4.免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

1、 免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是電鏡技術(shù)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一門新技術(shù)，也稱超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞化學(xué)。 目的：目的：將化學(xué)研究與形態(tài)觀察相統(tǒng)一，要求在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究細(xì)胞內(nèi)各種生化物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情況以及這些生化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，用以闡明細(xì)胞、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系。 免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理，用高電產(chǎn)物，根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理，用高電子密度

2、的標(biāo)記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結(jié)構(gòu)水子密度的標(biāo)記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結(jié)構(gòu)水平上檢測(cè)某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一平上檢測(cè)某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一種方法。種方法。 目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)和鐵蛋白體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)和鐵蛋白-抗抗鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。用以標(biāo)記抗體的酶要具備以下條件：用以標(biāo)記抗體的酶要具備以下條件：1.與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗

3、原）的生物活性。與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）的生物活性。2.酶的純度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價(jià)。酶的純度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價(jià)。3.在體液或組織中不存在該酶的底物。在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標(biāo)技術(shù)中最常用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶（酶標(biāo)技術(shù)中最常用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶（HRP）電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則 1 1、取材與固定、取材與固定 取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標(biāo)本固定要求取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標(biāo)本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細(xì)胞

4、的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的甲醛短時(shí)固定隊(duì)抗原性保存好，但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。甲醛短時(shí)固定隊(duì)抗原性保存好，但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。 （1 1）2%2%多聚甲醛液多聚甲醛液 （2 2）2%2%多聚甲醛多聚甲醛-0.01%-0.01%0.05%0.05%戊二醛戊二醛 （3 3）4%4%多聚甲醛多聚甲醛-0.5%-0.5%苦味酸苦味酸-0.5%-0.5%戊二醛戊二醛 o 2通過冰凍切片或震動(dòng)切片獲得厚切片。通過冰凍切片或震動(dòng)切片獲得厚切片。 冰凍切片冰凍切片 8m ，震動(dòng)切片，震動(dòng)切片2080m。 o 3漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進(jìn)行標(biāo)記

5、染色。漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進(jìn)行標(biāo)記染色。o 4DAB顯色后再進(jìn)行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。顯色后再進(jìn)行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。o 5. 如果確定待測(cè)抗原的抗原性不會(huì)由于脫水包埋引起失活如果確定待測(cè)抗原的抗原性不會(huì)由于脫水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色。的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色。三、免疫染色三、免疫染色o包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進(jìn)行免疫染色，然后包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進(jìn)行免疫染色，然后再進(jìn)行脫水包埋超薄切片。再進(jìn)行脫水包埋超薄切片。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1 1）切片染色前未經(jīng)四氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，切片染色前未經(jīng)四

6、氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，對(duì)抗原性破壞較小。（對(duì)抗原性破壞較小。（2 2）可在定位后再進(jìn)行超薄切片，提高陽(yáng)性檢）可在定位后再進(jìn)行超薄切片，提高陽(yáng)性檢出率出率. .（3 3）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結(jié)構(gòu)的保）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結(jié)構(gòu)的保存。存。o包埋后染色：是指在超薄切片上進(jìn)行免疫染色。包埋后染色：是指在超薄切片上進(jìn)行免疫染色。o優(yōu)點(diǎn)：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不優(yōu)點(diǎn)：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不需要穿透劑。需要穿透劑。2.免疫染色免疫染色 直接法：用酶標(biāo)抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，直接法：用酶標(biāo)抗體

7、直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，爾后進(jìn)行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。爾后進(jìn)行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。 間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標(biāo)記的特異性間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標(biāo)記的特異性抗體即第一抗體，后者與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)。然后使用過抗體即第一抗體，后者與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)。然后使用過氧化物酶標(biāo)記第二抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。氧化物酶標(biāo)記第二抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。o 結(jié)果判定結(jié)果判定o 在已知陽(yáng)性、陰性樣品成立的前提下，出現(xiàn)高在已知陽(yáng)性、陰性樣品成立的前提下，出現(xiàn)高電子密度的顆粒，即指示抗原抗體的存在。電子密度的顆粒，即指

8、示抗原抗體的存在。（二）膠體金免疫電鏡技術(shù)（二）膠體金免疫電鏡技術(shù) 利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，使其利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，使其與抗體相互吸引從而將抗體標(biāo)記。再以金標(biāo)記的抗體與抗體相互吸引從而將抗體標(biāo)記。再以金標(biāo)記的抗體與待檢抗原相互結(jié)合，由于金顆粒的電子密度高，電與待檢抗原相互結(jié)合，由于金顆粒的電子密度高，電鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。2、膠體金的特性 顏色：膠體金的顏色與金粒子的直徑有關(guān)，5-60nm時(shí)為紅色，95nm是為藍(lán)色，用于免疫細(xì)胞化學(xué)的膠體金呈紅葡萄酒色。 影響膠體金穩(wěn)定的因素： a.電解質(zhì)：少量有促進(jìn)穩(wěn)定的作用，過

9、量則破壞。 b.膠體金的濃度：濃度越高容易導(dǎo)致膠體金凝集。 c.溫度：長(zhǎng)時(shí)間加熱可使穩(wěn)定性有所下降。 檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關(guān)系0.01%氯化金 1%檸檬酸三鈉 膠體金顆粒直徑 （ml) （ml） （nm）100 3.0 19.0100 4.0 15.0100 6.0 12.5100 1.5 24.5100 1.0 41.0100 0.6 71.5（1）膠體金的制備）膠體金的制備 檸檬酸三鈉還原法（檸檬酸三鈉還原法（15nm） 鞣酸鞣酸-檸檬酸鈉還原法（檸檬酸鈉還原法（6nm） 鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方1%檸檬酸三鈉 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3

10、去離子雙蒸水 膠體金顆粒直徑 （ml) （ml） （ml） （ml） （nm） 4 0.02 0 19.98 15 4 0.1 0 19.90 10 4 0.5 0.5 15.00 6.0 4 3 3 14.00 3.5優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯的變化。生物活性不發(fā)生明顯的變化。 金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易精確定位。清晰可辨，易精確定位。不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對(duì)細(xì)胞表

11、面的抗原、受體進(jìn)行標(biāo)記定位觀察。掃描電鏡對(duì)細(xì)胞表面的抗原、受體進(jìn)行標(biāo)記定位觀察。膠體金標(biāo)記物易于制備，而且可以根據(jù)需要制備不同膠體金標(biāo)記物易于制備，而且可以根據(jù)需要制備不同大小的膠體金，因此可以進(jìn)行免疫電鏡的雙重標(biāo)記。大小的膠體金，因此可以進(jìn)行免疫電鏡的雙重標(biāo)記。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少，可進(jìn)根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少，可進(jìn)行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量研究。行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量研究。 o （2）電鏡包埋前免疫金染色）電鏡包埋前免疫金染色o 新鮮組織經(jīng)適當(dāng)固定（新鮮組織經(jīng)適當(dāng)固定（0.5%戊二醛戊二醛-2%多聚甲多聚甲醛固定醛固定0.51h），制成厚切片。），制成厚

12、切片。o 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗漂洗3次，每次次，每次15min。o 0.1mol/L甘氨酸漂洗甘氨酸漂洗10min，滅活自由醛基。，滅活自由醛基。o TBS漂洗，漂洗，5min3次，次，o 1%牛血清孵育組織塊牛血清孵育組織塊30min。o 第一抗體第一抗體4孵育過夜后室溫繼續(xù)放置孵育過夜后室溫繼續(xù)放置2h。o TBS漂洗，漂洗，5min3次，次，o 室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白針或蛋白A膠體金探針等）孵育膠體金探針等）孵育60min。o TBS漂洗，漂洗，3min3次，后再用雙蒸水漂洗切片。次，后再

13、用雙蒸水漂洗切片。o 2%戊二醛戊二醛-2多聚甲醛固定多聚甲醛固定1h，1%鋨酸固定鋨酸固定3060min，常規(guī)脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。，常規(guī)脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。（3）電鏡包埋后免疫金染色法 o 超薄切片5070nm，置于鎳網(wǎng)或金網(wǎng)中。o 1% H2O2蝕刻，使試劑能穿透標(biāo)本。EPON包埋的組織蝕刻時(shí)間約10min，而LRWhite、LR Gold包埋的組織蝕刻時(shí)間則常小于5min.o 雙蒸水漂洗雙蒸水漂洗3次，每次次，每次10min。o 1%牛血清孵育切片牛血清孵育切片15min。o 載網(wǎng)不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室溫孵育載網(wǎng)不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在

14、室溫孵育12h或或41824h。o TBS漂洗，漂洗，3min3次。次。o 室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探膠體金探針等）孵育針等）孵育3060min。o TBS漂洗，漂洗，3min3次，后在用雙蒸水漂洗切片。次，后在用雙蒸水漂洗切片。o 醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。2.電鏡免疫金染色 用于電鏡的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根據(jù)抗原的性質(zhì)加以選擇。 染色方法也有直接法和間接法。o (5)染色結(jié)果判斷染色結(jié)果判斷o 假陽(yáng)性染色和假陰性染色假陽(yáng)性染色和假陰性染

15、色o 可以通過調(diào)整固定液種類、濃度、固定時(shí)間，改變可以通過調(diào)整固定液種類、濃度、固定時(shí)間，改變一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時(shí)間、溫度等減一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時(shí)間、溫度等減少假陽(yáng)性和假陰性染色。少假陽(yáng)性和假陰性染色。雙標(biāo)記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm, 20nm圖7-11 血小板表面膠體金標(biāo)記GPIb單抗 9000鐵蛋白標(biāo)記電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 鐵蛋白標(biāo)記抗體是由Singer（1959）首創(chuàng)的一種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。這技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于病毒和細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)。鐵蛋白作為電鏡觀察的標(biāo)記物，具有顆粒大、分辨率高、散射力強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于細(xì)胞膜表面抗原的準(zhǔn)確定位。所以，雖然40年后的今天已發(fā)展

16、了多種免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，但鐵蛋白標(biāo)記法仍然是一種基本技術(shù)。 基本原理：基本原理： 鐵蛋白是一種直徑鐵蛋白是一種直徑101012nm12nm的球形的蛋白質(zhì)（分的球形的蛋白質(zhì)（分子量子量450kD450kD）, ,它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約7.5nm7.5nm），該核心含），該核心含2000200050005000個(gè)鐵原子，分布于四個(gè)鐵原子，分布于四個(gè)區(qū)域，形成四個(gè)圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，個(gè)區(qū)域，形成四個(gè)圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，因此可用于電鏡觀察?？贵w與鐵蛋白通過低分子量的因此可用于電鏡觀察?？贵w與鐵蛋白通過低分子量的偶聯(lián)劑形成抗體偶聯(lián)劑形成抗體- -鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同時(shí)因?yàn)殍F蛋白含有高電子密度的鐵膠的