基因測序原理

1、任科教師任科教師: 余愛麗余愛麗生命科學(xué)院生命科學(xué)院 分子生物分子生物學(xué)與生物信息學(xué)系學(xué)與生物信息學(xué)系Genome Size (Mb)什么是什么是C 值？值？C值悖理：值悖理： 生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比例增加例增加細(xì)菌細(xì)菌真菌真菌等等動(dòng)物動(dòng)物陰影部分為一個(gè)門內(nèi)陰影部分為一個(gè)門內(nèi)C-值的范圍值的范圍 DNA 的復(fù)性的復(fù)性 遵循二級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，可表述為：遵循二級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，可表述為：dCt / dt = -KC02 反應(yīng)達(dá)反應(yīng)達(dá) t 時(shí)，單鏈時(shí)，單鏈DNA濃度濃度 = CtC0 = 單鏈單鏈 DNA起始濃度起始濃度 K 復(fù)性速度常數(shù)復(fù)性速度常數(shù)順

2、序復(fù)雜性Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常數(shù)常數(shù) Ct/C0 0101C0t(1/2) C0t(1/2) C0t(1/2)值與基因組復(fù)雜性成正比。值與基因組復(fù)雜性成正比。 是遺傳信息的物理和功能單位，包含是遺傳信息的物理和功能單位，包含產(chǎn)生產(chǎn)生一條多肽鏈或功能一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸所必需的全部核苷酸序列。序列。 基因分類：基因分類： 編碼編碼RNA的基因，如的基因，如rRNA基因，基因，snRNA基因等；基因等； 編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因2. 什么是基因？什么是基因？基因的不連續(xù)性基因的不連續(xù)性Intron 和和Exon: 大多數(shù)真核生物蛋

3、大多數(shù)真核生物蛋白質(zhì)基因的編碼順白質(zhì)基因的編碼順序序(Exon)都被或長都被或長或短的非編碼順序或短的非編碼順序(Intron)隔開隔開基因家族基因家族 一群具有一群具有一致的一致的或或相似相似順序順序的基因的基因, ,有的還擔(dān)負(fù)有的還擔(dān)負(fù)類似的生物學(xué)功能類似的生物學(xué)功能, , 可以相互補(bǔ)償可以相互補(bǔ)償, , 比如比如:E2f :E2f transcription factor transcription factor 假基因假基因(Pseudogene) 來源于功能基因來源于功能基因 但已失去活性但已失去活性 的的DNA序列序列產(chǎn)生假基因的原因有產(chǎn)生假基因的原因有: 由重復(fù)產(chǎn)生的假基因由重復(fù)

4、產(chǎn)生的假基因; 加工的假基因加工的假基因, 由由RNA反轉(zhuǎn)錄為反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后再整合后再整合到基因組中到基因組中;1. 殘缺的基因殘缺的基因(Truncated gene) 重迭基因有以下幾種情況：重迭基因有以下幾種情況：*一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部*部分重疊部分重疊* 兩個(gè)基因共用少數(shù)堿基對兩個(gè)基因共用少數(shù)堿基對 *一個(gè)基因完全在另一個(gè)一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部基因內(nèi)部如：如：B和和A， E和和D 其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同 -ATG-/-AATGCC -/-ATAACG-/-TAA-A*BATGCCN-NNATAA*部分重疊部分重疊 如：如：

5、K和和C *兩個(gè)基因共用少數(shù)兩個(gè)基因共用少數(shù)堿基對堿基對 如：如： D和和J-TAATG-D 終止密碼子終止密碼子J 起始密碼子起始密碼子A 克隆于質(zhì)粒中DNA用堿或熱變性B M13克隆單鏈DNAC 噬粒克隆DNAD PCR產(chǎn)生單鏈DNAA 高酶活性B 無53外切酶活性C 無35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基哌啶1 A TACGTTA2 GTTAGA TC3 ACGTTAGA4 CGTTAGA T5 GTTAGA TCDNA 樣品 TA TGCAA TCTAG與基因芯片上 65,000 種可能的八聚體進(jìn)行雜交從而形成特定的結(jié)合圖形計(jì)

6、算機(jī)分析雜交圖象并由探針的重疊情況推導(dǎo)樣品的核酸序列1 A TACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGA T5 GTTAGA TC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGA T互補(bǔ)序列為：A TACGTTAGA TC樣品序列為：TA TGCAA TCTAG利用基因芯片進(jìn)行雜交測序的原理ABCABCABCABC小片段測序小片段測序計(jì)算機(jī)拼裝計(jì)算機(jī)拼裝ABC小片段測序小片段測序計(jì)算機(jī)拼裝計(jì)算機(jī)拼裝鳥槍法鳥槍法(Shotgun)測序的問題測序的問題 CAATGCATTAGCAGCCAATGCGAP錯(cuò)裝錯(cuò)裝解決辦法:通過相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文

7、庫解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫 先將染色體打成比較大的片段先將染色體打成比較大的片段(幾十幾十-幾百幾百Kb), 利用利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig), 分別分別測序后拼裝測序后拼裝. 這種策略叫這種策略叫基于克隆群基于克隆群(contig-based)的策的策略略.ABCABC大片段大片段contig小片段測序拼裝小片段測序拼裝隨機(jī)測序與序列組裝方法和指導(dǎo)測序與序列組裝方法相結(jié)合進(jìn)行序列組裝 19號染色體是含基因最豐富的染色體，而13號染色體含基因量最少目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個(gè)功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能人類基因組中存在“熱點(diǎn)”和大片“荒漠”。在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有“無用DNA” 不包含或含有極少基因的