷曲第32頁/共121頁三、超二級結構三、超二級結構：概念：相鄰二級結構單元 相互作用形成的聚合體DE 種類：（A） X(B、C) 曲折（D） 回形拓撲結構(E)第33頁/共121頁四、結構域四、結構域：概念：蛋白質分子中在空間相對獨立的三維實體。乳酸脫氫酶結構域刀豆蛋白結構域彈性蛋白酶三級結構與結構域免疫球蛋白G第34頁/共121頁例：肌紅蛋白。是肌肉中運輸氧的蛋白質，一條肽鏈，153個氨基酸殘基，分子量為16700，含一個血紅素

18、輔基，氧分子就結合在它的鐵上。整個分子有8個-螺旋，并且有-轉角和無規(guī)則卷曲，但是無-折疊 。又如：卵溶菌酶五、三級結構五、三級結構：定義：蛋白質分子中所有原子的空間排列第35頁/共121頁特點： 高低不平IgG的結構疏密不一 近似球狀醛糖脫氫酶第36頁/共121頁NH3+COO-OHSHCH3CHCH2CH3CH3CH3CHCH3CH3 外親內疏第37頁/共121頁如：血紅蛋白含有四個亞基，為22，每個亞基含一個血紅素，每個血紅素可結合一個氧分子。亞基含141個氨基酸殘基，亞基含146個氨基酸殘基。亞基與肽鏈的區(qū)別，亞基 是指寡聚蛋白中非共價連接的亞單位，它可以是一條肽鏈，也可以是通過共價鍵

19、連接起來的幾條肽鏈。亞基和原體 原體是指寡聚蛋白中等同的結構成分，有時原體就是一個亞基，但有時是幾個亞基。如血紅蛋白的亞基數(shù)為四個，但其原體數(shù)為二個。-亞基-亞基 -亞基 -亞基血紅素血紅素Fe2+Fe2+Hemoglobin空間結構六、四級結構六、四級結構：概念：蛋白質分子中亞基在空間的排列第38頁/共121頁 氫鍵、鹽鍵、疏水作用力、二硫鍵、配位鍵、范德華引力 氫鍵鹽鍵疏水作用力二硫鍵配位鍵范德華引力二級結構三級結構四級結構七、維持蛋白質空間結構的作用力七、維持蛋白質空間結構的作用力第39頁/共121頁第40頁/共121頁第41頁/共121頁第42頁/共121頁第43頁/共121頁第44頁

20、/共121頁第45頁/共121頁第46頁/共121頁第47頁/共121頁第48頁/共121頁一、蛋白質的功能：催化、運轉、運動、能量交換、免疫、激素、調節(jié)、結構、貯存二、一級結構與功能的關系：一級結構與功能有密切的關系一級結構與功能有密切的關系1. 氨基酸對功能的重要性氨基酸對功能的重要性 如果改變的氨基酸是蛋白質執(zhí)行功能所必需的，則這種氨基酸的改變對功能的影響極大，如果改變的氨基酸對功能無貢獻，則它們的改變基本不影響蛋白質的功能。 如RNA酶，如果將其N-端的三個氨基酸去掉，酶的功能基本不變，但是，如果將組12改變，則酶失去活性。 第五節(jié)第五節(jié) 結構與功能的關系結構與功能的關系第49頁/共1

21、21頁鐮刀狀貧血?。壕褪怯捎谘t蛋白-鏈上第六位的谷氨酸被纈氨酸代替，使得血紅蛋白分子在氧分壓低的情況下容易聚合，形成桿狀多聚體，致使紅細胞由正常的圓盤狀成為鐮刀狀，血液流動受到阻礙。正常血紅細胞鐮刀型血紅細胞分子病這種由于遺傳突變引起的蛋白質分子一級結構發(fā)生改變而產生的疾病稱為分子病。第50頁/共121頁同源蛋白：不同生物中具有同一功能的蛋白質。它們的特點是其一級結構中，與功能直接相關的殘基相同，而其它殘基有差異，這些殘基是可以改變的，這種變化往往與生物進化有關。例：Cytc與進化生 物 殘基改變數(shù) 生 物 殘基改變數(shù) 生 物 殘基改變數(shù)黑猩猩 0 狗 11 狗魚 23恒河猴 1 騾 11

22、蛾 31兔 9 馬 12 小麥 35袋鼠 10 雞、火雞 13 面包霉 43鯨 10 響尾蛇 14 酵母 44牛、豬、羊 10 韌齒龜 152. 種屬差異與分子進化種屬差異與分子進化第51頁/共121頁一定的結構，一定的功能一定的結構，一定的功能結構變化，功能變化結構變化，功能變化結構破壞，功能破壞結構破壞，功能破壞三、空間結構與功能的關系三、空間結構與功能的關系第52頁/共121頁MbMb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第53頁/共121頁MbMb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第54頁/共121頁MbMb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第55頁/共121頁MbMb的構象與功能的

23、關系的構象與功能的關系第56頁/共121頁MbMb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第57頁/共121頁MbMb的構象與功能的關系的構象與功能的關系(Mb(Mb結合氧的的定量分析結合氧的的定量分析) )第58頁/共121頁HbHb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第59頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第60頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第61頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第62頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第63頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第64頁/共121頁Hb的構象與

24、功能的關系的構象與功能的關系第65頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第66頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第67頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系第68頁/共121頁Hb的構象與功能的關系的構象與功能的關系不同BPG濃度對Hb氧和曲線的影響第69頁/共121頁Mb Mb 和和 HbHb功能的異同：功能的異同：1.Mb只有輸氧，Hb除了輸氧外還有運輸 H+ 和CO2的功能 2.Hb是一個至今了解的最清楚的別構蛋白, 具有正協(xié)同性 3.Hb中的氧合曲線呈“S”型，Mb呈雙曲線 4.H+ 、CO2 起到緩沖血液pH的作用 (組織呼吸釋放的

25、CO2進入紅細胞中生成H+ HCO2-,補償由于組織呼吸形成CO2引起的pH降低.增加H+濃度（降低pH）將提高O2從血紅蛋白中釋放)4.BPG 、H+ 、CO2 是Hb的別構抑制劑第70頁/共121頁血紅蛋白與分子病血紅蛋白與分子病第71頁/共121頁血紅蛋白與分子病血紅蛋白與分子病第72頁/共121頁血紅蛋白與分子病血紅蛋白與分子病第73頁/共121頁血紅蛋白與分子病血紅蛋白與分子病第74頁/共121頁第75頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第76頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第77頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第78頁/

26、共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第79頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第80頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第81頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第82頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第83頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第84頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第85頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第86頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第87頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第88頁/

27、共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第89頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第90頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第91頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第92頁/共121頁免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白第93頁/共121頁肌纖維與肌球蛋白、肌動蛋白及肌肉收縮肌纖維與肌球蛋白、肌動蛋白及肌肉收縮第94頁/共121頁肌纖維與肌球蛋白、肌動蛋白及肌肉收縮肌纖維與肌球蛋白、肌動蛋白及肌肉收縮第95頁/共121頁肌纖維與肌球蛋白、肌動蛋白及肌肉收縮肌纖維與肌球蛋白、肌動蛋白及肌肉收縮第96頁/共121頁肌纖維與肌球蛋

28、白、肌動蛋白及肌肉收縮肌纖維與肌球蛋白、肌動蛋白及肌肉收縮第97頁/共121頁蛋白質結構和功能預測蛋白質結構和功能預測 DNADNA序列的測序速度序列的測序速度, ,遠遠超過測定蛋白質三維結構遠遠超過測定蛋白質三維結構的進展。因此的進展。因此, ,如何從蛋白質序列甚至由如何從蛋白質序列甚至由DNADNA讀框翻讀框翻譯出的氨基酸序列預測可能的蛋白質結構譯出的氨基酸序列預測可能的蛋白質結構, ,就成為迫就成為迫切的任務。目前較為有效的預測方法切的任務。目前較為有效的預測方法, ,都要依靠已知都要依靠已知三維結構的蛋白質的序列來預測折疊單元?；谳喨S結構的蛋白質的序列來預測折疊單元?；谳喞?p

29、rofile)(profile)的預測方法的預測方法, ,通常假定兩段被比較的蛋通常假定兩段被比較的蛋白質序列的氨基酸殘基接近水環(huán)境的情形是保守的白質序列的氨基酸殘基接近水環(huán)境的情形是保守的。另一種所謂。另一種所謂“線串法線串法”(threading)(threading)則同時考慮單則同時考慮單個殘基的環(huán)境和一定距離內雙殘基的相互作用個殘基的環(huán)境和一定距離內雙殘基的相互作用, ,因而因而效果較好效果較好。第98頁/共121頁 第六節(jié)第六節(jié) 蛋白質的理化性質蛋白質的理化性質 一、蛋白質的酸堿性等電點概念：蛋白質凈電荷等于零時的環(huán)境pH值。不同蛋白質其等電點不同：胃蛋白酶：1.02.5；胰島素：

30、5.35.35；血紅蛋白：7.07；魚精蛋白：12.012.4特點：溶解度降低，可用于蛋白質的分離電泳：大分子化合物在電場中運動的過程。原理：不同蛋白的電荷正負和數(shù)量不同，分子量不同，形狀不同，因此在電場中的運動速度不同。方向與速度的鑒別：pI pH，正負為方向，數(shù)值為速度。 用途：分離鑒定蛋白質等大分子化合物NH3+COOHP+NH3+COOPNH2COOP-第99頁/共121頁點樣處蛋白蛋白蛋白1蛋白清蛋白根據(jù)載體的不同，電泳有膜電泳、凝膠電泳等如：人血清蛋白的醋酸纖維膜電泳等?，F(xiàn)有一混合蛋白質樣品，內含A、B、C、D三種蛋白，其等電點分別為：A 10.8 B 7.5 C 5.6 D 3.

31、2，指出在pH7.5的緩沖液中電泳時，它們各自的位置。根據(jù)pI pH，結果為：A 10.8 7.5 = 3.3 B 7.5 7.5 = 0 C5.6 7.5 = 1.9 D 3.2 7.5 = 4.3它們電泳后的位置為：點樣處AB CD+凝膠電泳例題第100頁/共121頁 蛋白質分子量小的幾萬，大的可達幾百萬，其大小為1100nm，已經達到膠體質點的范圍，同時，蛋白質分子外表為親水表面，所以，蛋白質屬于親水膠體，并且是穩(wěn)定的膠體。穩(wěn)定因素：水化膜，同種電荷+二、膠體性質+第101頁/共121頁+酸堿加脫水劑 但是穩(wěn)定是相對的，如果改變條件其穩(wěn)定性就會發(fā)生變化，如加入有機溶劑則會脫去水化膜，改變

32、p就會改變其電荷。第102頁/共121頁三、變性作用三、變性作用概念：物理化學因素影響，空間結構破壞，性質改變，功能喪失核糖核酸酶的變性過程核糖核酸酶的變性過程第103頁/共121頁變性因素：物理：熱、高能射線，振動；化學：強酸、強堿、變性劑。變性實質：空間結構破壞(僅破壞弱作用鍵)。變性的結果：溶解度下降，反應活性改變等。標志：生物活性喪失 第104頁/共121頁 鹽析：高濃度中性鹽使蛋白質沉淀的現(xiàn)象原因：破壞了穩(wěn)定膠體的兩個因素四、沉淀四、沉淀：NH4+SO42-NH4+SO42-SO42-NH4+NH4+SO42-+NH4+NH4+SO42-NH4+SO42-NH4+SO42-SO42-

33、+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-靜電荷為零優(yōu)點：不影響蛋白質的空間結構，常用于蛋白質分離常用的鹽類：硫酸銨和氯化鈉鹽溶：低濃度中性鹽使蛋白質溶解度增加的現(xiàn)象變性沉淀；沉淀劑沉淀：有機溶劑、重金屬鹽、某些酸類，如苦味酸、三氯乙酸；相互沉淀第105頁/共121頁 由于蛋白質中含有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸, 在紫外區(qū)(280nm)有吸收,可用于蛋白質含量的測定六六. 呈色反應呈色反應：茚三酮反應 雙縮脲反應：可用于蛋白質含量的測定（540nm）五五. 紫外吸收紫外吸收：第106頁/共121頁1. 大小大小2. 形狀形狀3. 電荷電荷4. 等電點等電點5. 電荷分布電荷分

34、布6. 疏水性疏水性7. 溶解度溶解度8. 密度密度 第七節(jié)第七節(jié) 蛋白質的分離純化蛋白質的分離純化第107頁/共121頁（大小從幾百到一百萬。一般10,000150,000）（球型、雪茄型蛋白在電泳、梯度離心、層析時摩擦阻力、擴散速度不同）（天冬氨酸、谷氨酸占優(yōu)勢， pH=7時帶負電荷，為酸性蛋白； 賴氨酸、和精氨酸殘基占優(yōu)勢，pH=7時帶正電荷，為堿性蛋白）（蛋白質等電點一般為4.0-10.0之間）（荷電殘基不均勻分布或成簇分布時往往能以適當?shù)膹姸扰c陰陽兩種離子交換樹脂作用 ）第108頁/共121頁（多數(shù)疏水性氨基酸蠶基藏在蛋白內部，但也有一些見于表面。鹽濃度增大時往往露出疏水表面）（溶解

35、度從基本不溶300mg/ml, pH、離子強度、離子的性質、溫度、溶液極性等影響溶解度）（富含磷酸鹽蛋白高密度1.8mg/ml，脂質部分密度1.03，可梯度離心）(酶與底物、效應分子、輔助因子、和DNA模板結合)(胱氨酸、組氨酸殘基與Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、Ni2+二價金屬離子結合)第109頁/共121頁(蛋白二聚體、三聚體等的可逆變化)(翻譯后加入糖基、?；?、磷酸基團等。糖基與外源凝集素柱子結合，磷蛋白在某些糖基存在下與二價Fe離子)(氨基酸殘基在蛋白質表面上的精確的幾何表象可用來作為分離方法的基礎。如免疫親和層析)(改變cDNA而在被表達的蛋白氨基端或羧基端加幾個額外的氨基

36、酸，如6個組氨酸與Ni2+螯合)(某些蛋白質還有一些不同尋常的性質，如熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶解等，結合二者用來純化酶等。因大多數(shù)蛋白95C時解折疊并凝結或沉淀)第110頁/共121頁一、蛋白質分離純化的一般程序一、蛋白質分離純化的一般程序 破碎生物組織并用適當?shù)木彌_液將蛋白質抽提出來破碎生物組織并用適當?shù)木彌_液將蛋白質抽提出來分離亞細胞顆粒分離亞細胞顆粒(離心法離心法) 蛋白質組分粗分離蛋白質組分粗分離(鹽析法、有機溶劑法等鹽析法、有機溶劑法等)蛋白質組分的細分離（層析法、電泳法等）蛋白質組分的細分離（層析法、電泳法等） 在適當條件下使蛋白質結晶或制成凍干粉。在適當條件下使蛋白質結晶或制成凍干粉。

37、（原料是細胞分泌物時（原料是細胞分泌物時無需此步），無需此步），如核、線粒體、微粒如核、線粒體、微粒體或核糖體）及細胞體或核糖體）及細胞碎片與溶液分開碎片與溶液分開第111頁/共121頁（一）依據(jù)分子形狀大小不同進行分離（凝膠過濾 、離心，透析 ）1. 凝膠過濾 (gel filtration or gel chromatography) 二、蛋白質的分離純化方法二、蛋白質的分離純化方法第112頁/共121頁2. 透析及超過濾：利用大分子化合物不能通過半透膜的性質，可用于蛋白質脫鹽 、分級分離等3.沉降：在強離心場中，大分子化合物向離心力方向移動的現(xiàn)象沉降系數(shù)（s）：單位離心場強單位時間內蛋白

38、質的沉降距離，其單位是S（注意s與S的區(qū)別），如某蛋白的沉降系數(shù)為70，則表示為70S。 蛋白質S值的大小可以近似表示蛋白質分子量的相對大小。第113頁/共121頁（二）依據(jù) 溶解度不同進行分離： 等電點法，有機溶劑沉淀法，鹽析法（三） 依據(jù)電荷不同進行分離：1. 電泳 electrophoresiselectrophoresis 種類：按分離原理分為按分離原理分為 自由界面電泳、區(qū)帶電泳自由界面電泳、區(qū)帶電泳 等速電泳、等電聚焦電泳等速電泳、等電聚焦電泳 按有無固體支持物分為按有無固體支持物分為 自由電泳、柱電泳及顯微電泳等自由電泳、柱電泳及顯微電泳等 支持物電泳包括支持物電泳包括 濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、淀電泳濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、淀電泳粉粉 聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳 按模具的形狀分為按模具的形狀分為 垂直板電泳、平板電泳垂直板電泳、平板電泳 2.2.目前常用的電泳技術包括：目前常用的電泳技術包括： SDSSDSPAGEPAGE（包括連續(xù)和不連續(xù)電泳）；