實(shí)驗(yàn)十四樣品中菌落總數(shù)的檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)十四 樣品中菌落總數(shù)的檢測(cè)一、目的要求學(xué)習(xí)并掌握樣品中菌落總數(shù)（平板菌落計(jì)數(shù)）的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)材料1.樣品：鮮啤酒2.培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 3.設(shè)備儀器:10ml無菌吸管1支、1ml無菌吸管4支、無菌帶塞空試管3支、無菌空培養(yǎng)皿9套、酒精燈、試管架、無菌生理鹽水、玻璃珠、溫箱361、天平等。 三、基本原理 菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1克或1毫升檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。 菌落總數(shù)主要作為制定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。 每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)用不同的營(yíng)養(yǎng)條件

2、及其他生理?xiàng)l件(如溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等)去滿足其要求，才能分別將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。但在實(shí)際工作中，一般都只用一種常用的方法去作細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定。所得結(jié)果，只包括一群能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數(shù)。 四、檢驗(yàn)程序 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序如下：五、操作步驟 1檢樣稀釋及培養(yǎng) (1)以無菌操作，將檢樣25g(或25ml)剪碎放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨作成1:10的均勻稀釋液。 固體檢樣在加入稀釋后，最好置滅菌均質(zhì)器中以800010000r/min的速度處理1分鐘，作成1:10的均勻稀釋液

3、。 (2)用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml時(shí)，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)(注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液)，振搖試管混合均勻，作成1:100的稀釋液。(3)另取1ml滅菌吸管，按上面各項(xiàng)操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次， 即換用1支滅菌吸管。 (4 )根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。 (5)稀釋濃移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于461水浴保溫)注入平皿約2025ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻

4、。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液(不含樣品)的滅菌皿內(nèi)作空白對(duì)照。 (6)待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置361溫箱內(nèi)培養(yǎng)24土2h(肉、水產(chǎn)、乳和蛋品為482h)取出，計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克(或毫升)樣品所含菌落總數(shù)。 2菌落計(jì)數(shù)方法 作平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。 3菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告 (1)平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平均數(shù)，其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀

5、釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平夜的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。 (2)稀釋度的選擇 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表例1)。 若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30300之間，則視二者之比如何來決定，若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字(見表例2及3)。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表例4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表例5)。 若所有稀釋度均無菌落生長(zhǎng)，則以小于()1乘以

6、最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表例6)。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分大于300或小于30 時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表例7)。(3)菌落數(shù)的報(bào)告 菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示(見表報(bào)告方式欄)。 六、結(jié)果 將實(shí)驗(yàn)測(cè)出的樣品數(shù)據(jù)以報(bào)表方式報(bào)告結(jié)果。稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)個(gè)/g或個(gè)/ml報(bào)告方式個(gè)/g或個(gè)/ml10-110-210-31多不可計(jì)16420164016000或

7、1.610-42多不可計(jì)29546163775038000或3.80-43多不可計(jì)27160222710027000或2.70-44多不可計(jì)多不可計(jì)313313000310000或3.110-552711527270或2.710-26000110107多不可計(jì)305123050031000或3.110-4實(shí)驗(yàn)十五 樣品中大腸菌群的檢驗(yàn)一、目的要求 學(xué)習(xí)大腸菌群菌數(shù)的檢測(cè)原理和方法。 二、實(shí)驗(yàn)材料 1.儀器: 361溫箱、天平、顯微鏡、平皿、440.5水浴、試管、吸管、載玻片 2.培養(yǎng)基及試劑:乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵管、革蘭氏染色液、芽孢染色液 三、基本原理 大腸菌群系指一

8、群在3724小時(shí)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。 食品中大腸菌群數(shù)系以每l00ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。四、檢驗(yàn)程序 大腸菌群檢驗(yàn)程序如下：五、操作步驟1檢樣稀釋 (1)以無菌操作將檢樣25ml(或25g)放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨作成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以800010000r/min的速度處理/min作成1: 10的均勻稀釋液。 (2)用1ml

9、滅菌吸管，吸取1:10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，作成1:100的稀釋液。 (3)另取1ml滅菌吸管，按上項(xiàng)操作依次作10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1ml滅菌吸管。 (4)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管， 1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24 2h ,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。 2分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵

10、管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美蘭瓊脂平板上，置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和芽孢染色以及證實(shí)試驗(yàn)。 3證實(shí)試驗(yàn) 在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落12個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置361溫箱內(nèi)培養(yǎng)242h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。 4報(bào)告 根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100ml(g)大腸菌群的最可能數(shù)。 大腸菌群最可能數(shù)(MPN)栓索表陽性管數(shù)MPN10ml（g）1ml（g）30.1 ml （g）30.01 ml （g）3000000000123303060900000111

11、101233060901200000222201236090120160000033330123901301601901111000001134070110150111111110123701101501901111222201231101502002401111333301231602002402902222000001239014020026022221111012315020027034022222222012321028035042022223333012329036044053033330000012323039064095033331111012343075012001600333

12、3222201239301500210029003333333301232400460011002400注：本表采用3個(gè)稀釋度1ml(g)、0.lml(g)和0.0lml(g)每稀釋度3管。 表內(nèi)所列檢樣量如改用10ml(g)，1ml(g)， 0.1ml(g)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.lml(g)、0.01ml(g)，0.001ml(g)時(shí)則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍，其余可類推。10ml以上用雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵管50ml以上用三倍乳糖膽鹽發(fā)酵管。 可疑菌落 A：紫紅色具有金屬光澤的菌落。 B：深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。 C：淡紅色，中心色較深的菌落。 驗(yàn)名稱培養(yǎng)基菌種接種方

13、式培養(yǎng)條件培養(yǎng)結(jié)果處理后現(xiàn)象備注淀粉水解試驗(yàn)固體淀粉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌、大腸桿菌平板劃線接種37，24h枯草芽孢桿菌有稀疏白色菌落、大腸桿菌無菌落加入盧戈氏碘液后出現(xiàn)透明水解圈說明淀粉被水解，為陽性菌明膠水解試驗(yàn)明膠培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌、大腸桿菌試管穿刺接種20，35d沿穿刺接種的痕跡進(jìn)行明膠的液化水解乳糖發(fā)酵試驗(yàn)乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基大腸桿菌液體中接種37，2448h液體顏色淡黃、液體中白色懸浮顆粒分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣金黃色葡萄球菌液體顏色淡黃、倒置小管內(nèi)有氣泡積聚分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣枯草芽孢桿菌液體顏色淡黃、液面積累小氣泡不分解乳糖葡糖糖發(fā)酵試驗(yàn)葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基大腸桿菌液體中接種37，2448h液體顏色淡黃、澄清，倒置小管內(nèi)有氣泡積聚分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣金黃色葡萄球菌液體顏色淡黃、澄清，倒置小管內(nèi)有氣泡積聚分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣枯草芽孢桿菌液體顏色淡黃、有乳白色懸浮顆粒，倒置小管內(nèi)有氣泡積聚分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣硫化氫試驗(yàn)醋酸鉛培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌、大腸桿菌試管穿刺接種37，48h產(chǎn)生黑色硫化鉛沉淀吲哚試驗(yàn)蛋白胨水培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)37，48h渾濁、液體中懸浮乳白顆粒加入乙醚搖勻靜止，待乙醚上升后加吲哚試劑，產(chǎn)生紅色玫瑰吲哚陽性反應(yīng)甲基紅試驗(yàn)葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)37，48h渾濁、