生物化學(xué)課件核酸的化學(xué)

1、第 三 章核酸的結(jié)構(gòu)和功能中國藥科大學(xué)中國藥科大學(xué) 生物制藥教研室生物制藥教研室馮磊馮磊 核核 酸酸(nucleic acid) 是以核苷酸為基本組成單位的生物大是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。分子，攜帶和傳遞遺傳信息。核酸的分類及分布核酸的分類及分布 存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)。存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)。存在于胞核、胞液和線粒體。存在于胞核、胞液和線粒體。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的遺傳型體的遺傳型(g

2、enotype)。參與遺傳信息的復(fù)制與表達(dá)。參與遺傳信息的復(fù)制與表達(dá)。某些病毒某些病毒RNA也可作為遺傳信也可作為遺傳信息的載體。息的載體。第一節(jié)第一節(jié)核酸的化學(xué)組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)核酸的化學(xué)組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)The Chemical Component and The Chemical Component and Primary Structure of Primary Structure of Nucleic AcidNucleic Acid核酸的基本組成單位是核苷酸核酸的基本組成單位是核苷酸 (nucleotide)。堿基堿基戊糖戊糖磷酸磷酸核苷酸核苷酸核苷核苷核酸核酸DNA的基本組成單位是脫氧核

3、糖核苷酸的基本組成單位是脫氧核糖核苷酸 。RNA的基本組成單位是核糖核苷酸的基本組成單位是核糖核苷酸 。嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶 堿基堿基腺嘌呤（腺嘌呤（A）鳥嘌呤（鳥嘌呤（G）胞嘧啶（胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（尿嘧啶（U）DNA、RNA均有均有DNA有有RNA有有一、核苷酸的結(jié)構(gòu)一、核苷酸的結(jié)構(gòu)每種核酸都含有四種堿基每種核酸都含有四種堿基 。嘌呤嘌呤(purine) NNNHN123456789NNNHNNH2腺嘌呤腺嘌呤(adenine, A)NNHNHNNH2O鳥嘌呤鳥嘌呤(guanine, G)堿堿 基基NNH132456嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cyt

4、osine, C)NNHNH2O尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U)NHNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T)NHNHOOCH3 五種堿基都能形成酮式五種堿基都能形成酮式-烯醇式或氨基烯醇式或氨基-亞氨基亞氨基的互變異構(gòu)。這兩種異構(gòu)體的平衡關(guān)系受介質(zhì)酸的互變異構(gòu)。這兩種異構(gòu)體的平衡關(guān)系受介質(zhì)酸堿環(huán)境的影響。堿環(huán)境的影響。 HNHNCNH2+O+HNNH2NNH2亞亞氨氨基基氨氨基基+ H+NCOHNCO-+ H+酮酮式式烯烯醇醇式式戊戊 糖糖（構(gòu)成（構(gòu)成RNA）核糖核糖(ribose)（構(gòu)成（構(gòu)成DNA）脫氧核糖脫氧核糖(deoxyribose)12453OOHOHHHHCH2OHHO

5、HOHOHHHHCH2OHHOH12345堿基和核糖（或脫氧核糖）通過糖苷鍵連堿基和核糖（或脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成核苷接形成核苷(nucleoside) （或脫氧核苷）。（或脫氧核苷）。腺嘌呤核苷NNNN9NH2OOHOHHHHCH2OHH12糖苷鍵胞嘧啶脫氧核苷1NNONH212OHOHHHHCH2OHH糖苷鍵核苷酸：核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脫氧核苷酸：脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP 核苷（脫氧核苷）和磷酸以酯鍵連接形成核核苷（脫氧核苷）和磷酸以酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。苷酸（脫氧核苷酸）。 糖苷鍵酯鍵腺苷酸NNNN9NH2OOHO

6、HHHHCH2H12OPO- -HOO5l 多磷酸核苷酸：多磷酸核苷酸：l NMP，NDP，NTPNNNN9NH2OOHOHHHHCH2H12OPO- -OOPOO- -OPO- - -OO一磷酸腺苷（AMP）二磷酸腺苷（ADP）三磷酸腺苷（ATP）l 環(huán)化核苷酸環(huán)化核苷酸: cAMP，cGMPNNNNNH2OOHOHHHCH2HOPHOOcAMP二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)定義定義核酸中核苷酸的排列順序。核酸中核苷酸的排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。以也稱為堿基序列。5 端端3 端端核苷酸之間以核苷酸之間以3 , 5

7、 -磷酸二酯鍵連接形成磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。多核苷酸鏈，即核酸。CGA書寫方法書寫方法PPAPCPCPTPGOHCPTPAPA53pApCpTpGpCpTpApApC-OH 35 ACTGCTAAC35 DNA 與與RNA的區(qū)別的區(qū)別核酸核酸堿基堿基戊糖戊糖DNAA、G、C、T脫氧核糖脫氧核糖RNAA、G、C、U核糖核糖第二節(jié)第二節(jié)DNADNA的空間結(jié)構(gòu)與功能的空間結(jié)構(gòu)與功能Dimensional Structure and Dimensional Structure and Function of DNAFunction of DNA一、一、 DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)雙螺旋

8、結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)（一）（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景 堿基組成分析堿基組成分析Chargaff 規(guī)則：規(guī)則：A = T G = C 堿基的理化數(shù)據(jù)分析堿基的理化數(shù)據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵配對(duì)較合理以氫鍵配對(duì)較合理 DNA纖維的纖維的X-線衍射圖譜分析線衍射圖譜分析 已知的核酸化學(xué)數(shù)據(jù)已知的核酸化學(xué)數(shù)據(jù)（二）（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn) 1. 兩條鏈反向平行，圍繞同兩條鏈反向平行，圍繞同一中心軸構(gòu)成右手雙螺一中心軸構(gòu)成右手雙螺旋旋 (double helix)。螺旋。螺旋直徑直徑2nm，表面有大溝，表面有大溝和小溝。和小溝。2. 磷酸磷酸-脫氧核糖骨架

9、位于脫氧核糖骨架位于螺旋外側(cè)，堿基垂直于螺旋外側(cè)，堿基垂直于螺旋軸而伸入內(nèi)側(cè)。每螺旋軸而伸入內(nèi)側(cè)。每圈螺旋含圈螺旋含10個(gè)堿基對(duì)個(gè)堿基對(duì) (bp)，螺距為，螺距為3.4nm。堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行3. 兩條鏈通過堿基間的氫兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，鍵相連，A對(duì)對(duì)T有兩個(gè)氫有兩個(gè)氫鍵，鍵，C對(duì)對(duì)G有三個(gè)氫鍵，有三個(gè)氫鍵，這種這種A-T、C-G配對(duì)的規(guī)配對(duì)的規(guī)律，稱為堿基互補(bǔ)規(guī)則。律，稱為堿基互補(bǔ)規(guī)則。4. 維持雙螺旋穩(wěn)定的因素：維持雙螺旋穩(wěn)定的因素：橫向?yàn)闅滏I，縱向?yàn)閴A橫向?yàn)闅滏I，縱向?yàn)閴A基間的堆積力?；g的堆積力。堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)

10、 （三）（三）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性Z型型DNAB型型DNAA型型DNA二、二、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝中的組裝（一）（一）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)的超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix 或或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。 正超螺旋正超螺旋(positive supercoil)盤繞方向與盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同雙螺旋方同相同 負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋(negative supercoil)盤繞方向與盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反雙螺旋方向相反 意義意義DNA超螺旋結(jié)構(gòu)

11、整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對(duì)于及其調(diào)控對(duì)于DNA復(fù)制和復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。有關(guān)鍵作用。 （二）原核生物（二）原核生物DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)的高級(jí)結(jié)構(gòu)（三）（三）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是其基本單位是 核小體核小體(nucleosome)。核小體的組成核小體的組成DNA：約：約200bp 組蛋白：組蛋白：H1H2A，H2BH3H4串珠狀核小體結(jié)構(gòu)串珠狀核小體結(jié)構(gòu)串珠狀核小體串珠狀核小體DNA雙螺旋片段雙螺旋片段染色質(zhì)纖染色質(zhì)纖維維伸展形染

12、色質(zhì)片段伸展形染色質(zhì)片段密集形染色質(zhì)片段密集形染色質(zhì)片段整個(gè)染色整個(gè)染色體體核小體核小體螺線管螺線管真核生物染色體真核生物染色體DNA組裝組裝三、三、DNA的功能的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基礎(chǔ)。的信息基礎(chǔ)。基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。因的功能。 肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)肺炎雙

13、球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)Oswald Avery (1944) 噬菌體的標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 真核生物與原核生物真核生物與原核生物DNADNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)差異結(jié)構(gòu)特點(diǎn)差異就原核生物而言就原核生物而言DNA序列中存在大量重疊序列，如病毒序列中存在大量重疊序列，如病毒DNA中中大量存在。共用相同序列，但相同的序列在不大量存在。共用相同序列，但相同的序列在不同基因中有不同的含義。故如果在重疊序列中同基因中有不同的含義。故如果在重疊序列中發(fā)生突變，可能造成多個(gè)基因產(chǎn)物不正常表達(dá)。發(fā)生突變，可能造成多個(gè)基因產(chǎn)物不正常表達(dá)。DNA序列每轉(zhuǎn)錄出的序列每轉(zhuǎn)錄出的mRNA是多順反子，通常是多順反子，通常多個(gè)功能相關(guān)的順反子串聯(lián)在一個(gè)多個(gè)

14、功能相關(guān)的順反子串聯(lián)在一個(gè)mRNA分子分子上。這是原核基因協(xié)同表達(dá)的一種調(diào)控方式。上。這是原核基因協(xié)同表達(dá)的一種調(diào)控方式。DNA序列中所含的結(jié)構(gòu)基因序列是連續(xù)的，不序列中所含的結(jié)構(gòu)基因序列是連續(xù)的，不含有插入或是間隔序列。含有插入或是間隔序列。 就真核生物而言就真核生物而言 1、 DNA序列中含有重復(fù)序列，分為高度重復(fù)、序列中含有重復(fù)序列，分為高度重復(fù)、中度重復(fù)序列及單一序列。中度重復(fù)序列及單一序列。 高度重復(fù)序列：高度重復(fù)序列：5100bp，重復(fù)次數(shù)高，衛(wèi)，重復(fù)次數(shù)高，衛(wèi) 星星DNA 中度重復(fù)序列：中度重復(fù)序列：300bp以上，編碼組蛋白基因，以上，編碼組蛋白基因，rRNA及及tRNA基因。

15、基因。 單一序列：編碼蛋白質(zhì)單一序列：編碼蛋白質(zhì) 2、間隔序列及插入序列、間隔序列及插入序列 基因與基因中間的序列為間隔序列基因與基因中間的序列為間隔序列 基因內(nèi)部的不編碼蛋白質(zhì)的序列為插入序列基因內(nèi)部的不編碼蛋白質(zhì)的序列為插入序列 即基因中存在內(nèi)含子與外顯子之分即基因中存在內(nèi)含子與外顯子之分3、回文序列 該結(jié)構(gòu)中脫氧核苷酸序列順讀與倒讀，意義不變。4、 DNA序列每轉(zhuǎn)錄出的mRNA是單順反子，即一條mRNA分子只可以翻譯出一種蛋白質(zhì)。DNA序列的功能單位就是基因序列序列的功能單位就是基因序列 這句話不能算完全正確。 因?yàn)榇嬖谥罅康姆腔蛐蛄?，主要就是指兩基因之間的間隔序列。目前對(duì)這些非基因

16、序列的認(rèn)知非常有限，并不能完全知曉其功能，但可以肯定的是非基因序列必定對(duì)基因序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。 同時(shí)需要強(qiáng)調(diào)的是，基因序列當(dāng)中的插入序列即內(nèi)含子（非蛋白編碼序列）對(duì)外顯子（蛋白編碼序列）的功能也有一定的影響。 為了研究這些目前不確定的DNA結(jié)構(gòu)及功能，基因組學(xué)（genomics）應(yīng)運(yùn)而生。可分為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)。 需要使用的研究方法：基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)的概念基因芯片技術(shù)的概念就是將大量探針分子固定于支持物上，就是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，與標(biāo)記的根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布

17、進(jìn)而獲取樣品中信號(hào)的強(qiáng)度及分布進(jìn)而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息。靶分子的數(shù)量和序列信息。基因芯片的基本原理基因芯片的基本原理 基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法(southern(southern、northern)northern)一致，應(yīng)用已知核酸序列一致，應(yīng)用已知核酸序列作為靶基因與互補(bǔ)的探針核苷酸序列雜交，通過作為靶基因與互補(bǔ)的探針核苷酸序列雜交，通過隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析。具體講即隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析。具體講即是將許多特定的寡核苷酸片段或是將許多特定的寡核苷酸片段或cDNAcDNA基因片段作基因片段作為靶基因

18、，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品DNA/RNADNA/RNA通過通過PCRPCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基標(biāo)記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基配對(duì)原理將兩者進(jìn)行雜交；再通過熒光或同位素配對(duì)原理將兩者進(jìn)行雜交；再通過熒光或同位素檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而得出所需要探針上的信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而得出所需要的信息。的信息。 第三節(jié)第三節(jié) RNARNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能Structur

19、e and Function of RNA動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要?jiǎng)游锛?xì)胞內(nèi)主要RNA的種類及功能的種類及功能核蛋白體核蛋白體RNA信使信使RNA轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA核內(nèi)不均一核內(nèi)不均一RNA核內(nèi)小核內(nèi)小RNA胞漿小胞漿小RNA 細(xì)胞核和胞液細(xì)胞核和胞液線粒體線粒體功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分核蛋白體組分蛋白質(zhì)合成模板蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸成熟成熟mRNA的前體的前體參與參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)rRNA的加工、修飾的加工、修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成

20、的信號(hào)識(shí)別體的組分的信號(hào)識(shí)別體的組分核仁小核仁小RNA核蛋白體核蛋白體RNA信使信使RNA轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA核內(nèi)不均一核內(nèi)不均一RNA核內(nèi)小核內(nèi)小RNA胞漿小胞漿小RNA 細(xì)胞核和胞液細(xì)胞核和胞液線粒體線粒體功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分核蛋白體組分蛋白質(zhì)合成模板蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸成熟成熟mRNA的前體的前體參與參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)rRNA的加工、修飾的加工、修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號(hào)識(shí)別體的組分的信號(hào)識(shí)別體的組分核仁小核仁

21、小RNA一一 、信使、信使RNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能hnRNA 內(nèi)含子內(nèi)含子(intron)mRNA * mRNA成熟過程成熟過程 外顯子(exon)* mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1. 大多數(shù)真核大多數(shù)真核mRNA的的5 末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個(gè)個(gè)7-甲基鳥苷，同時(shí)第一個(gè)核苷酸的甲基鳥苷，同時(shí)第一個(gè)核苷酸的C 2也是也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。2. 大多數(shù)真核大多數(shù)真核mRNA的的3 末端有一個(gè)多聚腺苷末端有一個(gè)多聚腺苷酸酸 (polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。尾。帽子結(jié)構(gòu)帽子結(jié)構(gòu)mRNA核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位m

22、RNA的穩(wěn)定性維系的穩(wěn)定性維系翻譯起始的調(diào)控翻譯起始的調(diào)控 帽子結(jié)構(gòu)和多聚帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能尾的功能mRNA的功能：作為蛋白質(zhì)合成的模板。的功能：作為蛋白質(zhì)合成的模板。* tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 含稀有堿基較多含稀有堿基較多 3 末端為末端為 CCA-OH 5 末端大多數(shù)為末端大多數(shù)為G 由由7090個(gè)核苷酸組成個(gè)核苷酸組成二、轉(zhuǎn)運(yùn)二、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能 稀有堿基稀有堿基 HNNHOOR51HNNNNHNCH2CH2NOO7ORIRDHUNNNNOHRmGH2NCH3* tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)三葉草形三葉草形氨基酸臂氨基酸臂額外環(huán)額外環(huán)* tRNA的三

23、級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 倒倒L形形* tRNA的功能的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。* rRNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)三、核蛋白體三、核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能* rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。核糖體的組成核糖體的組成原核生物原核生物真核生物真核生物小亞基小亞基30S40SrRNA16S18S蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)21種種33種種大亞基大亞基50S60SrRNA23S5S28S5.8S5S蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)33種種49種種核糖體核糖體70S80S四四 、其他小分子、其他小分子RNA及及RNA組學(xué)組學(xué)除了上述三種除了上述三種R

24、NA外，細(xì)胞的不同部位外，細(xì)胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為，統(tǒng)稱為非非mRNA小小RNA (small non-messenger RNAs，snmRNAs)。 snmRNAssnmRNAs的種類的種類核內(nèi)小核內(nèi)小RNA (snRNA)核仁小核仁小RNA (snoRNA)胞質(zhì)小胞質(zhì)小RNA (scRNA)催化性小催化性小RNA小片段干擾小片段干擾 RNA (siRNA) snmRNAs的功能的功能參與參與hnRNA和和rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工和轉(zhuǎn)運(yùn)以及的轉(zhuǎn)錄后加工和轉(zhuǎn)運(yùn)以及基因表達(dá)過程的調(diào)控等?；虮磉_(dá)過程的調(diào)控等。是研究細(xì)胞中是研究細(xì)胞中snmRN

25、As的種類、結(jié)構(gòu)的種類、結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)和功能的科學(xué)。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)胞、同一細(xì)胞在不同時(shí)間、不同狀態(tài)下胞、同一細(xì)胞在不同時(shí)間、不同狀態(tài)下snmRNAs的表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性。的表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性。 RNA組學(xué)組學(xué) (RNomics)什么是RNAi？ RNAi（RNA interference）是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，dsRNA引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程。 一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 生物體內(nèi)普遍存在 抵御外在感染的重要保護(hù)機(jī)制RNAi的發(fā)展歷程大事記1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)。Cell，1995 ，81：611-

26、6201998，RNAi概念的首次提出。Nature, 1998, 391（6669）：8061999，RNAi作用機(jī)制模型的提出。Cell，2000，101（1）：25-33 在線蟲、果蠅、擬南芥及斑馬魚等多種生物內(nèi)發(fā)現(xiàn) RNAi現(xiàn)象。2001，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉 默現(xiàn)象。Nature，2001，411（6836）：494498 RNAi技術(shù)被Science評(píng)為2001年度的十 大科技進(jìn)展之一。2002至今，有關(guān)RNAi的研究蓬勃開展，是分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門的方向之一。預(yù)備知識(shí) dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈 Dicer：屬于RNase 家族，是dsR

27、NA的特異性核酸內(nèi)切酶 siRNA：small interfering RNA ，RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23個(gè)nt大小的雙鏈RNA RISC：RNA-inducing silencing complex，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性 RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.RNAi的分子生物學(xué)特性的分子生物學(xué)特性 RNAi是siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 RNAi作用針對(duì)的是

28、靶基因的外顯子序列 高特異性，只針對(duì)同源靶向mRNA 高效性，極低濃度的siRNA就能完全抑制基因表達(dá) RNAi作用具有可傳遞性RNAi的研究方法 siRNA的設(shè)計(jì) 根據(jù)靶向mRNA進(jìn)行設(shè)計(jì) 目前已證實(shí)的siRNA序列 互聯(lián)網(wǎng)上的幫助 RNAi的研究方法 siRNA的制備方法 體外制備 -化學(xué)合成siRNA -體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA -用RNase 消化長片段dsRNA得到siRNA 體內(nèi)表達(dá) -利用質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)siRNA - PCR方法制備siRNA的表達(dá)框架siRNA制備方法比較制備方法比較合成方法特點(diǎn)適用不適用化學(xué)合成價(jià)格高已找到最有效siRNA，大量篩選體外轉(zhuǎn)錄毒性小，穩(wěn)定 性好

29、，效率高篩選大量需要，特定的，長期用RNase消化長片段節(jié)省快速而經(jīng)濟(jì)的研究某基因缺失表型不宜長期，特定的siRNA研究及基因治療siRNA表達(dá)載體 價(jià)格較高，常用特定siRNA，穩(wěn)定篩選siRNA表達(dá)框架 表達(dá)穩(wěn)定，測(cè)序困難篩選長期研究應(yīng)用 基因功能研究 基因治療 -基因缺陷 -病毒感染 -腫瘤疾病 其它應(yīng)用 -植物代謝 -細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路 基因治療 腫瘤細(xì)胞的MDR1基因編碼的p-gp糖蛋白過度表達(dá)，引起腫瘤的MDR Hait等針對(duì)MDR乳腺癌細(xì)胞的MDR1基因，使用化學(xué)合成的siRNA進(jìn)行干擾 結(jié)果表明：MDR1的mRNA和p-gp水平顯著下降，細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和阿霉素積累增多，而且紫杉醇和

30、阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性大為增強(qiáng)。Cancer Res，2003，63（7）：1515-1519基因治療基因治療疾病/病毒疾病/病毒靶基因靶基因細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞來源細(xì)胞來源效果效果H IV-1H IV-1C C R5C C R5C D 4+TC D 4+TT T細(xì)胞細(xì)胞阻止病毒侵入阻止病毒侵入H IV-1H IV-1Tsg101Tsg101293T293T腎臟腎臟阻止病毒出芽阻止病毒出芽H IV-1H IV-1TatTat，RTRTJurkatJurkat白血病白血病抑制病毒繁殖抑制病毒繁殖C C型肝炎病毒型肝炎病毒N S3N S3，N S5BN S5BH uh7H uh7肝癌肝癌抑制病毒繁殖

31、抑制病毒繁殖脊髓灰質(zhì)炎病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒PolPolH eLa S3H eLa S3子宮癌子宮癌抑制病毒繁殖抑制病毒繁殖勞氏肉瘤病毒勞氏肉瘤病毒Fusi on protei nFusi on protei nA549A549肺癌肺癌抑制病毒繁殖抑制病毒繁殖乳頭狀瘤病毒乳頭狀瘤病毒E6E6，E7E7C asK iC asK i子宮頸癌子宮頸癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡流感病毒流感病毒C apsi dC apsi dM D C KM D C K上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞抑制病毒繁殖抑制病毒繁殖乳腺癌乳腺癌p53p53M C F-1M C F-1乳癌乳癌防止細(xì)胞停在期防止細(xì)胞停在期胰腺癌胰腺癌K -RAS V-12K

32、-RAS V-12C APAN -1C APAN -1胰腺癌胰腺癌抑制腫瘤形成抑制腫瘤形成大腸癌大腸癌K -rasK -rasSW 480SW 480大腸癌大腸癌抑制細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞增殖白血病白血病Bcr/ablBcr/ablK 562K 562白血病白血病抑制抑制bcr/ablbcr/abl細(xì)胞細(xì)胞植物代謝 2003年，Ogita等首次報(bào)道RNAi技術(shù)在咖啡中的成功應(yīng)用。 選取咖啡因生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一可可堿合酶，將siRNA轉(zhuǎn)入植株內(nèi)，從而抑制咖啡因的合成，轉(zhuǎn)基因咖啡植株的咖啡因產(chǎn)量比正常植株低70，可以用于生產(chǎn)低咖啡因含量的咖啡豆。 是RNAi技術(shù)在藥用植物代謝工程領(lǐng)域的經(jīng)典范例。

33、Nature，2003，423（6942）：823藥用植物代謝 2004年，RNAi在罌粟中成功應(yīng)用。 可待因酮與嗎啡具有共同的前體分子(S)-網(wǎng)狀番茄枝堿。 采用RNAi技術(shù)抑制可待因酮還原酶基因家族中所有基因的表達(dá)，使(S)-網(wǎng)狀番茄枝堿和甲基- (S)-網(wǎng)狀番茄枝堿積聚，從而提高罌粟中嗎啡的含量。 為增加植物中高藥用價(jià)值的生物堿產(chǎn)量提供了成功的案例。Nat Biotechnol，2004，22（12）：1559-1566核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid第第 四四 節(jié)節(jié)一、核酸的一般理化性質(zhì)

34、一、核酸的一般理化性質(zhì) 核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性；核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性； DNA是線性高分子，粘度極大；是線性高分子，粘度極大； 在在260nm波長有最大吸收峰，是由堿基波長有最大吸收峰，是由堿基的共軛雙鍵決定的。這一特性常用作核酸的共軛雙鍵決定的。這一特性常用作核酸的定性、定量分析。的定性、定量分析。1. DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相當(dāng)于相當(dāng)于50 g/ml雙鏈雙鏈DNA40 g/ml單鏈單鏈DNA（或（或RNA）20 g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度DNA純品純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品純品: OD26

35、0/OD280 = 2.0OD260的應(yīng)用的應(yīng)用二、二、DNA的變性的變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開雙鏈解開成兩條單鏈的過程。成兩條單鏈的過程。變性因素：過量酸，堿，加熱等。變性因素：過量酸，堿，加熱等。變性后理化性質(zhì)的主要改變：變性后理化性質(zhì)的主要改變：OD260增高增高粘度下降粘度下降DNA變性的本變性的本質(zhì)是雙鏈間氫質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂鍵的斷裂DNA的紫外吸收光譜的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。增高的現(xiàn)象。解鏈曲線：在連續(xù)加熱解鏈曲線：在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度的過程中以溫度對(duì)對(duì)A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。 Tm：紫外光吸：紫外光吸收值達(dá)到最大值收值達(dá)到最大值的的50%時(shí)的溫度時(shí)的溫度稱為稱為DNA的解鏈的解鏈溫度，又稱融解溫度，又稱融解溫度溫度(melting temperature, Tm)。其大小與。其大小與G+C含量成正比。含量成正比。