基因工程第九章重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞

1、第九章 重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞Transferring DNA to cells轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)染 感染 結(jié)合 其它一、轉(zhuǎn)化 transformation 一種遺傳轉(zhuǎn)移方式 1928年 Griffith 首次發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌（Diplococcus pneumoniae）少量無(wú)毒RII（無(wú)莢膜，粗糙） 大量殺死有毒SIII（有莢膜，光滑）混合注射小白鼠小鼠死亡可分離出活SIII細(xì)胞RII細(xì)胞 + SIII DNA即一來(lái)自一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞(供體)的DNA(片段)被另一個(gè)細(xì)胞(受體)所吸收(隨后同受體染色體一起進(jìn)行重組)對(duì)DNA的吸收，僅在受體生長(zhǎng)周期中的一個(gè)短暫階段。能夠吸收DNA的細(xì)胞，稱作感受態(tài)細(xì)胞(c

2、ompetent cell)肺炎鏈球菌產(chǎn)生的感受態(tài)因子能將感受態(tài)授于同一菌株的非感受態(tài)，而枯草芽胞桿菌的感受態(tài)因子似乎不能將感受態(tài)傳給非感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)因子可能是一種自溶酶(autolytic enzyme)，它能夠產(chǎn)生或暴露結(jié)合DNA的受體位點(diǎn)感受態(tài)的確定似乎涉及某些胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成在肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌中，在最大感受態(tài)時(shí)期，群體中感受態(tài)細(xì)胞可達(dá)100%。在B. subtilis中感受態(tài)細(xì)胞的比例似乎不超過(guò)10-15% 在轉(zhuǎn)化中有功能的DNA是雙鏈或ssDNA， 線狀或環(huán)狀（一）CaCl2轉(zhuǎn)化法 核心，目標(biāo)細(xì)胞在CaCl2H2O溶液中浸泡一段時(shí)間 E.coli：100mME.coli:

3、 DH5, TG1, XL-1Blue, JM105吸附(adsorb)：感受態(tài)細(xì)胞和DNA混合，冰上30min 熱激(heat shock)：42 90 sec恢復(fù)：12min復(fù)蘇：37 150rpm搖床 45-60 min感受態(tài)細(xì)胞的保藏：10%甘油0.1M CaCl2 -70 Mg2+, Co2+, Ru2+ , DMSO二甲基亞砜等可提高效率轉(zhuǎn)化效率107-109 cell/gDNA轉(zhuǎn)化子（transformant）（二）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 protoplastG+細(xì)菌，特別是芽胞桿菌(bacillus)，酶母(yeast)Lysozyme / 等滲環(huán)境下，脫細(xì)胞壁細(xì)胞壁再生原生質(zhì)體融合原

4、生質(zhì)體融合(三)電轉(zhuǎn)化法（electroporation）10%甘油(glycerol)或蔗糖(sucrose)，含(或不含)Mg2+ 離子2.5 KV/0.2cm 25F 200-400Gene Pulse, Bio-Rad 公司由噬菌體將細(xì)菌基因由一個(gè)細(xì)菌（供體）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌（受體）的過(guò)程二、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）（一）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) (generalized transduction)phage在供體烈解中，部分供體DNA被包裝，當(dāng)感染受體菌時(shí)，若感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection)小于1時(shí)，缺陷phage可將供體DNA注入受體(此時(shí)原phage DN

5、A不感染) 形成新的表型完全轉(zhuǎn)導(dǎo)：由噬菌體導(dǎo)入的DNA片斷通過(guò)雙交換整合到受體染色體上與寄主染色體同步復(fù)制，則稱為完全轉(zhuǎn)導(dǎo)(complete transduction)，如Salmonella typhimurium P22，反之，則為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortive transduction)(二) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)Specialized (or restricted) transduction phage 不正確切離，以10-6比率存在產(chǎn)生dgal or dbio當(dāng)dgal(低感染復(fù)數(shù))感染gal- E.coli時(shí)得到gal+ E.coli低頻轉(zhuǎn)移高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高感染復(fù)數(shù)時(shí)， 和10-6dgal+ 共同感染

6、gal- E.coli(+dgal)得gal+雙重溶源菌烈解half 和dgalTransductant 轉(zhuǎn)導(dǎo)子attPgalattBbiochromosomeintegrateattLgalbioattR prophagea) integrateb) excisionprophageattBattP attLattRInt+xls 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成gal chlDpglattBPNRmmAJattPBbio uvrBchlA正常切離正常切離 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成不正常切離不正常切離gal chlDpglattBPNRmmAJattPBbio uvrBchlA 轉(zhuǎn)導(dǎo)

7、噬菌體的形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成 d dgalgal chlDpglattBPNRmmAJattPBbio uvrBchlApglchlDgalattBPNAmmRm A gal chlDpglattBPNRmgal-gal- gal+gal+ gal+gal+gal-穩(wěn)定穩(wěn)定不穩(wěn)定不穩(wěn)定雙重溶源菌的形成雙重溶源菌的形成PPBPgalgalBBBPgalgalBPPBgalBPgalBPPBgal dgal雙重溶源菌進(jìn)入裂解狀態(tài)可產(chǎn)生兩種噬菌體雙重溶源菌進(jìn)入裂解狀態(tài)可產(chǎn)生兩種噬菌體感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)分離出來(lái)的噬菌體核酸所感染，隨后能產(chǎn)生出正常噬菌體后代，叫轉(zhuǎn)染三、轉(zhuǎn)染 (transfection)細(xì)菌

8、M13(or M13mp18)動(dòng)物細(xì)胞 SV40感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）指在一定體系中，病毒顆粒與敏感細(xì)胞的比率四、感染（infection）病原微生物在寄主組織內(nèi)立足的狀態(tài)如細(xì)菌的感染，Virus/ phage的感染phage包裝，cosmid感染概念交叉轉(zhuǎn)染：病毒核酸的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化：普通DNA的轉(zhuǎn)移感染：病毒的侵染轉(zhuǎn)導(dǎo)：強(qiáng)調(diào)轉(zhuǎn)移方式三親本雜交(triparental mating) a suitable conjugative plasmid-RP4 providing necessary transfer functions: pGJ28 or pDS4101 trans-acting factor， tra基因 pBR322 derivative 含Bom基因序列(位點(diǎn)的nic位點(diǎn))五、結(jié)合conjugation結(jié)合：細(xì)菌結(jié)合，纖毛原蟲結(jié)合，藻類結(jié)合， 免疫學(xué)結(jié)合細(xì)菌結(jié)合：通過(guò)兩細(xì)胞之間的直接接觸，遺傳物質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程，廣泛存在于細(xì)菌中。如F、R三雜本：cyanobacteriaE.coli J5