微生物學課件

1、第第 六六 章章Cncnc-micro測定微生物生長繁殖的方法微生物的生長規(guī)律影響微生物生長的主要環(huán)境因素微生物培養(yǎng)法概論有害微生物的控制內(nèi)容提要 測生長量計繁殖數(shù)測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法Cncnc-micro微生物的純培養(yǎng)純培養(yǎng)純培養(yǎng)的分離方法的分離方法 稀釋倒平板法 劃線法 選擇培養(yǎng)基分離法 單細胞挑取法 Viable cell count1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107cell no/ml2. plate out 0.1 ml Inoculating an agar plate to obtain singl

2、e coloniesMixed culturePure cultureMixed cultureOral swabSwab from sole of shoeEach colony was examined microscopically選擇培養(yǎng)基分離法1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107牛肉膏培養(yǎng)基牛肉膏培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基高氏培養(yǎng)基高氏培養(yǎng)基含N量法DNA/RNA法葉綠素法菌體內(nèi)重要組成測定法測生長量 (直接法)稱重量法測體積法N6.25=PrCncnc-micro比 濁 法生理指標法測生長量(間接法)計繁殖數(shù)比例計數(shù)法

3、血球計數(shù)板法液體稀釋法平板菌落計數(shù)法濾膜培養(yǎng)法各種型號的全自動血球計數(shù)儀微生物的連續(xù)培養(yǎng)微生物的生長規(guī)律微生物的個體生長和同步生長Cncnc-micro單細胞微生物的典型生長曲線微生物的高密度培養(yǎng)離心法抑制合成法獲得同步生長(synchronous growth)的方法：誘導法選擇法過濾法同步培養(yǎng)(synchronous culture)Cncnc-micro使培養(yǎng)基中細菌同時分裂，處于相同的生長階段叫同步生長。生長曲線(growth curve)描述細菌生長規(guī)律總菌數(shù)活菌數(shù)培養(yǎng)時間 .指數(shù)期 .穩(wěn)定期 .衰亡期.延滯期細菌數(shù)目（個/ml）對數(shù)縮短延滯期的意義和方法延滯期(lag phase)

4、出現(xiàn)原因本期特點影響本期限長短因素Cncnc-micro延滯期出現(xiàn)原因 把細菌接種到新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，并不立即進行分裂繁殖，細菌增殖數(shù)為，這時需要合成多種酶，輔酶和某些中間代謝產(chǎn)物，要經(jīng)過一個調(diào)整和適應過程 。Cncnc-micro延滯期特點生長速率常數(shù)等于零菌體粗大 代謝活力強對不良條件抵抗能力降低含量增加Cncnc-micro影響延滯期限長短因素接種齡接種量培養(yǎng)基成分Cncnc-micro縮短延滯期的意義和方法可以縮短生產(chǎn)周期，提高設備利用率。接種對數(shù)生長期的菌種，采用最適菌齡 加大接種量用與培養(yǎng)菌種相同組成分的培養(yǎng)基Cncnc-micro指數(shù)期(對數(shù)期)(exponential ph

5、ase) 特點該期的細菌生產(chǎn)中多被用做種子和科學試驗材料 活菌數(shù)和總菌數(shù)接近 酶系活躍，代謝旺盛。生長速率最大，generation time最短。細胞的化學組成及形態(tài)，生理特性比較一致Cncnc-microx2x1t2t1培養(yǎng)時間Lg 細胞數(shù)/mlt2 - t13.322(lgx2-lgx1)生長速率常數(shù)R=t2 - t13.322(lgx2-lgx1)代時G=指數(shù)期生長的數(shù)學模型繁殖代數(shù) n=3.322(lgx2-lgx1)影響指數(shù)期的因素菌種營養(yǎng)成分營養(yǎng)物濃度培養(yǎng)溫度Cncnc-micro穩(wěn)定期(stationary phase)出現(xiàn)原因 營養(yǎng)的消耗有害代謝產(chǎn)物積累PH值EH值等理化條件

6、不適出現(xiàn)原因Cncnc-micro營養(yǎng)物比例失調(diào)穩(wěn)定期特點活菌數(shù)保持相對穩(wěn)定，總菌數(shù)達最高水平。細菌代謝物積累達到最高峰。芽孢桿菌這時開始形成芽孢。這是生產(chǎn)收獲時期。Cncnc-micro衰亡期(decline phase/death phase)特點細菌死亡數(shù)大于增殖數(shù),活菌數(shù)明顯減少,群體衰落 細胞出現(xiàn)多形態(tài),大小不等的 畸形,變成衰退型 細胞死亡,出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。Cncnc-micro連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture)(open culture)(continuous culture)(open culture)將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后一次收獲，叫分批

7、培養(yǎng)，將微生物放在恒定的容積的流動系統(tǒng)中培養(yǎng)稱為連續(xù)培養(yǎng)。 優(yōu)點：縮短發(fā)酵周期；便于自動控制；產(chǎn)物質(zhì)優(yōu)點：縮短發(fā)酵周期；便于自動控制；產(chǎn)物質(zhì) 要要 量均一量均一 缺點：菌種易退化；易染雜菌缺點：菌種易退化；易染雜菌Cncnc-micro微生物的高密度培養(yǎng) （high cell-density culture,HCDC）指微生物在液體培養(yǎng)基中細胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)?，F(xiàn)代高密度培養(yǎng)技術(shù)主要是用于基因工程菌生產(chǎn)多肽類藥物。選取最佳培養(yǎng)基成分和各成分含量補料提高溶解氧的濃度防止有害代謝產(chǎn)物的生成 影響微生物生長的主要環(huán)境因素Cncnc-micro溫度PH氧氣溫度 生長

8、速度溫度停此生長致死最低最高最適嗜冷微生物（低溫微生物） 中溫微生物嗜熱微生物（高溫微生物）低溫對微生物的影響 嗜冷微生物（低溫微生物） 系在低溫下仍能起催化作用 細胞膜含較多的不飽合脂肪酸在低溫下仍具有通透性。 上下班嗜冷機制：Cncnc-micro嗜熱微生物的嗜熱機制細胞內(nèi)的具強抗熱性 產(chǎn)生的多胺，熱亞胺和高溫精胺物質(zhì)對蛋白質(zhì)等組織結(jié)構(gòu)具有保護作用。一一一一一口口口核酸也具有熱穩(wěn)定性的保護結(jié)構(gòu)。 細胞膜含有較多的飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸，使膜具有穩(wěn)定性。上 低溫對微生物的影響代謝降低 生長繁殖停滯 仍然存活 常在低溫下對菌種和食品保藏。Cncnc-microPH 影響細胞膜透性與穩(wěn)定性 影響

9、物質(zhì)溶解度 影響細胞表面電荷分布 因此影響微生物生長、繁殖，發(fā)育。各類微生物能夠生長的PH值較寬，但細胞內(nèi)部PH值卻接近中性。Cncnc-micro微生物的活動也能改變環(huán)境中的PH值嗜酸性微生物嗜堿性微生物耐酸及耐堿微生物根據(jù)氫離子濃度對微生物分類 Cncnc-micro氧氣氧氣專性好氧菌（obligate or strict aerobes）兼性厭氧菌（facultative anaerobes） Cncnc-micro耐氧菌（aerotolerant anaerobes） 厭氧菌（anaerobes） 微好氧菌（microaerophilic bacteria）超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶

10、（SODSOD）和）和過氧化氫酶過氧化氫酶 （Catalase ）超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）功能：使好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的毒害2H2O2 _Catalase_ 2H2O + O2過氧化氫酶（過氧化氫酶（ Catalase ）厭氧菌（anaerobes） 將環(huán)境中氧吸掉；抽真空；深層培養(yǎng)氧對其有毒能量來源于發(fā)酵無氧呼吸環(huán)式光合磷酸化或甲烷發(fā)酵O2. -超氧陰離子自由基 普遍存在H2O+1/2O2 過氧化氫酶（好氧菌）2H2O過氧化氫酶（耐氧菌）NADH2NADO2. +2H+ H2O2+O2 -SOD（好氧菌及耐氧菌）1 1 1 細胞內(nèi)缺泛SOD、細胞色素氧化酶和過

11、氧化氫酶A. + B. A:B 共價結(jié)合均裂固體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法好氧菌的固體培養(yǎng)厭氧菌的固體培養(yǎng)好氧菌的液體培養(yǎng)厭氧菌的液體培養(yǎng)試管培養(yǎng)三角瓶（搖瓶）臺式發(fā)酵罐高層瓊脂柱厭氧培養(yǎng)皿Hungate rool-tube technique厭氧罐厭氧手套箱微生物培養(yǎng)法實驗室培養(yǎng)法生產(chǎn)實踐中的培養(yǎng)微生物裝置固體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法好氧菌-曲法培養(yǎng) 厭氧菌-堆積培養(yǎng)發(fā)酵罐（Fermenter）.Brewer 皿. .高層瓊脂柱亨蓋特技術(shù) 厭氧罐anaerobic jarAnaerobic Glove Box厭氧菌的培養(yǎng)Different culture methodsLiquid CultureBatch

12、culture Batch & Continuous culture10 ml20 ml- 1 L1 L - 1000LFermentor掛曲小曲紅曲近代人工踏制大曲近代人工踏制大曲A whole process of DA-QU prepationfermenterfermenter 有害微生物的控制Cncnc-micro幾個基本概念物理滅菌因素的代表高溫化學殺菌劑、消毒劑和治療劑消毒消毒(disinfection)(disinfection)：殺死或消除物體上的病原微生：殺死或消除物體上的病原微生 物的方法物的方法滅菌（滅菌（sterilitionsterilition）：殺死物體

13、上全部微生物的方法）：殺死物體上全部微生物的方法防腐防腐(antisepsis)(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生長：用理化方法防止抑制微生物生長 的方法的方法幾個基本概念幾個基本概念化療化療(chemotherapy)(chemotherapy)：利用對病源菌具有高度毒力而：利用對病源菌具有高度毒力而 對宿主基本無毒的化學物質(zhì)來抑制對宿主基本無毒的化學物質(zhì)來抑制 宿主體內(nèi)病源微生物的生長繁殖宿主體內(nèi)病源微生物的生長繁殖 高溫滅菌輻射作用高滲作用干燥超聲波Cncnc-micro控制微生物的物理因素高溫滅菌高溫滅菌多數(shù)細菌，酵母菌和霉菌的營養(yǎng)細胞和病毒在50-65 10 min

14、可以致死。F 一般噬菌體6580 致死， 放線菌霉菌的孢子比營養(yǎng)細胞抗熱性強，7680 10min可以殺死 B 細菌芽孢，在100 下20min才能致死， 嗜熱脂肪芽孢桿菌可在80 條件下生活，在120 ，12min才能殺死，BBBBBBBBBBB 同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。 Cncnc-micro高溫滅菌高溫滅菌干熱滅菌(dry heat sterilization) 濕熱滅菌(mosist heat sterilization) 焚燒滅菌法：常用與廢棄物動物尸體等處理。 烘烤滅菌法；實驗室用干燥箱烘烤接種工具。Cncnc-micro濕熱滅菌(mosist heat sterilizati

15、on) 煮沸滅菌法（煮沸消毒法） 高壓蒸汽滅菌法間歇滅菌法巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）該法比干熱滅菌效果好，因為蛋白質(zhì)在有水的情況下容易凝固，如含水50，蛋白質(zhì)凝固溫度為56；含水蛋白質(zhì)凝固溫度為160-170Cncnc-micro煮沸滅菌法（煮沸消毒法） 物品在水中煮沸 15min，可殺死所有營養(yǎng)細胞和一部分芽孢。在水中加入的 a2CO3或的碳酸效果更好。此法適合注射器和解剖用具的消毒。Cncnc-micro高壓蒸汽滅菌(normal autoclving)是濕熱滅中最好方法，通常在1.05kg/cm2,的壓力下面（此時溫度121）處理1530min。要排冷，否則會形成假壓，雖然壓力達到要求

16、，溫度卻達不到相應高度，而影響滅菌效果。間歇滅菌法(fractional sterilization)是用常壓蒸汽反復幾次進行滅菌的方法。Cncnc-micro主要用于不宜高壓滅菌的培養(yǎng)基，不耐熱的藥物和營養(yǎng)物等方法是將待滅菌物品置于蒸鍋內(nèi)加熱到沸騰維持15-30min殺死營養(yǎng)細胞，取出冷卻后在37恒溫培養(yǎng)24小時，使芽孢萌發(fā)，再用此法滅菌，反復三次，即可達到滅菌目的。巴氏消毒法(pasteurization)是食品（牛奶）釀造（啤酒）工業(yè)中常用的方法。Cncnc-micro具體做法是61.762.8處理30min或71.6度處理15min，這樣即可殺死病原微生物。又不致?lián)p壞營養(yǎng)，可保留食品飲

17、料原有用味。根據(jù)結(jié)核桿菌在62下15min被致死。 低溫維持法;高溫瞬時滅菌輻射 可見光紫外線（非電離輻射）Cncnc-microX射線與r射線 紫外線 O紫外線（非電離輻射）殺菌機制： 誘導核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾GGGGGGGG了核酸的復制H Cncnc-micro各種微生物對紫外線抗性 干細胞強于濕細胞芽孢，孢子強于營養(yǎng)細胞多倍體 二倍體 單倍體Cncnc-microX X射線與射線與r r射線射線直接學說 間接學說 r r射線是放射性元素Co60發(fā)射出的高能射線，F(xiàn) 具強穿透能力，500干倫琴劑量用于誘變育種，10萬倫琴以上具殺菌作用。G Cncnc-microCncnc-mi

18、cro高滲作用等滲溶液對微生物生長有利細菌處于低滲液中會吸水膨脹乃至破裂細胞處于高滲液中會脫水引起質(zhì)壁分離導致死亡。J Cncnc-micro控制微生物的化學物質(zhì)(因素)表面消毒劑表面消毒劑抗代謝物抗生素化學治療劑溶液狀態(tài)氣體狀態(tài)生物藥物素酸和堿 重金屬極其鹽類有機化合物 氧化劑 鹵素 染色劑 表面活性劑 Cncnc-micro表面消毒劑(surface disinfactant)酸和堿酸和堿 Cncnc-micro 前面講過微生物細胞中的DNA，RNA，CL，Pr，E只有在中性條件下才能體現(xiàn)活性， 因此強酸堿具殺菌作用。醫(yī)院病房常用乙酸消毒。重金屬極其鹽類是殺菌劑和防腐劑，作用最強的是Hg,

19、Ag,Cu,作用機理：使蛋白質(zhì)變性，使酶失活。（與E的SH結(jié)合。）00202Hgcl2（升汞）溶液對大多數(shù)細菌有致死作用。 CuSO4對真菌、藻類有強殺傷力，波爾多（CuSO4碳）防植物病害。 另外還有砷，鉍、銻的化合物是治療梅毒的特效藥。011 AgNO3 可消毒皮膚，1濃度新生兒點眼預防眼炎Cncnc-micro有機化合物有機化合物醇、醛、酚是常用的殺菌劑。 殺菌機制 損傷CW 使蛋白質(zhì)變性（細胞膜，E失活） 抑制脫氫酶，氧化酶活性。Cncnc-micro有機化合物有機化合物甲醛：純甲醛為氣體，3740水液為福爾馬林。 醇是脫水劑蛋白質(zhì)變性劑,70乙醇殺菌效果最好。 酚：35的石碳酸溶液幾

20、分鐘即可致死細菌甲酚殺菌力最強，煤酚皂液（來蘇爾）為甲酚和肥皂的混合液 。 Cncnc-micro氧化劑氧化劑K2MnO4使菌體蛋白質(zhì)氧化，使酶失活。77777 013濃度可用于皮膚，果品、餐具、消毒。H2O2清洗傷口。 Cncnc-micro酪AA+I2二碘酪氨酸 鹵素 碘殺菌力強，37碘溶于7083的乙醇中成碘酒。 氯及氯化物常用于水及食品消毒與水結(jié)合放出原子氧（O）用于消毒。上下氯，碘是常用的消毒劑氯，碘是常用的消毒劑Cncnc-micro染色劑干擾菌體氧化還原電位 阻礙芽孢的形成。 Cncnc-micro表面活性劑具有降低表面張力效應的物質(zhì)叫表面活性劑。常用的有新吉爾滅等，去污劑，肥皂

21、等。一落表面張力降低可抑菌或殺菌。五彩繽紛 Cncnc-micro抗代謝物(antimetabolite)有些化合物在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需的代謝物很相似，以至可以和特定的酶結(jié)合，從而阻礙了酶的功 能。干擾代謝的正常代謝。這些物質(zhì)稱為抗代謝物。Cncnc-micro葉酸 磺胺類藥物 氨基酸 5甲基色氨酸 吡哆醇 異煙肼 嘌呤 6巰基嘌呤抗代謝物代謝物二氫蝶啶二氫蝶啶二氫蝶酸二氫蝶酸二氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸四氫葉酸核核 酸酸氨基酸氨基酸前前 體體 PABA酶酶酶酶酶酶GluTMPCOOHH2NNH2SO2RCOOHH2NNH2SO2R磺胺藥(sulphonamides,sulfa drugs)抑菌機理 TMP:三甲基芐二氨嘧啶 (磺胺增效劑)選擇素力是由微生物在代謝過程