無菌檢查法標準操作規(guī)程

1、文件名稱無菌檢查法標準操作規(guī)程文件編號編 制 審 核批 準生效日期1.目的建立要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種檢查方法。2.范圍適用于無菌檢驗。3.職責檢驗員按本規(guī)程操作，質量控制部主管監(jiān)督本規(guī)程的實施。4.程序4.1 檢驗依據(jù)中國藥品檢驗標準操作規(guī)范中華人民共和國藥典二部附錄 H無菌檢查法4.2 儀器、設備立式壓力蒸汽滅菌器、數(shù)顯鼓風干燥箱、凈化工作臺、試管、量筒、酒精燈、燒杯、電磁爐、試管架、剪刀、移液管、鑷子、接種環(huán)、電子秤、培養(yǎng)箱、試管架、大試管若干、冰箱、移液槍等。4.3培養(yǎng)基4.3.1培養(yǎng)基種類及培養(yǎng)條件 a）硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 30 35 培養(yǎng)。

2、b）改良馬丁培養(yǎng)基 23 28 培養(yǎng)。 注：商購脫水培養(yǎng)基的每一個批號做一次培養(yǎng)基的靈敏度檢查；每次制備的培養(yǎng)基應隨機取不少于5支，與供試品同時進行無菌檢查。4.3.2 培養(yǎng)基制備按商購脫水培養(yǎng)基說明配制，培養(yǎng)基的pH值應符合規(guī)定，否則必須校正。4.3.3培養(yǎng)基及實驗用具滅菌 培養(yǎng)基分裝后放入立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌（115±1下 滅菌30min）。 實驗用具根據(jù)需要采用高壓蒸汽滅菌（121±1下 滅菌30min）或干燥箱滅菌（160下滅菌120min）。4.4菌種金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26 003 銅綠假單胞菌(Ps

3、eudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501生孢梭菌( Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64 941 白色念珠菌( Candida albicans)CMCC(F) 98 001黑曲霉( Aspergillus niger) CMCC(F) 98 0034.5菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng) 18小時24小時；接種白色念珠菌

4、的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2328培養(yǎng) 2448小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100 cfu （菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328培養(yǎng) 57天，加入35ml含 0.05（v/v）聚山梨酯 80的 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05（v/v）聚山梨酯 80的 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100 cfu的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應在 2小時內使用，若保存在28可在 24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在 28，在

5、驗證過的貯存期內使用。4.6稀釋液、沖洗液及其制備方法4.6.1 0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨 1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調節(jié)pH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。 4.6.2 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀 3.56g ，磷酸氫二鈉 7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白胨 1.0g，加水 1000ml ，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。 根據(jù)供試品的特性，可選用其他經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。4.7方法驗證試驗當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于

6、該產品的無菌檢查。若該產品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新驗證。驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。菌種及菌液制備除大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 4 4102外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。薄膜過濾法 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100 cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或將培養(yǎng)基加至濾筒內。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器

7、，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng) 35天，各試驗菌同法操作。 直接接種法 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8 管，分別接入小于 100 cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各 2管。其中 1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量，另 1管作為對照，按置規(guī)定的溫度培養(yǎng) 35天。 結果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無

8、菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證試驗。方法驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。4.8供試品的無菌檢查4.8.1檢驗數(shù)量 檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產品按表 1規(guī)定；上市產品監(jiān)督檢驗按表2、表 3規(guī)定。表1、表 2、表 3中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加 1/2的最小檢驗數(shù)量作陽性對照用；若采用直

9、接接種法，應增加供試品 1支（或瓶）作陽性對照用。 4.8.2檢驗量 是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按表 2、表 3規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。4.8.3陽性對照 應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色

10、念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于 100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng) 4872小時應生長良好。4.8.4陰性對照 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。 無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒，如果供試品容器內有一定的真空度，可用

11、適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內容物。4.8.5供試品處理及接種培養(yǎng)基 除另有規(guī)定外，按下列方法進行。4.8.5.1薄膜過濾法 薄膜過濾法應優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，也可使用一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于 0.45m。直徑約為 50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。抗生素供試品應選擇低吸附的濾器及濾膜。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品

12、溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為 100ml，總沖洗量不得超過 1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。 水溶液供試品 取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗證試驗。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應的濾筒內。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其分成 3等份，分別置于含 50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基容器中，其中一份做陽性

13、對照用。 可溶于水的固體制劑供試品 取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明復溶，然后照水溶液供試品項下的方法操作。-內酰胺類抗生素供試品 取規(guī)定量，按水溶液或固體制劑供試品的處理方法處理，立即過濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜。再用含適量.-內酰胺酶的沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基，必要時培養(yǎng)基中可加少量的.-內酰胺酶；或將濾膜直接接種至含適量.-內酰胺酶的培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基照水溶液供試品項下的方法操作。非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，直接過濾；或混合溶于含聚山梨酯 80或其他適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含 0.11%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少 3次。濾膜于

14、含或不含聚山梨酯 80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種培養(yǎng)基照水溶液供試品項下的方法操作。 可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品 取規(guī)定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯 中，劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當加熱，但溫度不得超過 44，趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品，于含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試液中加入不少于 100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜沖洗及接種培養(yǎng)基照非水溶性制劑供試品項下的方法操作。無菌氣（噴）霧劑供試品 取規(guī)定量，將各容器置至少20的冰室冷凍約1小時。以無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，并將供

15、試液轉移至無菌容器中，然后照水溶液或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。 裝有藥物的注射器供試品取規(guī)定量，排出注射器中的內容物，若需要可吸入稀釋液或標簽所示的溶劑溶解，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。然后按水溶性供試品項下方法操作。同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。具有導管的醫(yī)療器具(輸血、輸液袋等)供試品 取規(guī)定量，每個最小包裝用50100ml沖洗液分別沖洗內壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項下方法操作。同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。注： 無菌十四烷酸異丙酯的制備采用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為 0.2

16、2m的脂溶性濾膜，在140干熱滅菌2小時。4.8.5.2直接接種法 直接接種法即取規(guī)定量供試品分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的 10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于 15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于 10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證試驗?；鞈乙旱确浅吻逅芤汗┰嚻?取規(guī)定量，接種至各管培養(yǎng)基中。固體制劑供試品取規(guī)定量直接接種至各管培養(yǎng)基中?；蚣尤脒m宜的溶劑溶解，或按標簽說明復溶后，取規(guī)定量接種至各管培養(yǎng)基中。有抑菌活性的供試品 取規(guī)定量，混合，加入適量的無菌中和劑或

17、滅活劑，然后接種至各管培養(yǎng)基中?；蛑苯咏尤牒m量中和劑或滅活劑的各管培養(yǎng)基中。非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，混合，加入適量的聚山梨酯 80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至各管培養(yǎng)基中?；蛑苯咏臃N至含聚山梨酯 80或其它適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。 敷料供試品 取規(guī)定數(shù)量，以無菌操作拆開每個包裝，于不同部位剪取約 100mg或 1cm×3cm的供試品，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。腸線、縫合線等供試品 腸線、縫合線及其它一次性使用的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝，無菌拆開包裝，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。滅菌醫(yī)用器具供試品 取規(guī)定量，必要時應將其拆散或切成小碎段，

18、接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。放射性藥品 取供試品 1瓶(支)，接種于裝量為 7.5ml的培養(yǎng)基中。每管接種量為 0.2ml。 4.8.6培養(yǎng)及觀察 上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng) 14天。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng) 14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng) 2天、真菌培養(yǎng) 3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。 4.8.7結果判斷陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁

19、但經確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時方可判試驗結果無效： 無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法的要求。 回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。 供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。 試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。5.附件及附錄表 1 批出廠產品最少檢驗數(shù)量供試品批產量 N（個）接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗數(shù)量注射劑 10010%或 4個（取較多者）100N 50010個 5002%或 20個（取較少者）大體積注射劑（100 ml）2%或 10個（取較少者）眼用及其他非注射產品2005%或 2個（取較多者）20010個桶裝無菌固體原料4每個容器 4 N5020%或 4個容器（取較多者） 502%或 10個容器（取較多者）抗生素固體原料藥（ 5克）6個容