阿魏酸酯酶的研究與應(yīng)用

1、阿魏酸酯酶的研究與應(yīng)用 隨著全球人口和經(jīng)濟(jì)規(guī)模的不斷增長，能源使用帶來的環(huán)境問題及其誘因不斷地為人們所認(rèn)識，不止是煙霧、光化學(xué)煙霧和酸雨等的危害，大氣中二氧化碳濃度升高將帶來的全球氣候變化，也已被確認(rèn)為不爭的事實(shí)。二氧化碳的釋放很大部分是由于植物秸稈的燃燒。這不盡污染了環(huán)境而且也是對能源的浪費(fèi)。圖一：中國主要糧食作物年平均秸稈燃燒情況3.96108t0.94108t圖二：糧食作物秸稈露天焚燒排放情況纖維素是世界上最豐富的天然有機(jī)物，占植物界碳含量的50以上。圖三：一般木材中的成分此外，麻、麥稈、稻草、甘蔗渣等，都是纖維素的豐富來源。所以，應(yīng)如何充分利用秸稈，木材等生物原料？分解纖維素的酶： 纖

2、維素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿魏酸酯酶什么是阿魏酸酯酶？一：阿魏酸酯酶 feruloyl esterase 阿魏酸酯酶指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的一種酶。 它能切斷細(xì)胞壁中多糖-多糖、多糖-木質(zhì)素間的交聯(lián)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，因此在食品、飼料和造紙工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。阿魏酸酯酶A的三維結(jié)構(gòu)阿魏酸 阿魏酸(Ferulic Acid)的化學(xué)名稱為4羥基3甲氧基肉桂酸，是植物界普遍存在的一種酚酸,在植物體內(nèi)很少以游離態(tài)存在, 主要與細(xì)胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián)構(gòu)成細(xì)胞壁的一部分，與低聚糖、多胺、脂類和多糖形成結(jié)合態(tài)。它有許多保

3、健功能,如清除自由基、抗血栓、抗菌消炎、抑制腫瘤、防治高血壓、心臟病等。阿魏酸毒性低,易于為人體代謝,其用途越來越廣泛。阿魏酸在食品工業(yè)中主要用于制備天然香蘭素、抗氧化劑、防腐劑、交聯(lián)劑和機(jī)能促進(jìn)劑等,阿魏酸可通過化學(xué)合成法和提取法獲得。阿魏酸分子式目錄：一、阿魏酸酯酶 feruloyl esterase二、阿魏酸酯酶對其它纖維素酶類具有協(xié)同作用三、阿魏酸酯酶的結(jié)構(gòu)以及催化特性四、阿魏酸酯酶的分類和催化專一性五、阿魏酸酯酶的最適作用條件六、阿魏酸酯酶的應(yīng)用七、黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表達(dá)及快速酶活檢測體系的建立八、阿魏酸酯酶的研究現(xiàn)狀及展望二、阿魏酸酯酶對其它纖維素酶類具有協(xié)同作用 例1：

4、當(dāng)阿魏酸酯酶加入量為 240 mu/g對底物水解 72 h 時(shí), 稻草纖維素的酶解率、不溶性底物失重率較不加阿魏酸酯酶分別增加了 32.00%、32.77%； 阿魏酸酯酶(300 mu/g )對底物作用 120 min 后， 纖維素酶對稻草纖維素的酶解率、不溶性底物失重率分別增加了 29.85%、32.48%。由此表明, 阿魏酸酯酶和纖維素酶之間存在較大的協(xié)同作用，添加阿魏酸酯酶能夠提高纖維素酶對天然木質(zhì)纖維素的酶解效率。例2：在pH 值為 5.0、45 、料液比 1 30（g mL）條件下，取 47.5 U/mL 的木聚糖酶粗酶液 15 mL，加入 1.0 g 麥糟的乙醇不溶物，反應(yīng) 12

5、h 后，加入 40.8 U/mL 的阿魏酸酯酶粗酶液 15 mL 再反應(yīng) 12 h，阿魏酸和低聚木糖釋放率分別為 54.1%和 161 mg/g （麥糟的乙醇不溶物）。結(jié)果表明，阿魏酸酯酶與木聚糖酶存在協(xié)同作用，能極大提高麥糟中阿魏酸及低聚木糖的釋放率，有利于麥糟的降解。三、阿魏酸酯酶的結(jié)構(gòu)以及催化特性 由于其催化底物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相應(yīng)的阿魏酸酯酶也有著相當(dāng)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。雖然不同的阿魏酸酯酶結(jié)構(gòu)有差異，但都為球蛋白質(zhì)且大都具有Ser-His-Asp的“三點(diǎn)催化活性中心”僅結(jié)核分枝桿菌( M ycobacterium tu-berculosis)產(chǎn)生的酶的活性中心由Ser-Glu-His組成。 阿魏

6、酸酯酶A氨基酸序列： MKISAPRALALSVAVGHALAAVTKGVSDNIYNRLVDMATISQAAYADLCKIPATITTVEKIYNAQTDINGWVLRDDSRQEIIVVFRGTAGDTNLQLDTNYTLAPFDTLPKCIGCAVHGGYYLGWTSVQDQVESLVQQQAGQYPEYALTVTGHSLGASMAAITASQLSATYEHVTLYTFGEPRTGNLAYASYMNENFEATSPETTRFFRVTHGNDGIPNLPPAEQGYVHSGIEYWSVDPHRPGSTSVCTGNEVQCCEAQGGQGVNDDHITYFGMASGACSW-MKQFSAKY

7、ALILLATAGQALAASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTIIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTGSDTNLQLDTNYTLTPFDTLPQCNDCEVHGGYYIGWISVQDQVESLVKQQASQYPDYALTVTGHSLGASMAALTAAQLSATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPADEGYAHGGVEYWSVDPYSAQNTFVCTGDEVQCCEAQGGQGVNDAHTTYFGMTSGACTW 催化過程中阿魏酸酯酶的催化中心和輔助中心將阿魏酸酯化

8、合物中的阿魏酸殘基束縛，而后經(jīng)過一系列化學(xué)過程將酯鍵斷裂,使阿魏酸游離出來。四、阿魏酸酯酶的分類和催化專一性 阿魏酸酯酶對苯乙酸酯類具有催化專一性,然而不同的阿魏酸酯酶的催化專一性也有所不同,依據(jù)催化專一性的不同,阿魏酸酯酶最初被分為A、B兩種類型,后來又發(fā)現(xiàn)了一些其他類型。 A型 這一類阿魏酸酯酶對以1,5-酯鍵連接在阿拉伯糖殘基C-5上的阿魏酸具有催化專一性。當(dāng)原料用木聚糖酶預(yù)處理過或用木聚糖酶與阿魏酸酯酶協(xié)同水解時(shí),產(chǎn)物中有少量的5,5-和8-O-4-阿魏酸二聚體。A型的阿魏酸酯酶對苯環(huán)上有甲氧基(特別是在3,5位)的酚類酯都有催化特性。A型阿魏酸酯酶還可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、

9、芥子酸甲酯以及香蘭酸甲酯中的酯鍵,但是對咖啡酸甲酯無效。AnFaeA就是屬于A型的阿魏酸酯酶。當(dāng)以谷物作為培養(yǎng)基時(shí),微生物傾向于產(chǎn)生A型阿魏酸酯酶。 B型 以甜菜渣做培養(yǎng)基時(shí),微生物傾向于分泌B型阿魏酸酯酶。B型的阿魏酸酯酶對連接在阿拉伯糖殘基C-2和半乳糖殘基C-6上的阿魏酸酯鍵具有專一性,黑曲霉來源的B型阿魏酸酯酶對1,5-阿魏酸阿拉伯糖酯鍵也有催化作用,但效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于A型。另外B型的阿魏酸酯酶不能使阿魏酸二聚體游離出來。B型阿魏酸酯酶還可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯以及香蘭酸甲酯中的酯鍵,但是對芥子酸甲酯無效。B型阿魏酸酯酶的產(chǎn)酶微生物主要有黑曲霉、青霉和鏈孢霉菌等。 第三

10、種類型 目前還發(fā)現(xiàn)一種稱作XYLD的乙酸酯酶具有阿魏酸酯酶活性,它是從熒光假單胞桿菌的一個(gè)亞種中分離得到的,它對苯乙烯酚酸酯類(阿魏酸酯、咖啡酸酯、香蘭酸酯以及芥子酸酯)的化合物同樣有催化作用。用XYLD處理小麥的外殼,產(chǎn)物中有5,5-阿魏酸二聚體。此外,也有研究者依據(jù)誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基、能水解的酯鍵、肽鏈中氨基酸的序列和產(chǎn)物中是否產(chǎn)生阿魏酸的二聚體等因素進(jìn)一步把阿魏酸酯酶細(xì)分為A、B、C、D 4類。 Table 1 Classification of feruloyl esterases菌株名稱黑曲霉Aspergillus niger產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum繩狀青霉

11、Penicillium funiculosum熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens粗糙脈孢菌Neurospora crassa互隔交鏈孢菌Alternaria alternata甘藍(lán)鏈格孢菌 Alternariabrassicicola阿魏酸酯酶的名稱Type-A feruloyl esterase from Penicillium chrysogenumType-B feruloyl esterase from Penicillium chrysogenumType-C feruloyl esterase from Penicillium chrysogenumType

12、-A feruloyl esterase from Aspergillus nigerType-B feruloyl esterase from Aspergillus NigerType-C feruloyl esterase from Sporotrichum thermosporumPcFacCPcFacBStFaeCAnFaeBPcFacAAnFaeA五、阿魏酸酯酶的最適作用條件 阿魏酸酯酶種類不同,其作用的最適條件也不盡相同。表1列出了典型的產(chǎn)酶微生物黑曲霉所產(chǎn)生的幾種阿魏酸酯酶的最適作用條件。 例：方園等人利用泡盛曲霉固體發(fā)酵麥麩，蔗渣等纖維質(zhì)原料產(chǎn)生阿魏酸酯酶，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行

13、初步檢驗(yàn)，結(jié)果表明： 該酶制劑最適 pH 為 6.0，最適溫度為 25 ，Cu2+、Fe2+、EDTA 對該酶活力有激活作用，Mg2+、Zn2+、Mn2+則有一定的抑制作用。其中，Cu2+的最適添加濃度為 0.25 mol/L，EDTA 與 Fe2+的最適添加濃度為 0.20 mol/L。W( 最適酶) :W( 底物) = 1:100，在 1.5 h 后，酶解產(chǎn)率達(dá)到最高。并研究該酶對去淀粉麥麩、蔗渣、玉米皮和玉米芯這 4 種天然纖維質(zhì)原料的酶解效果，結(jié)果表明該酶對去淀粉麥麩的酶解效果最佳。產(chǎn)生阿魏酸的質(zhì)量濃度達(dá)到72.93 mg / L。六、阿魏酸酯酶的應(yīng)用 1.在食品工業(yè)中的應(yīng)用 研究表明

14、阿魏酸可以作為抗氧化劑用于油脂的抗氧化,除此之外,阿魏酸還具有的抗腫瘤、消炎、促進(jìn)傷口愈合等保健作用,所以阿魏酸可作為功能因子開發(fā)功能性的食品。同時(shí),阿魏酸可以作為合成天然香蘭素的前體,以阿魏酸為原料,利用微生物的方法生產(chǎn)的香蘭素與合成的香蘭素相比具有毒性低,安全性高的特點(diǎn),可以用作食品和化妝品行業(yè)的香料。阿魏酸大量存在于植物的細(xì)胞壁中,研究者使用阿魏酸酯酶和使用阿魏酸酯酶與其他酶協(xié)同作用從各種農(nóng)作物的副產(chǎn)品中提取阿魏酸的研究取得了一定的成果,目前主要使用麥麩、玉米麩皮等作為原材料來提取阿魏酸。 2.在飼料和造紙工業(yè)中的應(yīng)用 利用阿魏酸酯酶處理植物性的原材料,可以將阿魏酸從植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中游

15、離出來,從而破壞了細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu),使得木質(zhì)素、半纖維素以及纖維素之間的連接被部分打破,結(jié)構(gòu)變得比處理前疏松。 在飼料工業(yè)中,變得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用,可以提高飼料的利用效率。而在造紙工業(yè)中,纖維素是構(gòu)成紙張的主要成分,半纖維素可部分被利用,木質(zhì)素是需要去除的成分,經(jīng)阿魏酸酯酶處理的原料,木質(zhì)素更容易脫除,因而可以減少制漿工序的化學(xué)藥品用量。而纖維細(xì)胞壁經(jīng)阿魏酸酯處理后,表面變得疏松,更容易形成分叉,在成紙時(shí),纖維間的交織力變大,可以提高紙品的機(jī)械強(qiáng)度。 七、黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、 表達(dá)及快速酶活檢測體系的建立黑曲霉在PDA固體培養(yǎng)基上劃線活化挑取黑曲霉孢子接種于50 mL黑

16、曲霉液體基本培養(yǎng)基中收集菌體以CTAB法提取總RNA以總RNA為模板，以oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA.以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增出編碼阿魏酸酯酶的cDNA經(jīng)膠回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上后轉(zhuǎn)化E.coli DH5感受態(tài)細(xì)胞。7.1.黑曲霉阿魏酸酯酶A cDNA的獲得培養(yǎng)5d培養(yǎng)24 h7.2.表達(dá)載體的構(gòu)建、陽性克隆的篩選和表達(dá)以正確的質(zhì)粒為模 板擴(kuò)增無信號肽的成熟阿魏酸酯酶編碼序列產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用EcoR I和Not I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切連接到pPIC9K上相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)用限制性內(nèi)切酶Bgl II酶切pPIC9K/NS-faeA回收目

17、的片段用電擊法轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115.將轉(zhuǎn)化的畢赤酵母涂布于MD瓊脂平板上培養(yǎng)2 d挑取單菌落,在BMGY中培養(yǎng)1d離心收集菌體提取其基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)化情況挑取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的陽性菌落，在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d（30、200rmp)離心收集的菌體重懸于10 mLBMMY培養(yǎng)基同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)3 d，每天補(bǔ)加50 L的甲醇 7.3酶活的快速檢測 反應(yīng)體系為1 mL，其組成為：100 L體積10 mmol/L的阿魏酸對硝基苯酚酯的DSMO溶液，800 L含有2.5% (V/V)的Triton X-100的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 6.4)和100 L的酶溶液。

18、 在40 反應(yīng)30 min后于410 nm波長處測定阿魏酸對硝基苯酚酯降解生成對硝基苯酚的吸光度，并計(jì)算出生成對硝基苯酚的濃度。7.4部分實(shí)驗(yàn)步驟：1、PCR擴(kuò)增：（小試，共20L）ddH2O 14.4L 72 L 10 PCRbuffer 2L 10L 引物1（10M） 1L 5L 引物2（10M） 1L 5 5L 混勻分裝19L/管5管 dNTP（10mM） 0.4L 2L 模板（原液40 稀釋）1L Taq酶 0.2L 1L按順序加入上述物質(zhì)，最后加入Taq酶 PCR反應(yīng)程序 94 5min 94 30s Tm 30s 26個(gè)循環(huán) 72 1min 72 10min 4 保存以上PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠（0.8%）2、PCR擴(kuò)增：（大試，共200L）ddH2O 144L 10 PCRbuffer 20L 引物1（10M） 10L 引物2（10M） 10L 混勻分裝40L/管5管 dNTP（10mM） 4L 模板 10L Taq酶 2L按順序加入上述物質(zhì)，最后加入Taq酶 PCR反應(yīng)程序 94 5min 94 30s Tm 30s 30個(gè)循環(huán) 72 1min 72 10min 4 保存以上PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠（0.8%）八、阿魏酸酯酶的研究現(xiàn)狀及展望到目前為止,阿魏酸酯酶的研究上已進(jìn)行了一些卓有成效的工作。首先,篩選了一批能