肝素鈉的提取及其乳膏的制備

1、我們畢業(yè)啦其實(shí)是答辯的標(biāo)題地方肝素鈉的提取及其乳膏制備組員指導(dǎo)老師研究背景肝素鈉的提取分析總結(jié)CONTANTS肝素鈉效價(jià)的測(cè)定肝素鈉乳膏的制備研究背景It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolishness. 肝素鈉肝素鈉 (Heparin Sodium ) ：l從動(dòng)物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞提取的鈉鹽從動(dòng)物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞提取的鈉鹽,，屬粘多糖類物質(zhì)。，屬粘多糖類物質(zhì)。l天然抗凝血物質(zhì)天然抗凝血物質(zhì), 被廣泛用于治療血栓塞、暴發(fā)性流腦、敗

2、血癥等被廣泛用于治療血栓塞、暴發(fā)性流腦、敗血癥等疾病。疾病。l從生物學(xué)角度來講從生物學(xué)角度來講, 肝素鈉是一種含硫酸脂的氨基葡萄糖、艾杜糖肝素鈉是一種含硫酸脂的氨基葡萄糖、艾杜糖醛酸和葡萄糖酸的生物活性物質(zhì)。在機(jī)體內(nèi)它與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合醛酸和葡萄糖酸的生物活性物質(zhì)。在機(jī)體內(nèi)它與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物存在于肥大細(xì)胞中物存在于肥大細(xì)胞中, 可被蛋白酶解離出來可被蛋白酶解離出來, 它在溶液中呈強(qiáng)電荷的它在溶液中呈強(qiáng)電荷的聚陰離子狀態(tài)聚陰離子狀態(tài), 與強(qiáng)堿性與強(qiáng)堿性D208陰離子樹脂有較強(qiáng)的親和力陰離子樹脂有較強(qiáng)的親和力, 易被吸附易被吸附而分離。而分離。研究背景肝素鈉結(jié)構(gòu)式肝素鈉結(jié)構(gòu)式 臨床上肝素鈉的常

3、見劑型包括注射劑和乳膏劑。臨床上肝素鈉的常見劑型包括注射劑和乳膏劑。 乳膏劑是外用法給藥的劑型之一，通過皮膚、孔竅、經(jīng)絡(luò)及病乳膏劑是外用法給藥的劑型之一，通過皮膚、孔竅、經(jīng)絡(luò)及病變局部等部位治療疾病，避免了胃腸道的破壞與肝首過效應(yīng)，減少變局部等部位治療疾病，避免了胃腸道的破壞與肝首過效應(yīng)，減少血藥濃度峰谷變化，已成為克服藥物副作用的有效用藥途徑之一。血藥濃度峰谷變化，已成為克服藥物副作用的有效用藥途徑之一。 肝素鈉乳膏劑（肝素鈉乳膏劑（Heparin sodium Cream）常用于早期凍瘡、皸）常用于早期凍瘡、皸裂、潰瘍、濕疹及淺表性靜脈炎和軟組織損傷。裂、潰瘍、濕疹及淺表性靜脈炎和軟組織損

4、傷。 工藝現(xiàn)狀：工藝現(xiàn)狀： 以豬小腸粘膜提取肝素鈉為主；以豬小腸粘膜提取肝素鈉為主； 生產(chǎn)得率較低生產(chǎn)得率較低, 且混有大量有害物質(zhì)且混有大量有害物質(zhì), 不利于臨床應(yīng)用；不利于臨床應(yīng)用； 需大量進(jìn)口需大量進(jìn)口, 價(jià)格昂貴。價(jià)格昂貴。研究背景肝素鈉的提取It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolishness. 實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法：1.原料采集及酶解吸附原料采集及酶解吸附2.離子交換吸附離子交換吸附2.1 D208樹脂預(yù)處理樹脂預(yù)處理2.

5、2 吸附與洗脫吸附與洗脫 靜態(tài)吸附：將上述樹脂加入到已處理好的酶解液中，混勻，調(diào)節(jié)靜態(tài)吸附：將上述樹脂加入到已處理好的酶解液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至至8.5，置于混合器上攪拌過夜吸附。置于混合器上攪拌過夜吸附。 線性洗脫：裝填靜態(tài)吸附后的樹脂，按下表配置洗脫液。線性洗脫：裝填靜態(tài)吸附后的樹脂，按下表配置洗脫液。 靜態(tài)洗脫：取動(dòng)態(tài)洗脫的樹脂于燒杯，加入靜態(tài)洗脫：取動(dòng)態(tài)洗脫的樹脂于燒杯，加入4mol/LNacl溶液，攪拌吸附溶液，攪拌吸附30min，取上清液，留樣。，取上清液，留樣。3.肝素鈉的精制肝素鈉的精制試劑試劑體積（體積（ml） 重量（重量（g）3%Nacl1002.93mol/LNacl10

6、017.50.5 mol/L Nacl250.74 mol/L Nacl20046.8肝素鈉的提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1 1. .離子交換吸附離子交換吸附 肝素鈉洗脫曲線圖肝素鈉洗脫曲線圖 在肝素鈉動(dòng)態(tài)洗脫曲線圖中在肝素鈉動(dòng)態(tài)洗脫曲線圖中有一峰谷，代表洗脫出來的是雜有一峰谷，代表洗脫出來的是雜質(zhì)峰，在此之前和之后分別有一質(zhì)峰，在此之前和之后分別有一個(gè)持續(xù)平衡的吸光度范圍，其吸個(gè)持續(xù)平衡的吸光度范圍，其吸光值為光值為0.509-0.513，由此可判斷，由此可判斷A=0.513為儀器在為儀器在220nm處可顯處可顯示的最大吸光度。第二個(gè)下降區(qū)示的最大吸光度。第二個(gè)下降區(qū)吸光度由吸光度由0.513下

7、降至下降至0.086，表，表示樹脂上的物質(zhì)逐漸洗脫完全。示樹脂上的物質(zhì)逐漸洗脫完全。肝素鈉的提取 在第二個(gè)穩(wěn)定吸光度區(qū)（在第二個(gè)穩(wěn)定吸光度區(qū)（A=0.513-0.509）收集洗脫液與加入乙醇后對(duì)比，呈）收集洗脫液與加入乙醇后對(duì)比，呈現(xiàn)明顯的渾濁，見圖現(xiàn)明顯的渾濁，見圖3。其原因可能是由。其原因可能是由于肝素鈉是一種多糖，加入乙醇后通過降于肝素鈉是一種多糖，加入乙醇后通過降低水溶液的介電常數(shù)脫水，從而產(chǎn)生沉淀低水溶液的介電常數(shù)脫水，從而產(chǎn)生沉淀分離。在反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)：加熱會(huì)使渾濁分離。在反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)：加熱會(huì)使渾濁溶液澄清，而冷凍會(huì)增加沉淀析出量，所溶液澄清，而冷凍會(huì)增加沉淀析出量，所以反應(yīng)受到

8、溫度的影響；當(dāng)然反應(yīng)過程中以反應(yīng)受到溫度的影響；當(dāng)然反應(yīng)過程中乙醇濃度增大時(shí)，沉淀析出量也會(huì)增加。乙醇濃度增大時(shí)，沉淀析出量也會(huì)增加。A=0.509-0.513處洗脫液加入乙醇處洗脫液加入乙醇前（左）和加入乙醇后（右）對(duì)比前（左）和加入乙醇后（右）對(duì)比圖圖2.肝素鈉的精制肝素鈉的精制白色略黃肝素鈉粉末，共白色略黃肝素鈉粉末，共0.0131g 肝素鈉成品肝素鈉成品肝素鈉的提取肝素鈉的效價(jià)測(cè)定It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolish

9、ness. 實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法：1.效價(jià)測(cè)定效價(jià)測(cè)定 按下表處理標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及成品：按下表處理標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及成品：肝素鈉溶液肝素鈉溶液濃度（濃度（u/mL）血漿（血漿（mL）肝素稀釋液（肝素稀釋液（mL）1% Cacl2溶液（溶液（mL）空白空白-0.25-0.05標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品0.9690.250.20.051.140.250.20.051.3410.250.20.05樣品樣品1號(hào)號(hào)稀釋稀釋10倍倍0.250.20.05樣品樣品2號(hào)號(hào)稀釋稀釋10倍倍0.250.20.05成品成品0.000026g/mL0.1250.10.025先加入血漿，置先加入血漿，置370.5恒溫水浴保溫恒溫水浴保溫5m

10、in；取出后加入肝；取出后加入肝素鈉溶液，然后迅速加入素鈉溶液，然后迅速加入1% Cacl2溶液，溶液，370.5恒溫水浴恒溫水浴保溫保溫3min。肝素鈉的效價(jià)測(cè)定2.2.紫外吸收測(cè)定紫外吸收測(cè)定 用純水將紫外檢測(cè)儀校零（用純水將紫外檢測(cè)儀校零（220nm、280nm）,按下表配置溶液按下表配置溶液測(cè)定測(cè)定 。肝素鈉溶液肝素鈉溶液稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)吸光倍數(shù)吸光倍數(shù)220nm樣品樣品1號(hào)號(hào)1000.05A樣品樣品2號(hào)號(hào)1000.05A成品成品51A280nm樣品樣品1號(hào)號(hào)500.05A樣品樣品2號(hào)號(hào)500.05A成品成品500.05A肝素鈉的效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.1.肝素鈉的效價(jià)測(cè)定肝素

11、鈉的效價(jià)測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)測(cè)定中，標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)測(cè)定中，0.969U/mL標(biāo)準(zhǔn)品管血清出現(xiàn)半凝固標(biāo)準(zhǔn)品管血清出現(xiàn)半凝固狀態(tài)，以此管為參照。樣品狀態(tài)，以此管為參照。樣品1號(hào)、號(hào)、2號(hào)管血漿均出現(xiàn)半凝固狀態(tài)。號(hào)管血漿均出現(xiàn)半凝固狀態(tài)。樣品效價(jià)：樣品效價(jià)：0.969U/mL10=9.69 U/mL。成品效價(jià)：成品效價(jià)： 0.969U/mL0.000026g/mL=37.27U/mg。效價(jià)測(cè)定半凝固點(diǎn)圖效價(jià)測(cè)定半凝固點(diǎn)圖（從右至左依次為標(biāo)準(zhǔn)品（從右至左依次為標(biāo)準(zhǔn)品0.969U/mL、樣品樣品1號(hào)、樣品號(hào)、樣品2號(hào)、成品）號(hào)、成品）肝素鈉的效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：2.肝素鈉紫外吸收測(cè)定肝素鈉紫外吸收測(cè)定

12、于于220nm處測(cè)定肝素鈉吸光度，處測(cè)定肝素鈉吸光度，280nm處測(cè)定殘留蛋白吸處測(cè)定殘留蛋白吸光度，結(jié)果見下表。蛋白質(zhì)由于含有色氨酸殘基和酪氨酸殘基，光度，結(jié)果見下表。蛋白質(zhì)由于含有色氨酸殘基和酪氨酸殘基，其分子內(nèi)部存在共軛雙鍵，在其分子內(nèi)部存在共軛雙鍵，在280nm處有一特征吸收峰，但因處有一特征吸收峰，但因肽鍵的存在，在肽鍵的存在，在220nm處也有一吸收峰，故對(duì)肝素鈉的紫外測(cè)處也有一吸收峰，故對(duì)肝素鈉的紫外測(cè)定存在干擾。定存在干擾。肝素鈉溶液肝素鈉溶液吸光度吸光度220nm樣品樣品1號(hào)號(hào)0.1410.705樣品樣品2號(hào)號(hào)0.1190.595成品成品0.2561.28280nm樣品樣品1

13、號(hào)號(hào)0.1810.4525樣品樣品2號(hào)號(hào)0.1530.3575成品成品0.4851.2125肝素鈉的效價(jià)測(cè)定肝素鈉乳膏的制備It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolishness. 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1.乳膏的制備乳膏的制備 處方：處方： 肝素鈉肝素鈉 7.9mg 液體石蠟液體石蠟 11mL 硬脂酸硬脂酸 1.5g 蜂蠟蜂蠟 2.4g 石蠟石蠟 2.6g 硼砂硼砂 0.1g 純水純水 3.3mL 按處方精密稱取液體石蠟、石蠟、硬脂酸、蜂

14、蠟在水浴上加按處方精密稱取液體石蠟、石蠟、硬脂酸、蜂蠟在水浴上加熱融化，并保持溫度熱融化，并保持溫度90，得油相備用。按處方量稱取肝素鈉、，得油相備用。按處方量稱取肝素鈉、硼砂溶解于純水中，并保持溫度硼砂溶解于純水中，并保持溫度90，得水相備用。先將油相，得水相備用。先將油相2/5緩慢加入水相中，邊加邊攪拌至初乳形成。將初乳緩慢滴加至油緩慢加入水相中，邊加邊攪拌至初乳形成。將初乳緩慢滴加至油相中，室溫下迅速攪拌，至溫度下降至室溫，既得肝素鈉油包水相中，室溫下迅速攪拌，至溫度下降至室溫，既得肝素鈉油包水型乳劑。型乳劑。肝素鈉乳膏的制備實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法2.乳膏的顯微觀察乳膏的顯微觀察取取30%甘油

15、一滴于載玻片上，用玻璃棒蘸取實(shí)驗(yàn)樣品少量，取少甘油一滴于載玻片上，用玻璃棒蘸取實(shí)驗(yàn)樣品少量，取少量蘇丹紅顆粒染色，涂勻，量蘇丹紅顆粒染色，涂勻，40/0.65倍鏡下觀察。倍鏡下觀察。3.質(zhì)量評(píng)價(jià)質(zhì)量評(píng)價(jià)外觀、感受、酸堿度、焰色反應(yīng)、效價(jià)測(cè)定外觀、感受、酸堿度、焰色反應(yīng)、效價(jià)測(cè)定穩(wěn)定性試驗(yàn)：將乳膏分裝于穩(wěn)定性試驗(yàn)：將乳膏分裝于3個(gè)塑料燒杯中。個(gè)塑料燒杯中。1號(hào)杯置于室溫，號(hào)杯置于室溫，2號(hào)杯置于號(hào)杯置于55培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中，3號(hào)杯置于號(hào)杯置于-15冰箱中。冰箱中。24小時(shí)后觀察。小時(shí)后觀察。肝素鈉乳膏的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.肝素鈉乳膏顯微觀察肝素鈉乳膏顯微觀察 肝素鈉乳膏未經(jīng)染色時(shí)呈現(xiàn)晶塊狀

16、，染色后可明顯觀察到小肝素鈉乳膏未經(jīng)染色時(shí)呈現(xiàn)晶塊狀，染色后可明顯觀察到小顆粒狀油球，表明乳膏出現(xiàn)了一定的均勻狀態(tài)，其原理是蘇丹紅顆粒狀油球，表明乳膏出現(xiàn)了一定的均勻狀態(tài)，其原理是蘇丹紅在脂類物質(zhì)中的溶解度大于在溶劑中的溶解度，當(dāng)接觸脂質(zhì)類在脂類物質(zhì)中的溶解度大于在溶劑中的溶解度，當(dāng)接觸脂質(zhì)類時(shí)，進(jìn)入脂類內(nèi)部呈色。時(shí)，進(jìn)入脂類內(nèi)部呈色。 肝素鈉乳膏（未染色）顯微觀察肝素鈉乳膏（未染色）顯微觀察 肝素鈉乳膏（染色）顯微觀察肝素鈉乳膏（染色）顯微觀察 肝素鈉乳膏的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.肝素鈉乳膏質(zhì)量評(píng)價(jià)肝素鈉乳膏質(zhì)量評(píng)價(jià)性狀：乳白色肝素鈉乳膏，十分粘稠，細(xì)膩無顆粒。性狀：乳白色肝素鈉乳膏，十分粘

17、稠，細(xì)膩無顆粒。 酸堿度：酸堿度：pH=7.37焰色反應(yīng)：火焰呈黃色焰色反應(yīng)：火焰呈黃色肝素鈉乳膏肝素鈉乳膏肝素鈉乳膏焰色反應(yīng)肝素鈉乳膏焰色反應(yīng)肝素鈉乳膏的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.肝素鈉乳膏質(zhì)量評(píng)價(jià)肝素鈉乳膏質(zhì)量評(píng)價(jià) 效價(jià)測(cè)定：稀釋效價(jià)測(cè)定：稀釋0,1,10,20倍數(shù)后進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，每管都出現(xiàn)半凝倍數(shù)后進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，每管都出現(xiàn)半凝固狀態(tài)，以未稀釋管計(jì)算效價(jià)：固狀態(tài)，以未稀釋管計(jì)算效價(jià)：4.845U/g17.72595g=85.88U 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：24小時(shí)后，分別觀察耐熱、常溫、耐寒條件下肝素小時(shí)后，分別觀察耐熱、常溫、耐寒條件下肝素鈉乳膏狀態(tài)，可明顯觀察到耐熱試驗(yàn)中肝素鈉乳膏油水分

18、層。鈉乳膏狀態(tài)，可明顯觀察到耐熱試驗(yàn)中肝素鈉乳膏油水分層。 85.85100%29.17%37.27 7.9肝素鈉乳膏效價(jià)測(cè)定肝素鈉乳膏效價(jià)測(cè)定 （從左至右依次為稀釋（從左至右依次為稀釋0、1、10、20倍數(shù)）倍數(shù)）肝素鈉穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)肝素鈉穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)肝素鈉乳膏的制備討論與分析It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolishness. 1.工藝流程工藝流程腸粘膜必須新鮮腸粘膜必須新鮮, 由于粘膜污染有許多微生物由于粘膜污染有許多微生物, 長(zhǎng)

19、時(shí)間保存會(huì)發(fā)酵產(chǎn)長(zhǎng)時(shí)間保存會(huì)發(fā)酵產(chǎn)生肝素酶生肝素酶,分解肝素鈉。分解肝素鈉。酶解一方面使肝素釋放，另一方面又要除去大量雜蛋白，以防大分酶解一方面使肝素釋放，另一方面又要除去大量雜蛋白，以防大分子雜質(zhì)堵塞樹脂孔徑而影響對(duì)肝素分子的吸附。子雜質(zhì)堵塞樹脂孔徑而影響對(duì)肝素分子的吸附。pH略大一方面有利于增大肝素離子化程度，以便于最大程度吸附；略大一方面有利于增大肝素離子化程度，以便于最大程度吸附；另一方面不會(huì)對(duì)官能團(tuán)離子化產(chǎn)生大的影響，吸附率下降可能與樣另一方面不會(huì)對(duì)官能團(tuán)離子化產(chǎn)生大的影響，吸附率下降可能與樣品中雜質(zhì)離子化增大后競(jìng)爭(zhēng)吸附有關(guān)。品中雜質(zhì)離子化增大后競(jìng)爭(zhēng)吸附有關(guān)。乙醇沉淀時(shí)乙醇沉淀時(shí), 必須在攪拌的