基因工程所需的基本條本

1、基因工程所需的基本條本基因工程操作過(guò)程第1頁(yè)/共203頁(yè) 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對(duì)基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。第2頁(yè)/共203頁(yè) 一類來(lái)源于原核生物的，能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列（回文序列，48bp），并切割DNA雙鏈,使磷酸二酯鍵斷開(kāi)的核酸內(nèi)切酶。 1.定義第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction endonuclease ）第3頁(yè)/共203頁(yè)II型限制性內(nèi)切酶：同型二聚體結(jié)構(gòu)與DNA雙鏈結(jié)合，兩個(gè)催化Mg2+與DNA裂解位點(diǎn)相鄰限制性內(nèi)切酶EcoR

2、I的結(jié)構(gòu)第4頁(yè)/共203頁(yè) （2）修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù),不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。2、細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）（1）限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。第5頁(yè)/共203頁(yè)研究發(fā)現(xiàn)，限制-修飾系統(tǒng)廣泛存在在原核細(xì)菌中，與三個(gè)連鎖基因相關(guān)：Genes for restriction-modification enzymes are often clustered together in a region called an immigration control region.

3、The immigration island from E. coli K-12 is about 14 Kbp. 第6頁(yè)/共203頁(yè)噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)菌后，其基因組DNA被降解第7頁(yè)/共203頁(yè)3、類型分類的主要依據(jù)： 亞單位組成 識(shí)別序列的種類 是否需要輔助因子 分三類(I, II ,III) 第8頁(yè)/共203頁(yè)第9頁(yè)/共203頁(yè) （1）酶結(jié)構(gòu)三亞基，包括：R（限制酶亞基）；M（甲基化酶亞基）；S（識(shí)別DNA序列亞基）（2）切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)1000 bp以外，無(wú)特異性4、I型限制性內(nèi)切酶首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的，如 E

4、coB和 EcoK，研究較少。Recognize sitecut1-1.5kb第10頁(yè)/共203頁(yè)（3）結(jié)合方式 I類限制性內(nèi)切酶與DNA結(jié)合依賴M亞基與輔助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用。 第11頁(yè)/共203頁(yè)例子：EcoB的識(shí)別序列為T-G-A*-N8-T-G-C-TA-C-T-N8-A*-C-G-AEcoK的識(shí)別序列為A-A*-C-N8-G-T-G-CT-T-G-N8-C-A*-C-G第12頁(yè)/共203頁(yè) 2. II類限制性內(nèi)切酶(93%) （1）酶結(jié)構(gòu) 修飾和限制活性由分開(kāi)的兩個(gè)酶(甲基化酶和限制性內(nèi)切酶)來(lái)完成，其中甲基化酶由一條肽鏈構(gòu)成，限制酶由相反方向結(jié)合的同源二聚體構(gòu)

5、成。 第13頁(yè)/共203頁(yè) （2）識(shí)別序列 DNA雙鏈上的回文對(duì)稱序列（旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列，反向重復(fù)序列），一般長(zhǎng)4-8bp ，與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。 EcoR I： 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5EcoR V 第14頁(yè)/共203頁(yè)EcoR I 5EcoR I 5-GAATTC-3-GAATTC-3 3 3-CTTAAG-5-CTTAAG-5 Pst I 5Pst I 5-CTGCA-CTGCAG-3G-3 3 3-G-GACGTC-5ACGTC-5 產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生粘性末端EcoR V 5EcoR V 5-GAT-GATATC-3ATC-3 3 3-CTA-CTATAG-5TAG-5 產(chǎn)

6、生平齊末端產(chǎn)生平齊末端（3）切割位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)處切開(kāi)雙鏈DNA，形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。第15頁(yè)/共203頁(yè)幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 第16頁(yè)/共203頁(yè)（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端分兩種類型： 5端凸出（如EcoR I切點(diǎn)）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 第17頁(yè)/共203頁(yè)EcoR

7、I等產(chǎn)生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHP第18頁(yè)/共203頁(yè)P(yáng)st I等產(chǎn)生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-

8、C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP第19頁(yè)/共203頁(yè)P(yáng)vuII等產(chǎn)生的平頭末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 第20頁(yè)/共203頁(yè)粘性末端促進(jìn)連接便利 i）不

9、同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。第21頁(yè)/共203頁(yè)第22頁(yè)/共203頁(yè)識(shí)別相同序列的限制性內(nèi)切酶稱同裂酶。 （5）同裂酶（Isoschizomers)同序同切酶（完全同裂酶）： 識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。 如Hind 和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 第23頁(yè)/共203頁(yè)識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。 如Xma I 和 Sma I。 同序異切酶（不完全同裂酶）：Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sm

10、a I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 第24頁(yè)/共203頁(yè) 識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等 （6）同尾酶(Isocaudamers） 第25頁(yè)/共203頁(yè) Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來(lái)的酶識(shí)別。BamH IBgl BamH IBgl Sau 3A第26頁(yè)/共203頁(yè)（7）DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響Pst IG GCTGCAGCTGCAGC C TGCATGCACTGCAGCTGCAGTGCA TGCA AAAACTGCAGCTGCAGAACCAAAACCAA0 10 90

11、0 10 90 EcoR I G GGAATTCGAATTCC C CGCGGAATTCGAATTCCG CG CCGCCGGAATTCGAATTCCGG CGG 90 90 90 90 90 90第27頁(yè)/共203頁(yè)（8）酶切反應(yīng)條件緩沖液：MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強(qiáng)度 Tris-HCl： 維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定反應(yīng)溫度：大多數(shù)為37反應(yīng)時(shí)間：通常1h,許多酶延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可減少酶量終止酶切的方法：a、10mM/LEDTAb、加熱，大多數(shù)酶可用65溫育20分鐘失活C、苯酚抽提蛋白，然后用乙醇沉淀DNA第2

12、8頁(yè)/共203頁(yè) 一個(gè)酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37）下，50L反應(yīng)體系中完全降解1g DNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：A DNA的純度和甲基化程度B 甘油的含量（不超過(guò)5%）C 反應(yīng)體系中的離子強(qiáng)度D 反應(yīng)體系的pH值F 反應(yīng)的溫度條件（通常為37 ）Buffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 酶單位的定義和影響酶活性的因素第29頁(yè)/共203頁(yè)酶 切 反 應(yīng) 的 基 本 步 驟電泳紫外分析37 1h加反應(yīng)液CKM1.0kb1.0kb0.4kb0.5

13、kb0.6kbCKMTT酶量的確定：2-3 倍才能保證完全消化；第30頁(yè)/共203頁(yè)（10）雙酶切反應(yīng)1）對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切2）對(duì)鹽濃度要求不同的酶，也可采取同步雙酶切：選擇能讓兩種酶同時(shí)作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。3）如果找不到一種可以同時(shí)適合兩種酶的緩沖液，就只能采用分步酶切。分步酶切應(yīng)從反應(yīng)要求鹽濃度低的酶開(kāi)始，酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切反應(yīng)。第31頁(yè)/共203頁(yè)第32頁(yè)/共203頁(yè) 3. III類限制性內(nèi)切酶（1%） 由R亞基和MS亞基二亞基組成雙功能酶，其中MS亞基具有位點(diǎn)識(shí)別和甲基化修飾雙重活性。在切割位點(diǎn)下

14、游24-26bp處，反應(yīng)需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 該類酶與DNA識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)合嚴(yán)格依賴ATP。修飾作用和切割作用取決于兩個(gè)亞基之間的競(jìng)爭(zhēng)。修飾作用在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行。切割序列位于識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)若干堿基對(duì)處，無(wú)序列特異性。在基因工程操作中用途不大。 第33頁(yè)/共203頁(yè)EcoP15I M.EcoP15I 第34頁(yè)/共203頁(yè)1973年H.O Smith和D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下： 三、限制性內(nèi)切酶的命名 1.用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名。 大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血

15、菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。2. 用一個(gè)大寫(xiě)字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR。 3. 如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoR I，EcoR V。第35頁(yè)/共203頁(yè)限制性核酸內(nèi)切酶的命名第36頁(yè)/共203頁(yè)四、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1. DNA的純度 DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。 一般采取純化DNA，如用2.5倍體積的冰冷乙醇沉淀加大酶的用量 延長(zhǎng)保溫時(shí)間 擴(kuò)大反應(yīng)體積（ 20l）第37頁(yè)/共203頁(yè)2.DNA的甲基化程度大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：da

16、m甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木?！第38頁(yè)/共203頁(yè)3. 溫度不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC ，少數(shù)要求40-65 oC 。酶酶最適最適溫度溫度o oC C酶酶最適最適溫度溫度o oC C酶酶最適最適溫度溫度o oC CApa I Apa I Bcl I Bcl I Mae II Mae II 30 30 50 50 50 50 Apy I Apy I BstE II BstE II Mae IIIMae III30 30 60 60 5555Ban I Ban I Mae I M

17、ae I Sma ISma I50 50 45 45 2525第39頁(yè)/共203頁(yè)4. 緩沖液(Buffer)是影響限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強(qiáng)度； Tris-HCl： 維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定； 第40頁(yè)/共203頁(yè)第二節(jié) 基因工程中常用的DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶 2. Klenow 片段3. T4 噬菌體DNA聚合酶4. T7 噬菌體DNA聚合酶 5. 反轉(zhuǎn)錄酶6.末端轉(zhuǎn)移酶第41頁(yè)/共203頁(yè)1. 共同特點(diǎn)把dNTPs

18、連續(xù)地加到引物的3OH端。2.主要區(qū)別持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。 如：T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來(lái)。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來(lái)。常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)第42頁(yè)/共203頁(yè)1. 大腸桿菌DNA聚合酶 I（1）大腸桿菌DNA聚合酶I（DNA Pol I）的性質(zhì)一條多肽單鏈53 DNA聚合酶活性53外切酶活性，位于N端，用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的53外切酶活性部分，就成為Klenow fragment 3 5外切酶活性。 第43頁(yè)/共203頁(yè) 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） M

19、g2+ 帶有3OH游離端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I的反應(yīng)條件-OH5 3 dNTPs第44頁(yè)/共203頁(yè)5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 （3）DNA聚合酶I基本用途：制備32P標(biāo)記的探針DNAase IDNA Pol IMg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a-

20、32P-dATP）DNAase I：為一內(nèi)切核酸酶，它優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA，形成單鏈切口 第45頁(yè)/共203頁(yè)2. Klenow fragment（1）Klenow fragment的性質(zhì)具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草桿菌蛋白酶第46頁(yè)/共203頁(yè) 3端補(bǔ)平補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3隱蔽端。5 5 klenow DNA 3末端標(biāo)記在3隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途第47頁(yè)/共203頁(yè)3隱蔽末端的DNA片斷Klenow fragment補(bǔ)平根據(jù)

21、末端的順序選擇一種 a-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA 限制性內(nèi)切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH Ia-32P-dATPa-32P-dGTP25oC 1h第48頁(yè)/共203頁(yè)（1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì)從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。有53聚合酶活性和35外切酶活性（約為Klenow 片段活性的200倍）。3. T4 DNA聚合酶用35外切酶活性作用于末端制造出3隱蔽端。再利用它的53聚合酶

22、活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。第49頁(yè)/共203頁(yè)5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶無(wú)dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs5 5 當(dāng)沒(méi)有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隱蔽端。當(dāng)有dNTP時(shí)， T4DNA聚合酶行使53聚合酶功能，填平3隱蔽端。第50頁(yè)/共203頁(yè)5. 逆轉(zhuǎn)錄酶 依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶），來(lái)源于RNA腫瘤病毒,最普遍使用的是來(lái)源于鳥(niǎo)類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）。作用：以oligo dT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合），合成cDNA。

23、AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA第51頁(yè)/共203頁(yè)不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 末端轉(zhuǎn)移酶Mg2+ dATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH3 p 5 6.末端轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于小牛胸腺，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶?？稍赾DNA或載體的3末端加同聚物尾巴，便于克隆。第52頁(yè)/共203頁(yè)一、連接酶1. 兩種DNA連接酶（1）大腸桿菌連接酶:只能連接粘性末端。（2）T4噬菌體的連接酶:不但能連接粘性末端,還能連接齊平末端。2. 連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。 （2）DNA3端有游離的-OH,5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)。（3

24、）需要能量 動(dòng)物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中: NAD+第三節(jié) 其它分子克隆工具酶第53頁(yè)/共203頁(yè)OHP3、功能：（1）修復(fù)DNA鏈上切口處的磷酸二酯鍵：T4-DNA連接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5nick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5第54頁(yè)/共203頁(yè)（2）連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P

25、-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶第55頁(yè)/共203頁(yè)4、 連接反應(yīng)的溫度最佳溫度：連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。實(shí)用溫度：在37下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定，所以一般采用 416 C。插入片段與載體的濃度比例： 1020倍（摩爾之比）目的：增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。第56頁(yè)/共203頁(yè)DNA連接酶DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50 - 100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 ul4 - 15 4 - 16 hr

26、1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下16 反應(yīng) 1 小時(shí)，完全連接 1 g -DNA（Hind III片段）所需的酶量第57頁(yè)/共203頁(yè) 二、堿性磷酸酶1. 堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來(lái)，具有抗熱性。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP從小牛腸中純化出來(lái)，SDS中加熱68oC可完全失活。第58頁(yè)/共203頁(yè)2. 堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3

27、 HO-OH堿性磷酸酶3. 堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體分子自我連接第59頁(yè)/共203頁(yè)單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTT TTCGAAHind酶切A-OH TTCGA-PP-AGCTT HO-A堿性磷酸酶5 5 5 第60頁(yè)/共203頁(yè)A-OH TTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。第61頁(yè)/共203頁(yè)ATTCGA AGCTT AAGCTTA A TTCGA 連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)。3 P-AGCT

28、TA-OH5 3 HO-ATTCGA-P5 外源DNA第62頁(yè)/共203頁(yè)四、核酸酶1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII） 大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII35353535第63頁(yè)/共203頁(yè)2、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）大腸桿菌的核酸外切酶 III 特異性地從3 端外切ExoIII3535Mg2+3535第64頁(yè)/共203頁(yè)Exo3535Mg2+3、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶（ Exo） 核酸外切酶特異性地從5 端外切3535第65頁(yè)/共203頁(yè)4、單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來(lái)自稻谷曲霉菌（Aspergillus

29、 oryzae）降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍Zn2+必需最適pH范圍為4.0 - 4.3需要NaCl 10 - 300 mM降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍第66頁(yè)/共203頁(yè)一、載體的功能及特征1、定義：把目的基因通過(guò)運(yùn)載工具送到受體細(xì)胞內(nèi)，這種運(yùn)載工具就叫載體（vector)。2、載體的特征1）在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制起點(diǎn)）2）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)，供外源DNA片斷插入，同時(shí)不影響復(fù)制3）有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選第四節(jié) 用于基因克隆的載體第67頁(yè)/共203頁(yè)質(zhì)粒載體（plasmid） 噬菌體載體（phage）動(dòng)物病毒（viru

30、s） 噬菌粒載體考斯質(zhì)粒（cosmid） 人造染色體（artifical chromosome）第68頁(yè)/共203頁(yè)二、質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（plasmid）：獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈、共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子,大小范圍在1kb-200kb以上不等。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。第69頁(yè)/共203頁(yè)致育質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒（fertility plasmid），編碼有性生殖功能，帶有F質(zhì)粒的細(xì)菌為雄性菌，能長(zhǎng)出性菌毛，無(wú)F質(zhì)粒的細(xì)菌為雌性菌，無(wú)性菌毛。 耐藥性質(zhì)粒編碼細(xì)菌對(duì)抗菌藥物或重金屬鹽類的耐藥性，耐藥性質(zhì)粒分為二類，其中可以通過(guò)細(xì)菌間的接合進(jìn)行傳遞的稱接合性耐藥質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒(r

31、esistance plasmid)。另一類是不能通過(guò)接合傳遞的非接合性耐藥質(zhì)粒，但它可通過(guò)噬菌體傳遞。細(xì)菌粘附定植在腸粘膜表面是由K質(zhì)粒決定的。 細(xì)菌素質(zhì)粒編碼各種細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素，如Col質(zhì)粒編碼大腸桿菌素，對(duì)同品系或近緣的細(xì)菌具有抑制作用，實(shí)際是對(duì)產(chǎn)生細(xì)菌素細(xì)菌本身起保護(hù)作用。 代謝質(zhì)粒編碼產(chǎn)生相關(guān)的代謝酶，如沙門菌發(fā)酵乳糖的能力通常是由質(zhì)粒決定的。 細(xì)菌攜帶有哪種質(zhì)粒，則有相應(yīng)的功能，但也有某種質(zhì)?？赏瑫r(shí)決定幾種功能，如F質(zhì)粒除有致育性功能外，還能提供輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的能力，某些耐藥性質(zhì)粒上還帶有編碼毒力的基因，故帶此種質(zhì)粒的細(xì)菌，不僅獲得了耐藥性，而且致病性也得到了增強(qiáng)。毒力質(zhì)?；騐i質(zhì)粒

32、（virulence plasmid）編碼與該菌致病性有關(guān)的毒力因子。第70頁(yè)/共203頁(yè) 天然質(zhì)粒用作載體的局限性天然質(zhì)天然質(zhì) 粒粒 相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量拷貝數(shù)拷貝數(shù)單一酶切位點(diǎn)單一酶切位點(diǎn)選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記復(fù)制類型復(fù)制類型pSC1015.81069.09 kb13EcoR Itetr嚴(yán)緊嚴(yán)緊ColE14.210620EcoR I大腸桿菌素大腸桿菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I (BamH I)ampr松弛松弛局限性：分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點(diǎn)少、選擇標(biāo)記不合適第71頁(yè)/共203頁(yè) 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（ Covalent close circular

33、DNA， cccDNA)，呈超螺旋（super coil ，SC ）一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。DNA超螺旋結(jié)構(gòu)第72頁(yè)/共203頁(yè)質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率：同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。SCOCL第73頁(yè)/共203頁(yè)2 2、質(zhì)粒的基本性質(zhì)、質(zhì)粒的基本性質(zhì) 1 1）質(zhì)粒的自主復(fù)制性）質(zhì)粒的自主復(fù)制性 質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNADNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。 根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型?？煞譃閮纱髲?fù)制類型。 嚴(yán)緊型質(zhì)

34、粒（嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmidstringent plasmid）拷貝數(shù)少拷貝數(shù)少，大約有大約有1-1-幾個(gè)拷貝。幾個(gè)拷貝。 松弛型質(zhì)粒（松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmidrelaxed plasmid）拷貝數(shù)多拷貝數(shù)多，有，有10106060份拷貝。份拷貝。 第74頁(yè)/共203頁(yè)2 2）質(zhì)粒的不相容性）質(zhì)粒的不相容性 任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒質(zhì)粒的不相容性的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。不相容性群。以大腸

35、桿菌的質(zhì)粒為例：以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE1ColE1、pMB1 pMB1 擁有相擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容；似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容； pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。第75頁(yè)/共203頁(yè)質(zhì)粒的不相容性分子機(jī)制： 兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定。因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。 兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，由于競(jìng)爭(zhēng)作用致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其

36、中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。 第76頁(yè)/共203頁(yè)質(zhì)粒不親和性a：在同一個(gè)細(xì)胞中含有兩種不相容的質(zhì)粒b：隨著細(xì)胞的分裂質(zhì)粒分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去c：在下一次細(xì)胞分裂之前，質(zhì)?？截悢?shù)加倍，但因?yàn)榇嬖诟?jìng)爭(zhēng)，增加拷貝數(shù)不同d：兩種不相容質(zhì)?？截悢?shù)比例發(fā)生變化，最終產(chǎn)生出只含有一種類型質(zhì)粒的子細(xì)胞第77頁(yè)/共203頁(yè)在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒:能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），多為低拷貝的大質(zhì)粒，含有完整的轉(zhuǎn)移操縱子基因（tra）和轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)。能在同種或親緣關(guān)系近的菌體細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。非接合型質(zhì)粒：不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用，多為高拷

37、貝的小質(zhì)粒，如大腸桿菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少轉(zhuǎn)移基因（tra），不能自主轉(zhuǎn)移，但由于含有與F質(zhì)粒類似的bom位點(diǎn)或誘動(dòng)基因mob（mobilization），因而能被帶有tra基因的轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒誘動(dòng)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。 3 3）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性第78頁(yè)/共203頁(yè)F因子：又叫致育因子，在某些大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種最具代表性的單拷貝的接合型質(zhì)粒，94kb，總共編碼19個(gè)轉(zhuǎn)移基因（tra），以三種形式存在。第79頁(yè)/共203頁(yè) 3 3、質(zhì)粒上的標(biāo)記基因、質(zhì)粒上的標(biāo)記基因 野生型的質(zhì)粒野生型的質(zhì)粒DNADNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)

38、生正常生長(zhǎng)非必需的附記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，但是加性狀，但是對(duì)對(duì)DNADNA重組分子的篩選具有重要意義重組分子的篩選具有重要意義 包括：包括： 物質(zhì)抗性：物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物機(jī)物 物質(zhì)合成：物質(zhì)合成：細(xì)菌毒素、天然色素、有機(jī)堿細(xì)菌毒素、天然色素、有機(jī)堿第80頁(yè)/共203頁(yè)第81頁(yè)/共203頁(yè)第82頁(yè)/共203頁(yè)第83頁(yè)/共203頁(yè)標(biāo)記基因用途：1）選擇標(biāo)記基因：鑒別目的DNA（載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)。2）篩選標(biāo)記基因：用于將攜帶了外源DNA片斷的重組子挑選出來(lái)。第84頁(yè)/共203頁(yè)4

39、、質(zhì)粒的命名 用小寫(xiě)字母p代表質(zhì)粒（plasmid），在p字母后用兩個(gè)大寫(xiě)字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)室名稱，再加上質(zhì)粒編號(hào)。如：pBR322：p表示一種質(zhì)粒，而“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322為編號(hào)。第85頁(yè)/共203頁(yè)1）克隆載體（cloning vector） ： 主要用于擴(kuò)增或保存DNA片斷，其上有復(fù)制子，最好是松弛型高拷貝；2）表達(dá)載體（expression vector）： 能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動(dòng)子；3）穿梭載體（shuttle vector）： 裝有針對(duì)兩種

40、不同受體的復(fù)制子，便于基因克隆。 這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。第86頁(yè)/共203頁(yè)1）克隆載體天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。第87頁(yè)/共203頁(yè) pSC101 8.8 kb,拷貝數(shù)5、四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 TetrColE1 6.5 kb,拷貝數(shù)20 30、大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒、氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Ampr第88頁(yè)/共203頁(yè)組成:它由三部分組成：來(lái)自pSCl01的四環(huán)素抗性基因Tetr來(lái)自RSF

41、2124的氨芐青霉素抗性基因Ampr。來(lái)自ColEl的衍生物pMBl的松弛復(fù)制起點(diǎn)ori第89頁(yè)/共203頁(yè)pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來(lái)源第90頁(yè)/共203頁(yè)特點(diǎn)特點(diǎn): :具有多個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。 Tetr中有BamH1切點(diǎn)（GGATCC）和Sal切點(diǎn)（GAATTC），Ampr中有Pst切點(diǎn)（CTGCAG）。利用ColEl的復(fù)制子，所以在細(xì)胞中是多拷貝的。第91頁(yè)/共203頁(yè)外源基因插入在Tetr中，基因型為Tets Ampr ；外源基因插入在Ampr中，基因型為Tetr Ampr；Tetr：在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長(zhǎng)；Tets：在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)；Ampr：在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基

42、上不生長(zhǎng)；Amps：在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)； 而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)的是非重組型。 這種在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活（insertional inactivation ）。 第92頁(yè)/共203頁(yè)pBR322質(zhì)粒載體tetr基因插入失活效應(yīng)第93頁(yè)/共203頁(yè)常用質(zhì)?？寺≥d體：常用質(zhì)粒克隆載體：pUCpUC系列系列 pUC18/19特點(diǎn)：具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷貝數(shù)（500-700個(gè)）。具有多克隆位點(diǎn)，很方便插入外源基因-互補(bǔ)含有一個(gè)來(lái)自于大腸桿菌的經(jīng)過(guò)加工的LacZ基因)第94頁(yè)/共203頁(yè)第95頁(yè)/共203頁(yè)OHHH

43、OHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONNpUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal-半乳糖苷酶的-肽段lacZMCSPlac突變型lac - E.coli溴氯吲哚第96頁(yè)/共203頁(yè)LacZ: 大腸桿菌的編碼-半乳糖苷酶基因，編碼1024個(gè)氨基酸，切斷乳糖的半乳糖苷鍵產(chǎn)生半乳糖和葡萄糖 LacZ: 編碼-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸 ，這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)MCS，但它并不破壞讀框，但是，若在該 DNA 小片段中再插入一個(gè)片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)-互補(bǔ)能力的 -半乳糖苷酶片段X-gal ：5-溴-4-

44、氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷，也是-半乳糖苷酶的一種生色底物，經(jīng)降解后可生成溴氯吲哚，呈藍(lán)色，也使大腸桿菌菌落從白色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色第97頁(yè)/共203頁(yè)-互補(bǔ)(Alpha complementation) ： 質(zhì)粒中插入lac Z基因，編碼N端146個(gè)氨基酸殘基（ -半乳糖苷酶的片段）。突變型lac - E.coli 可表達(dá)該酶的片段（酶的C端）。單獨(dú)存在的及片段均無(wú)半乳糖苷酶活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)共表達(dá)兩片段時(shí)，宿主細(xì)胞內(nèi)才有半乳糖苷酶活性，使底物X-gal特異性變?yōu)樗{(lán)色化合物，這就是所謂的 - 互補(bǔ)。 Blue White第98頁(yè)/共203頁(yè)2）真核表達(dá)質(zhì)粒酵母表達(dá)質(zhì)粒昆蟲(chóng)表達(dá)質(zhì)粒

45、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒第99頁(yè)/共203頁(yè)第100頁(yè)/共203頁(yè)啟動(dòng)子（promoter）：是與基因表達(dá)啟動(dòng)相關(guān)的順式作用元件，與RNA聚合酶特異結(jié)合，是基因轉(zhuǎn)錄的起始部位，分為兩類：一類是RNA聚合酶能夠直接識(shí)別的，另一類在與RNA聚合酶結(jié)合時(shí)需要蛋白質(zhì)輔助因子存在。序列特點(diǎn)：上游有-10，共同序列TATAAT （Pribnow box）；上游有-35，共同序列TTGACA第101頁(yè)/共203頁(yè)lLac啟動(dòng)子（Plac）：中等強(qiáng)度啟動(dòng)子，一般帶有l(wèi)acZ基因片段，實(shí)現(xiàn)-互補(bǔ)。l噬菌體左臂（PL)和右臂啟動(dòng)子（PR) ：是噬菌體早期左臂和右臂轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，啟動(dòng)效率高，廣泛使用的原核生物啟動(dòng)子。lT

46、rp啟動(dòng)子（Ptrp）：是強(qiáng)啟動(dòng)子，來(lái)源于大腸桿菌色氨酸操縱子， 在富含trp的培養(yǎng)基中處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)trp水平下降，Ptrp開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。lT7啟動(dòng)子（PT7）：來(lái)自于T7噬菌體晚期轉(zhuǎn)錄基因啟動(dòng)子，只能由T7聚合酶識(shí)別（其轉(zhuǎn)錄活性是大腸桿菌聚合酶6倍，因此PT7轉(zhuǎn)錄活性高。第102頁(yè)/共203頁(yè)lac 操縱元結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)序列結(jié)構(gòu)基因操縱子：以乳糖操縱子為例來(lái)說(shuō)明第103頁(yè)/共203頁(yè)異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)就是其中一種很強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)胞代謝而十分穩(wěn)定。第104頁(yè)/共203頁(yè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site，RBS

47、）：大腸桿菌中翻譯起始時(shí)，首先是核糖體30S小亞基識(shí)別并結(jié)合至mRNA5端的翻譯起始部位，該部位就是RBS。RBS包括起始密碼子ATG序列及其上游SD序列。SD序列：ATG上游311堿基處的保守序列AGGAG，可與小亞基中16S rRNA 3端富含嘧啶序列互補(bǔ)結(jié)合，mRNA必須有這一序列才能進(jìn)入核糖體。第105頁(yè)/共203頁(yè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（terminator）：是DNA分子中決定RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的一段回文核苷酸序列。分為兩類：不依賴因子的終止子的回文序列中富含GC堿基對(duì)，在回文序列的下游方向又常有68個(gè)AT堿基對(duì)；而依賴因子終止子中回文序列的GC對(duì)含量較少。在回文序列下游方向的序列沒(méi)有固定特

48、征，其AT對(duì)含量比前一種終止子低。 第106頁(yè)/共203頁(yè)大腸桿菌中蛋白表達(dá)形式大腸桿菌中蛋白表達(dá)形式 (1)(1)完整目的蛋白完整目的蛋白 (2)(2)融合蛋白融合蛋白：兩個(gè)或多個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框按一定順序連兩個(gè)或多個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框按一定順序連接在一起表達(dá)形成的蛋白。接在一起表達(dá)形成的蛋白。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)以后，有效的分離純化或分泌就成為獲得當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)以后，有效的分離純化或分泌就成為獲得目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵因素。通過(guò)以融合蛋白的形式表達(dá)，并利用目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵因素。通過(guò)以融合蛋白的形式表達(dá)，并利用載體編碼的蛋白或多肽的特殊性質(zhì)可對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離和載體編碼的蛋白或多肽的特殊性質(zhì)可對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離

49、和純化。用作分離的載體蛋白被稱為純化。用作分離的載體蛋白被稱為標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽（TagTag），），常用的有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（常用的有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-glutathione S-transferase, GSTtransferase, GST）、六聚組氨酸肽（）、六聚組氨酸肽（polyHis-6polyHis-6，6 6His His tagtag）、金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)）、金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A A或或G G（protein A, protein protein A, protein G G ）等。）等。第107頁(yè)/共203頁(yè)融合蛋白的表達(dá)載體（

50、1）GST融合表達(dá)載體GST是來(lái)源于血吸蟲(chóng)的小分子酶（26kDa），在E.coli易表達(dá)，在融合蛋白狀態(tài)下保持酶學(xué)活性，對(duì)谷胱甘肽有很強(qiáng)的結(jié)合能力。第108頁(yè)/共203頁(yè) GST表達(dá)載體在啟動(dòng)子tac和多克隆位點(diǎn)之間加入了兩個(gè)與分離純化有關(guān)的編碼序列，其一是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位點(diǎn)的編碼序列。當(dāng)外源基因插入到多克隆位點(diǎn)后，可表達(dá)出由三部分序列組成的融合蛋白。 將谷胱甘肽固定在瓊脂糖樹(shù)脂上形成親和層析柱，當(dāng)表達(dá)融合蛋白的全細(xì)胞提取物通過(guò)層析柱時(shí)，融合蛋白將吸附在樹(shù)脂內(nèi)，其它細(xì)胞蛋白就被洗脫出來(lái)。然后再用含游離的還原型谷胱甘肽的緩沖液洗脫，可將融合蛋白釋放出

51、來(lái)。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可獲得純化的目標(biāo)蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位點(diǎn)外，其它還有腸激酶。第109頁(yè)/共203頁(yè)（2）his(組氨酸）標(biāo)簽表達(dá)載體啟動(dòng)子下游有一段編碼6個(gè)組氨酸的序列，多聚組氨酸肽能與2價(jià)金屬離子結(jié)合（鎳離子），將鎳離子固定在樹(shù)脂上，便可對(duì)帶His標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行親和層析分離。第110頁(yè)/共203頁(yè) 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體l 酵母表達(dá)載體酵母表達(dá)載體l 昆蟲(chóng)表達(dá)載體昆蟲(chóng)表達(dá)載體l 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 第111頁(yè)/共203頁(yè) l酵母表達(dá)載體釀酒酵母和畢赤酵母畢赤酵母載體:均為大腸桿菌-畢赤酵母穿梭載體第112頁(yè)/共203頁(yè)畢赤酵母啟動(dòng)子（來(lái)自乙

52、醇氧化酶基因AOX1），受到甲醇嚴(yán)格控制。第113頁(yè)/共203頁(yè)l哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體包括:1）大腸桿菌的復(fù)制子及抗生素抗性基因：便于基因工程操作2）哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子：使外源基因表達(dá)3）含有終止信號(hào)及加polyA信號(hào)：polyA上游1130bp處有一高度保守的AAUAAA序列，下游富含GU或U第114頁(yè)/共203頁(yè)Neomycin：G418第115頁(yè)/共203頁(yè)綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）：從水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白，分子質(zhì)量為26kDa，由238個(gè)氨基酸構(gòu)成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，是主要發(fā)光的位置。其

53、發(fā)光團(tuán)的形成不具物種專一性，發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后很穩(wěn)定，對(duì)多數(shù)宿主的生理無(wú)影響，是常用的報(bào)道基因。 如利用GFP 的示蹤特性，研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，即可揭示腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的某些機(jī)制。 第116頁(yè)/共203頁(yè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（Internal ribosome entry site, IRES）。 IRES能招募核糖體對(duì)mRNA進(jìn)行獨(dú)立地翻譯。第117頁(yè)/共203頁(yè)3）穿梭質(zhì)粒 穿梭載體（Shuttle vector）是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在

54、真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。 酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等使用的表達(dá)載體，一般都有在大腸桿菌中復(fù)制的元件，因此都具備穿梭載體的特征，如大腸桿菌/酵母、大腸桿菌/昆蟲(chóng)細(xì)胞、大腸桿菌/哺乳動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體等。 第118頁(yè)/共203頁(yè)5、質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列2種方法制備質(zhì)粒DNA： 1)氯化銫密度梯度離心法質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染2)堿裂解法方便、快速，滿足一般需要第119頁(yè)/共203頁(yè)1 1）氯化銫密度梯度離心法：）氯化銫密度梯度離心法： 原理：是一種沉降平衡離心法，經(jīng)超速離心，離心介質(zhì)原理：是一種沉降平衡離心法，經(jīng)超速離心，離心介質(zhì)CsClCsCl形成形成一連續(xù)

55、的密度梯度，在過(guò)量一連續(xù)的密度梯度，在過(guò)量EBEB存在的條件下，各種不同密度的物存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開(kāi)。其中蛋白質(zhì)密度?。ㄙ|(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開(kāi)。其中蛋白質(zhì)密度?。?.3 g/cm31.3 g/cm31.4g/cm31.4g/cm3），浮于液面；），浮于液面；RNARNA密度大（密度大（2.0g/cm32.0g/cm3），沉于管底；），沉于管底；各種各種DNADNA密度介于蛋白質(zhì)與密度介于蛋白質(zhì)與RNARNA之間，處于中部。過(guò)量之間，處于中部。過(guò)量EBEB處理前，處理前，細(xì)菌染色體細(xì)菌染色體DNADNA與不同分子構(gòu)型的質(zhì)粒與不同分子構(gòu)型的質(zhì)粒DNADNA的密度均為

56、的密度均為1.7g/cm31.7g/cm3左左右，難以區(qū)分。經(jīng)過(guò)量右，難以區(qū)分。經(jīng)過(guò)量EBEB處理后，不同分子構(gòu)型的處理后，不同分子構(gòu)型的DNADNA與與EBEB的結(jié)合的結(jié)合能力不一樣，因而密度下降不一致，可有效分離。其中，閉環(huán)質(zhì)能力不一樣，因而密度下降不一致，可有效分離。其中，閉環(huán)質(zhì)粒粒DNADNA為超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)，為超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)，EBEB不易插入，結(jié)合量少，密度下降小，不易插入，結(jié)合量少，密度下降小，約為約為1.59 g/cm31.59 g/cm3；而染色體；而染色體DNADNA、開(kāi)環(huán)質(zhì)粒、開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNADNA以及帶切口的環(huán)狀以及帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA可以嵌入更多的可以嵌入更多

57、的EBEB，密度下降較多，約為，密度下降較多，約為1.54 g/cm31.54 g/cm3，從而能與閉環(huán)質(zhì)粒從而能與閉環(huán)質(zhì)粒DNADNA分開(kāi)。分開(kāi)。 第120頁(yè)/共203頁(yè)proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs過(guò)程：用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加CsCl和溴乙錠超速離心過(guò)夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNA第121頁(yè)/共203頁(yè) 2 2）堿變性法）堿變性法 原理：堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性原理：堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異，染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異，在在pH 12.0-12.6pH 1

58、2.0-12.6堿性環(huán)境堿性環(huán)境中，中，線性的大分子量細(xì)菌染色體線性的大分子量細(xì)菌染色體DNADNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNADNA仍為自然狀態(tài)；仍為自然狀態(tài)；將將pHpH調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體染色體DNADNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNADNA和蛋和蛋白質(zhì)在去污劑白質(zhì)在去污劑SDSSDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNADNA仍為可溶仍為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體狀態(tài)。通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNADNA、RNARNA及蛋白質(zhì)

59、，質(zhì)粒及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNADNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)?；|(zhì)粒DNADNA。 由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開(kāi)由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開(kāi)環(huán)、閉環(huán)超螺旋。環(huán)、閉環(huán)超螺旋。 第122頁(yè)/共203頁(yè)第123頁(yè)/共203頁(yè) 試劑試劑 1. LB1. LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 2. 2. 溶液溶液 I I 3. 3. 溶液溶液 4. 4. 溶液溶液IIIIII 5. TE(pH8.0) 5. TE(pH8.0) 穩(wěn)定穩(wěn)定第124頁(yè)/共203頁(yè) LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 配制配制1 1升培養(yǎng)基，應(yīng)在升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml950ml去

60、離子水中加入：去離子水中加入： 細(xì)菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨細(xì)菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g(bacto-tryptone) 10g 細(xì)菌培養(yǎng)基用酵母提取物細(xì)菌培養(yǎng)基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g(bacto-yeast extract) 5g NaClNaCl10g10g 搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，5mol/L NaOH(5mol/L NaOH(約約0.2ml)0.2ml)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值至值至7.0,7.0,加入去離子水至總體積為加入去離子水至總體積為1L1L，15 lbf/in15 lbf/in2 2(1.