生物化學實驗指導

1、生物化學實驗須知一、實驗目的1培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目茖W作風，獨立工作能力及科學的思維方法。2學習根底的生物化學實驗方法，為今后的學習與研究準備更好的條件。3培養(yǎng)學生保護國家財物、保護集體、團結(jié)互助的優(yōu)良道德品質(zhì)。4培養(yǎng)學生的書面及口頭表達能力。二、實驗的總要求1按教研室予先公布的實驗進度表，了解各次實驗的具體內(nèi)容，并認真做好預習。弄清各步驟的意義，防止教條或機械式做實驗。2進行實驗不僅要求結(jié)果良好，而且要求敏捷高效。為到達此目的，實驗者應(yīng)注意：一切步驟都按正規(guī)操作法進行；樣品與試劑勿過量取用；宜粗者勿細例如粗天平稱量物品即足夠準確時，不用分析天平，用量筒取液足夠準確時，不用吸量管；試劑、儀器防止污染

2、及破損，保持實驗環(huán)境的整潔。注意力集中，防止過失。 3實驗中觀察要仔細，記錄要詳盡、及時與客觀，不得于實驗后追記，應(yīng)直接記在實驗報告本中，而且無論實驗成功與失敗，都應(yīng)記下。對于失敗的實驗，要分析其原因。4實驗室是集體學習與工作的場所，實驗時應(yīng)保持肅靜，不得大聲喧嘩，以免影響他人的工作與思考。對師長尊敬，對同學要團結(jié)友愛。實驗后應(yīng)清洗整理用過的儀器及清理自己的實驗場所。三、實驗報告實驗報告的書寫是培養(yǎng)學生書面表達能力和科學作風的重要手段之一，實驗者應(yīng)該重視。實驗報告的內(nèi)容包括以下各項：實驗名稱、實驗日期、實驗目的、實驗原理、實驗步驟、實驗記錄、計算定量測定、解釋、討論或小結(jié)。實驗記錄除應(yīng)包括“實

3、驗總要求的第3項要求外，還應(yīng)包括原始記錄。原始記錄是隨做隨記的第一手記錄，應(yīng)由指導教師簽字認可。書寫實驗報告要字跡工整，語句通順。書寫工整的實驗報告，是尊師的重要表現(xiàn)之一。四、組織與分組1每一個班學習委員負責實驗報告的收集與分發(fā)；安排清掃值日名單；反映同學學習情況及對教學工作的意見；其它臨時性的工作。2一般實驗都為兩個學生單獨進行。有的實驗要4人一組，由相鄰兩學生組成固定小組。小組的成員在指導教師的同意下，可作適當?shù)恼{(diào)整。五、儀器1每個實驗小組的常用儀器在各自的抽屜里，請各位同學愛惜公用儀器，用完及時清洗干凈。2公用儀器包拈貴重儀器，如分光光度計、電動離心機等使用時時間不宜過長，以免阻礙他人工

4、作。設(shè)有使用登記薄的儀器，使用后必須登記，以示負責。對于不熟悉儀器，切勿隨意亂動應(yīng)請教師指導。六、試劑1每兩小組合用一份試劑，在一般情況下，使用的試劑應(yīng)該固定。2取試劑瓶塞與量取用具如吸管或滴管不應(yīng)與試劑瓶分開放置，用后應(yīng)立即放回原處，量取用具應(yīng)按規(guī)定放置。瓶塞與量具一旦弄錯，試劑即受污染，實驗就可能失敗。3標準試劑不應(yīng)用潮濕之吸管與之直接接觸，取出后不得再放入原瓶。七、玻璃器皿的洗滌一般玻璃皿器用肥皂或去污粉以毛刷洗滌即足以滿足要求，洗后應(yīng)將肥皂或去污粉仔細沖掉，將水傾去后，器壁不掛水珠，視為合格。鉻酸洗液僅用于毛刷不能洗凈的器皿，切勿濫用于普通玻璃器皿洗滌。使用鉻酸洗液時，玻璃器皿應(yīng)枯燥；

5、過多的水份將使洗液迅速失效。用過的鉻酸洗液須加以保存以反復使用，直至變?yōu)榫G色前方可舍棄；其舍棄法與濃硫酸液相同。用洗液浸洗過的玻璃器皿，應(yīng)先用自來水沖洗，然后再用蒸餾水或去離子水清洗，清洗時，宜采用“少量屢次原那么以節(jié)約蒸餾水，同時清洗的效率也高。八、舍棄物的處理舍棄物必須依照其性質(zhì)作適當處理。以免造成實驗材料浪費，損壞水槽及下水管道，或污染實驗環(huán)境。1所有固體舍棄物例如用過的濾紙、損壞的軟木塞及橡皮物、玻璃渣、火柴梗等。必須放入廢物筒或簍中，切勿丟于水槽中。2廢硫酸或洗液，應(yīng)先傾入大量水中，再倒入水槽中，并以大量水沖走。3實驗完成后的沉淀或混合物，假設(shè)含有可提取或收回的貴重物品者，不可隨意舍

6、棄，應(yīng)放入教師指定的回收器中。生化實驗根本操作一. 玻璃儀器的洗滌在生化實驗中，玻璃儀器潔凈與否，是獲得準確結(jié)果的重要環(huán)節(jié)。潔凈的玻璃儀器內(nèi)壁應(yīng)十清楚亮光潔，無水珠附著在玻壁上。 常用的洗滌方法：1.一般儀器，如燒杯、試管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗滌劑仔細刷洗。然后用自來水反復沖洗，最后用少量蒸餾水沖洗23次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干備用。2.容量分析儀器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后應(yīng)及時用自來水屢次沖洗，細心檢查潔凈程度，根據(jù)掛不掛水珠采取不同處理方法。1如不掛水珠，用蒸餾水沖洗、枯燥，方法同上；2如掛水珠，那么應(yīng)瀝干后用重鉻酸鉀洗液浸泡46小時，然后按上法順序操

7、作，即先用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗，最后枯燥。3.粘附有血漿的刻度吸量管等，有三種洗滌方法：1先用45%尿素溶液浸泡，使血漿蛋白溶解，然后用自來水沖洗；2也可用1%氨水浸泡，使血漿溶解，然后再依次用1%稀鹽酸溶液、自來水沖洗；3以上二法如達不到清潔要求，可浸泡于重鉻酸鉀洗液46小時，再用大量自來水沖洗，最后用蒸餾水沖洗23次。4.新購置的玻璃儀器，應(yīng)先置于12%稀鹽酸溶液中浸泡26小時，除去附著的游離堿，再用自來水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗23次。5.凡用過的玻璃儀器，均應(yīng)立即洗滌，久置干涸后洗滌十分困難。如不能及時洗滌，先用流水初步?jīng)_洗后浸泡在清水中，待后按常規(guī)處理。 使用重鉻酸鉀洗液以下

8、簡稱洗液時應(yīng)注意以下幾點：1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前應(yīng)盡量瀝干。否那么會因洗液被稀釋而降低洗液的氧化力。2.Hg2+、Ba2+、Pb2+ 等離子可與洗液發(fā)生化學反響，生成不溶性化合物沉積在容器壁上。因此，凡接觸過上述離子的容器，應(yīng)先除去上述離子可用稀硝酸或510%EDTA鈉去除。3.油類、有機溶劑等有機化合物可使洗液復原失效。因此，容器壁上附有大量油類、有機物時，應(yīng)先除去。4.洗液的酸性和氧化性很強，使用時應(yīng)格外注意，千萬不要滴落在皮膚或衣物上，以免灼傷或燒壞。5.洗液顏色由深棕色變?yōu)榫G色時，說明洗液已經(jīng)失效，應(yīng)停止使用，更換新液。因重鉻酸變成硫酸鉻后不再具有氧化性。注：重鉻酸鉀洗液的配

9、制 取重鉻酸鉀20g溶于20ml蒸餾水中，加熱至沸。冷卻后再將200ml濃硫酸慢慢參加，邊加邊攪拌。注意：此時可產(chǎn)生高熱。為防止容器破裂，應(yīng)選用耐酸搪瓷缸或耐高溫的玻璃器皿，切忌用量筒及試劑瓶等配制。為防止洗液吸收空氣中的水分而被稀釋變質(zhì)，洗液應(yīng)貯存于帶蓋的容器中。當清潔效力降低時，再參加少量重鉻酸鉀及濃硫酸就可繼續(xù)使用。二. 吸量管的使用 吸量管和定量吸(移)液器(微量加樣器)均為用來轉(zhuǎn)移一定體積溶液的量器。 吸量管：生化實驗中常用的有三種，最常用的是刻度吸量管。1.刻度吸量管：刻度吸量管的種類： 按容量規(guī)格來分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等數(shù)種。其精密度按不同

10、的容積可達移取量的0.11%。通常將管身標明的總?cè)萘糠挚虨?00等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其余類推。 按“零點位置來分，有“O點在吸量管上端的即讀數(shù)從上而下逐漸增大，也有“O點在吸量管下端的讀數(shù)從下而上逐漸增大)。兩種標示方法，在使用時各有方便之處。 按刻度方法來分，刻度吸量管也有兩種，一種是刻度刻到尖端的，將液體放出時，應(yīng)吹出殘留在吸量管尖端的少量液體(我實驗室的刻度吸量管全部是這一種)，另一種是刻度不刻到尖端的。 刻度吸量管的正確使用方法：用右手拇指和中指夾住管身，將吸量管的尖端伸入試液深處，左手持洗耳球把試液吸入管內(nèi)至高過刻度以上

11、時，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制試液的泄放。吸液后應(yīng)盡量使吸量管保持垂直，使右眼與刻度等高，稍微輕抬食指或輕輕轉(zhuǎn)動吸量管，使試液面緩慢降落，至管內(nèi)試液彎月面的最低點與吸量管的刻度線相齊為止。然后將吸量管插到需加試劑的容器中，讓尖端與容器內(nèi)壁靠緊，松開食指讓液體流出。液體流完后再等15秒鐘，捻動一下吸量管后移去如需吹的吸量管，那么吹出尖端的液體后再捻轉(zhuǎn)一下吸量管移去。 使用刻度吸量管的考前須知： 選擇適當規(guī)格的吸量管：吸量管的最大容積應(yīng)等于或略大于所需容積ml數(shù)。 仔細看清吸量管的刻度情況：刻度是否包括吸量管尖端的液體？讀數(shù)方向是從上而下，還是從下而上？ 拿吸量管時，刻度一定要面向自己

12、，以便讀數(shù)。 吸取試劑時應(yīng)注意三點：一是先吹去吸量管內(nèi)可能存在的殘留液體，二是將吸量管插入試劑液面深部(以免吸液過程中因液面降低而吸入空氣產(chǎn)生氣泡或管內(nèi)試劑進入洗耳球)，三是使用洗耳球(不可直接用口吸)。 按吸量管上口時應(yīng)該用食指，不能用拇指。 吸取粘滯性大的液體(如血液、血漿、血清等)時，除選用適宜的吸管(奧氏管)外，應(yīng)注意拭凈管尖附著的液體，盡量減慢放液速度(用食指壓力控制)，待液體流盡后吹出管尖殘留的最后一滴液體。 使用的吸量管應(yīng)干凈、枯燥無水。如急用而又有水時，可用少量欲取試劑沖洗3次，以免試劑被稀釋。 2.移液吸量管：也有兩種，常見的一種是吸量管的上端只有一個刻度，另一種是除了在吸量

13、管上端有刻度外，在吸量管下端狹窄處也有一刻度線。無論哪一種，在使用時將量取的液體放出后，只需將吸量管的尖端觸及受器壁約半分鐘即可，不得吹出尖端的液體。3.奧氏吸量管：準確度最高，使用時必需吹出留在尖端的液體。 定量吸(移)液器(微量加樣器)：定量吸液器是吸量管的革新產(chǎn)品。由塑料制成。目前，因產(chǎn)地廠家不同其質(zhì)量、價格差異十分懸殊。 1.定量吸液器的優(yōu)點：使用方便，取、加樣迅速，計量準確，不易破損，能吸取多種樣品只換吸嘴即可。2.定量吸液器的類型：有兩種類型。 固定式：只能取加一定容量的試劑，不能隨意調(diào)節(jié)取加樣量。其規(guī)格有10l、20l、25l、30l、50l、100l、200l、250l、300

14、l、400l、500l、1000l等。 可調(diào)式：在一定容量范圍內(nèi)可根據(jù)需要進行調(diào)節(jié)取加樣量。例如規(guī)格為50200l的可調(diào)式定量吸液器，可以在50到200l的范圍內(nèi)根據(jù)需要調(diào)節(jié)成設(shè)計容許的各種取加樣容量60l、85l、110l、170l、200l等。 一般來講，固定式吸液器比擬準確，可調(diào)式吸液器使用較為方便。3.定量吸液器的使用方法： 選擇適當?shù)奈浩?。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要輕輕旋緊一下，以保證結(jié)合嚴密。 持法：右手四指除大拇指外并攏握住吸液器外殼使外殼突起局部搭在食指近端，大拇指輕輕放在吸液器的按鈕上。 取樣(吸液)：用大拇指按下按鈕到第一停止點，以排出一定容量的空氣，隨后把吸嘴

15、尖浸入取樣液內(nèi)，徐徐松開大拇指，讓按鈕慢慢自行復原，取樣即告完成。 排液：將吸液器的吸嘴尖置于加樣容器壁上，用大拇指慢慢地將按鈕按下到第一停止點，停留1秒鐘粘性較高的溶液停留時間應(yīng)適當延長。然后再把按鈕按到第二停止點上，讓吸嘴沿管壁向上滑動。當吸嘴尖與容器壁或溶液離開時，方可釋放按鈕，使其恢復到初始位置。 吸液器用后應(yīng)及時取下吸嘴。將吸嘴用自來水沖洗后浸入盛水的容器內(nèi)以防干涸，待實驗結(jié)束后集中仔細清洗。三. 溶液的混勻 1 混勻的目的： 使反響體系內(nèi)的各種物質(zhì)分子很好地互相接觸，充分進行反響；使欲稀釋的溶液成為濃度均一的溶液。 混勻的方法通常有以下幾種： 使盛器作離心運動。 左手持試管上端，用

16、右手指輕擊試管下半部，使管內(nèi)溶液作旋轉(zhuǎn)運動。 利用旋渦混合振蕩器混勻。 不得已時可用枯燥清潔的玻璃棒攪勻。 混勻的考前須知：防止盛器內(nèi)的液體濺出或被污染。嚴禁用手指堵塞管口或瓶口震蕩混勻。 實驗一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗一 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反響一、 實驗目的：1、 了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的根本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式。2、 了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反響原理。3、 學習幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。二、 實驗原理呈色反響蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中某種化學鍵或氨基酸殘基中的某些化學基團能與特定的化學試劑產(chǎn)生特定的有色物質(zhì)，稱為蛋白質(zhì)的呈色反響。各種蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基不完全相同，因此產(chǎn)生的顏色也不完全一樣。

17、當然呈色反響并不一定是蛋白質(zhì)的專一反響，某些非蛋白質(zhì)類物質(zhì)也能產(chǎn)生類似折顏色。因此，不能僅僅根據(jù)呈色反響的結(jié)果來判斷被測物質(zhì)是否為蛋白質(zhì)。 一雙縮脲反響B(tài)irut reaction 1、原理尿素加熱至180左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反響稱為雙縮脲反響。蛋白質(zhì)分子有肽鍵。其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反響?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。硫酸銅加熱注意：雙縮脲反響不僅含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)所有。含有一個肽鍵和一個CSNH2， CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH，或CHOHCH2NH2等基團的物質(zhì)以及乙二酰二胺O=CNH2CNH

18、2=O等物質(zhì)有此反響。 NH3也干擾此反響，因為NH3與Cu2+可生成暗藍色的絡(luò)離子Cu(NH3)42+，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反響，但有雙縮脲反響的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。2、 試劑1尿素 10g 32%硫酸銅溶液 60mL2)10%氫氧化鈉溶液 250mL 50.5 %Glu溶液42%卵清蛋白溶液 (1:6) 80mL 雞蛋清用蒸餾水稀釋6倍，通過23層紗布濾去不溶物即得。 3、 操作取少量尿素結(jié)晶火柴頭大小，放在枯燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨基酸，形成雙縮脲。冷卻備用，為1號。再取兩支：分別參加卵清蛋白溶液和Glu溶液，為2

19、號和3號。編 號123雙縮脲少許卵清蛋白1mlGlu(1ml)10% NaOH 滴5552% CuSO4 (滴)111現(xiàn) 象在上述三支試管中分別進行如下操作：加10%氫氧化鈉溶液約5滴，振蕩混勻，再加2%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要防止添加過量硫酸銅，否那么，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。搖勻，再加2%硫酸銅溶液1滴，隨加隨振蕩。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。二茚三酮反響 1、原理除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反響產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有-氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反響生成藍紫色物質(zhì)。該反響十分靈敏，1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能反響，是一種常用的氨基酸定量測定方法。-丙氨酸、

20、氨和許多一級胺都呈正反響。尿素、馬尿酸、二酮吡嗪和肽鍵上的亞氨基不呈現(xiàn)此反響。因此，雖然蛋白質(zhì)和氨基酸均有茚三酮反響，但能與茚三酮呈陽性反響的不一定就是蛋白質(zhì)或氨基酸。在定性、定量測定中，應(yīng)嚴防干擾物存在。茚三酮反響分為兩步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被復原成復原型茚三酮；第二步是所形成的復原型茚三酮與另一個水合根本分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。反響機理如下： 此反響的適宜pH為57，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過在時甚至不顯色。 2、試劑 1蛋白質(zhì)溶液 100mL 2%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液蛋清：水=1：620.3% Glu溶液 80

21、mL 30.1% 茚三酮水溶液 50mL3、操作取2支試管分別參加蛋白質(zhì)溶液和Glu氨酸溶液1mL，再各加23滴0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱12分鐘，觀察顏色由粉紅色變紫紅色再變藍。1卵清蛋白2Glu3 (Tyr)體積ml111茚三酮滴333實驗三、蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗三 蛋白質(zhì)的等電點測定一、 實驗目的：1、 了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。2、 學習測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法。二、 實驗原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在以下平衡：其分子中所含的自由氨基和羧基均可能解離。當溶液的pH值大于蛋白質(zhì)的等電點，氨基的解離胺到抑制而羧基的解離度增大，此時蛋白質(zhì)分子為帶負電荷的陰離子。反之

22、，當溶液的pH小于蛋白質(zhì)等電點時，羧基的解離受到抑制而氨基的解離增加，而使蛋白質(zhì)分子帶正電荷。蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的pH 到達一定數(shù)值時，蛋白質(zhì)顆粒上正負電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點。不同蛋白質(zhì)各有其等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。 本實驗借觀察在不同pH 溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中參加酪蛋白后

23、，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH即為酪蛋白的等電點。三、 實驗器材水浴鈉、溫度計、200ml錐形瓶、100mL容量瓶、吸管、試管、試管架、乳缽四、 實驗試劑1、0.5%酪蛋白醋酸鈉溶液 200mL取純酪蛋白干酪素0.05 g加蒸餾水20mL及1mol/LNaOH溶液5mL，混合使之溶解，再加1mol/L HAc溶液5mL，定容至50mL即可。2、1.00mol/L醋酸溶液 100mL3、0.10mol/L醋酸溶液 100mL4、0.01mol/L醋酸溶液 50mL五、 實驗操作1） 取同樣規(guī)格的試管5支，按下表順序分別精確地參加各試劑，然后混勻。 試 劑編 號蒸餾水mL0.01mol/L 醋酸(m

24、L)0.1mol/L 醋酸(mL)1.0mol/L 醋酸(mL)pH14.190.315.924.370.135.334.00.54.742.52.04.153.70.83.5pI2) 向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4、5管的pH依次為5.9、5.3、4.7、4.1、3.5。 觀察其混濁度，靜置10分鐘，再觀察其混濁度。最混濁的一管即為酪蛋白的等電點。實驗十四、酶的性質(zhì)一、實驗目的1.通過本實驗觀察、驗證酶的專一性和溫度、pH、沖動劑及抑制劑對酶活性的影響。2.熟悉淀粉及其酶解產(chǎn)物的特殊顯色方法；電熱恒溫水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集與預處

25、理。二、實驗原理酶具有高度專一性，一種酶只能催化一種或一類底物發(fā)生反響，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。當?shù)矸郾坏矸勖笍氐姿鉃閺驮喳溠刻呛推咸烟菚r，能使班氏試劑的Cu2+復原成Cu1+，生成磚紅色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受溫度、pH、沖動劑及抑制劑、酶濃度以及作用時間等多種因素影響，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可與碘反響生成紫色、棕色或紅色絡(luò)合物。通過上述特征性反響，并以蔗糖等作對照，便可觀察、驗證淀粉酶是否具有專一性以及它的催化活性是否受到影響。三、試劑和器材一、器材1、滴管、燒杯、試管架及試管夾 。2、恒溫水浴箱與水浴鍋。3、脫脂棉、漏斗及紗布。4

26、、白瓷反響盤二試劑1、1淀粉  稱取淀粉1g，加少量水調(diào)成糊狀，參加煮沸的0.3NaCl溶液至100m1。2、1蔗糖溶液3、班氏試劑  A液：取檸檬酸鈉173，無水碳酸鈉100，加水600ml，加熱溶解，冷卻后稀釋至850ml；B液：取結(jié)晶硫酸銅CuSO4·5H2O17.3溶于100ml預熱的蒸餾水中，冷卻后加水至150ml。將A液緩慢倒入B液中混勻置試劑瓶備用。4、碘液：稱取碘4g、碘化鉀6g溶于l000ml蒸餾水中，置棕色瓶內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?、各種pH緩沖液1pH6.8緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L檸檬酸溶液228ml混合

27、即成。2 pH4.0緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L檸檬酸溶液614.5ml混合即成。3pH8.0緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L檸檬酸溶液28ml混合即成。6、0.9 NaCl 溶液 7、1CuSO4 溶液         8、1Na2SO4溶液四、操作步驟一、唾液淀粉酶的收集與處理1.制備唾液實驗者先將痰咳盡，用自來水漱口，以去除口腔內(nèi)食物殘渣，再在口腔內(nèi)含蒸餾水約15ml，并作咀嚼咕漱運動，3分鐘后吐入墊有兩層經(jīng)潤濕

28、處理的脫脂紗布的漏斗內(nèi)，過濾于小燒杯中備用，為與下面稀釋唾液相區(qū)別，此稱制備唾液。2.煮沸唾液 取上述唾液約2ml，盛入1中號試管中,置沸水浴煮沸5分鐘備用。3.稀釋唾液 調(diào)整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37和既無沖動劑又無抑制劑條件下，作用5min，水解淀粉至紅色糊精為宜。具體做法是取12凹白瓷反響板一塊，按以下步驟操作：第1排每凹各加1滴制備唾液，12、13、14凹分別加生理鹽水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到濃1412小心混勻各凹，勿使濺入相鄰凹中。每混勻一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀釋唾液應(yīng)全部放回原凹中。在盛有不同稀釋度唾液的第2排各凹中，均參加4滴緩沖液pH6

29、.8，2滴1%的淀粉液和2滴蒸餾水，用混勻法充分混勻，置37下5min。在第2排各凹中加I液一滴，混勻，觀察比擬各凹顏色，以淺棕-紅色對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，用生理鹽水稀釋3ml制備唾液備用。個人收集整理 勿做商業(yè)用途二唾液淀粉酶的專一性以及溫度、pH、激活劑和抑制劑對唾液淀粉酶活性影響的觀察1、取試管3支編號，按下表1操作表1  唾液淀粉酶專一性的實驗觀察  試劑   試管pH6.8緩沖液1淀粉溶液1蔗糖溶液制備唾液煮沸唾液120滴10滴5滴220滴10滴5滴320滴10滴5滴將上述各管混勻后，置37水浴中保溫10分鐘，然后每管參加班氏試劑20滴，再

30、放入沸水浴中煮沸約15分鐘，觀察各管顏色反響，并說明原因。三溫度影響酶促反響的實驗觀察1.取試管3支編號，按下表2操作：表2  溫度影響酶促反響的實驗觀察管號試劑123緩沖液20滴20滴20滴2.1淀粉溶液10滴10滴10滴3.預熱5min37水浴沸水浴冰浴4.直接參加稀釋唾液，立即混勻、計時5滴5滴5滴5.保溫10min37水浴沸水浴冰浴2.將一、二管移入冰水浴中，待各管溫度一致后速向各管參加碘液1滴，混勻后觀察各管顏色的區(qū)別，并說明溫度對酶促反響的影響。四、pH影響酶促反響的實驗觀察1. 取試管3支編號，按下表3操作：表3  pH影響酶促反響的實驗觀察 pH4

31、.0緩沖液pH6.8緩沖液pH8.0緩沖液1淀粉溶液稀釋唾液試管120滴10滴5滴試管220滴10滴5滴試管320滴10滴5滴2.將上述各管混勻后，置37水浴中保溫10分鐘，然后每管參加碘液1滴，混勻后觀察各管顏色的區(qū)別，并說明pH對酶促反響的影響。五、沖動劑和抑制劑影響酶活性的實驗觀察1. 取試管4支編號，按下操作：表4  沖動劑和抑制劑影響酶活性的實驗觀察管號pH 6.8緩沖液1淀粉溶液蒸餾水0.9NaCl1CuSO41Na2SO4稀釋唾液120滴10滴10滴5滴220滴10滴10滴5滴320滴10滴10滴5滴420滴10滴10滴5滴2. 將上述各管放入37水浴中保溫10分鐘，然

32、后每管參加碘液1滴，混勻后觀各管顏色的區(qū)別，并說明沖動劑和抑制劑對酶促反響的影響?？记绊氈?.反響試管應(yīng)清洗干凈，不同酶液、試劑及其滴管不能交叉混用；2.使用混合唾液，或通過預試選出適宜的唾液稀釋度，效果更為顯著。思考題1.簡述溫度、pH、沖動劑及抑制劑、酶濃度等因素影響對淀粉酶活性的影響。2.簡述淀粉酶活性測定的原理及考前須知。實驗十五 維生素C的定量測定2,6-二氯酚靛酚滴定法 一、目的要求 1學習并掌握定量測定維生素C的原理和方法。2了解蔬菜、水果中維生素C含量情況。 二、實驗原理  維生素C是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺少它時會產(chǎn)生壞血病，因

33、此又稱為抗壞血酸ascorbic acid。它對物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。近年來，發(fā)現(xiàn)它還有增強機體對腫瘤的抵抗力，并具有化學致癌物的阻斷作用。 維生素C是具有L系糖型的不飽和多羥基物，屬于水溶性維生素。它分布很廣，植物的綠色局部及許多水果如橘子、蘋果、草莓、山楂等、蔬菜黃瓜、洋白菜、西紅柿等中的含量更為豐富。 維生素C具有很強的復原性。它可分為復原性和脫氫型。金屬銅和酶抗壞血酸氧化酶可以催化維生素C氧化為脫氫型。根據(jù)它具有復原性質(zhì)可測定其金屬含量。 復原型抗壞血酸能復原染料2,6-二氯酚靛酚DCPIP，本身那么氧化為脫氫型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈紅色，復原后變?yōu)闊o色。因此，當

34、用此染料滴定含有維生素C的酸性溶液時，維生素C尚未全部被氧化前，那么滴下的染料立即被復原成無色。一旦溶液中的維生素C已全部被氧化時，那么滴下的染料立即使溶液變成粉紅色。所以，當溶液從無色變成微紅色時即表示溶液中的維生素C剛剛?cè)勘谎趸?，此時即為滴定終點。如無其它雜質(zhì)干擾，樣品提取液所復原的標準染料量與樣品中所含復原型抗壞血酸量成正比。本法用于測定復原型抗壞血酸，總抗壞血酸的量常用2,4-二硝基苯肼法和熒光分光光度法測定。  三、實驗器材. 錐形瓶100ml，組織搗碎器，吸量管10ml，漏斗，濾紙，微量滴定管5ml，容量瓶100ml，250ml。四、實驗試劑1、蘋果、卷心菜等。2、2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸餾水中。3、1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸餾水中。4、標準抗壞血酸溶液1mg/ml: 準確