生物化學課件-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能

1、五、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)五、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽鏈以特殊方是由一條或多條多肽鏈以特殊方式組合成的生物大分子。式組合成的生物大分子。 蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在將分子量在60006000道爾頓道爾頓( (dalton,ddalton,d) )以上以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。的多肽稱為蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大, , 從大約從大約60006000到到100100萬道爾頓甚至更大。萬道爾頓甚至更大。1.1.構(gòu)型和構(gòu)象構(gòu)型和構(gòu)象構(gòu)型構(gòu)型(configuration)(configuration)：立體異構(gòu)體分

2、子中立體異構(gòu)體分子中取代原子或者基團的取向。這種排列的改取代原子或者基團的取向。這種排列的改變會牽涉到變會牽涉到共價鍵共價鍵的的形成和破壞形成和破壞，但與氫，但與氫鍵無關(guān)。例如氨基酸的鍵無關(guān)。例如氨基酸的D-D-和和L-L-型。型。構(gòu)象構(gòu)象(conformation)：取代基團單鍵旋轉(zhuǎn)時取代基團單鍵旋轉(zhuǎn)時形成的不同的立體結(jié)構(gòu)，這種空間位置的形成的不同的立體結(jié)構(gòu)，這種空間位置的改變改變會牽涉到氫鍵的形成和破壞，但共價會牽涉到氫鍵的形成和破壞，但共價鍵不被破壞。鍵不被破壞。 一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu) 三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu) 四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)aaaa順序順序 -螺旋螺旋 多肽鏈多肽鏈 寡聚蛋白寡

3、聚蛋白 （單體蛋白或亞基）（單體蛋白或亞基） 2.2.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(primary structure)指蛋白指蛋白 質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序。質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序。 蛋白質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈蛋白質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈 數(shù)目，多肽鏈的氨基酸序列，以及多肽鏈內(nèi)數(shù)目，多肽鏈的氨基酸序列，以及多肽鏈內(nèi) 或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置?；蜴滈g二硫鍵的數(shù)目和位置。 二硫鍵二硫鍵（disulfide bond）：由肽鏈中相應(yīng)部由肽鏈中相應(yīng)部 位上兩個半胱氨酸殘基的側(cè)鏈脫氫形成。位上兩個半胱氨酸殘基的側(cè)鏈脫氫形成。 鏈間鏈

4、間二硫鍵二硫鍵 鏈內(nèi)鏈內(nèi)二硫鍵二硫鍵我國我國19651965年在世界上第一個用化年在世界上第一個用化學方法人工合成這種學方法人工合成這種牛胰島素牛胰島素。牛胰核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)牛胰核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)（1 1）蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理）蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理；（2 2）測定每條多肽鏈的氨基酸組成測定每條多肽鏈的氨基酸組成；（3 3）測定）測定多肽鏈的多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端末端；（4 4）應(yīng)用兩種或兩種以上不同的水解方法將所要）應(yīng)用兩種或兩種以上不同的水解方法將所要測定的蛋白質(zhì)斷裂，各自得到一系列大小不同測定的蛋白質(zhì)斷裂，各自得到一系列大小不同的肽段；的肽段；（5 5）分離提純所產(chǎn)生的

5、肽，并測定它們的序列；）分離提純所產(chǎn)生的肽，并測定它們的序列；（6 6）從有重疊結(jié)構(gòu)的各個肽的序列中推斷出蛋白）從有重疊結(jié)構(gòu)的各個肽的序列中推斷出蛋白質(zhì)中全部氨基酸順序。質(zhì)中全部氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的步驟蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的步驟（3 3）分析多肽鏈的分析多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端末端; ; N-N-端氨基酸分析法：端氨基酸分析法： DNFBDNFB法、法、EdmanEdman法、氨肽酶法（法、氨肽酶法（肽鏈外切肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的酶，它能從多肽鏈的N-N-端逐個的向里水解端逐個的向里水解） C-C-端氨基酸分析法：端氨基酸分析法：羧肽酶法（羧肽酶法（肽鏈外切酶，它

6、能從多肽鏈的肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-C-端端逐個的逐個的向里向里水解水解）、肼解法）、肼解法肼解法肼解法 多肽與肼在無多肽與肼在無水條件下加熱，水條件下加熱，C-C-端氨基酸即端氨基酸即從肽鏈上解離從肽鏈上解離出來，其余的出來，其余的氨基酸則變成氨基酸則變成肼化物；肼化肼化物；肼化物能夠與苯甲物能夠與苯甲醛縮合成不溶醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而于水的物質(zhì)而與與C-C-端氨基酸端氨基酸分離。分離。3、多肽鏈折疊的空間限制多肽鏈折疊的空間限制 肽鍵帶有雙鍵的性質(zhì)，主鏈上肽鍵帶有雙鍵的性質(zhì)，主鏈上1/31/3的鍵不能自的鍵不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵中的四個原子和它相臨的兩個由旋轉(zhuǎn)。肽鍵中的四個原子和它相臨

7、的兩個C C原子都處于一個平面上（原子都處于一個平面上（酰胺平面）酰胺平面）。多肽鏈通過可多肽鏈通過可 旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)的- - 碳碳 原原 子連接子連接的酰胺平面鏈的酰胺平面鏈 二個肽平面旋轉(zhuǎn)時受到二個肽平面旋轉(zhuǎn)時受到C C原子上側(cè)鏈原子上側(cè)鏈R R基空間位阻的影響?；臻g位阻的影響。 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)v蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)( (Secondary Structure)Secondary Structure) 是指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞方式。是指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞方式。v它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。成

8、的氫鍵。v主要有主要有 - -螺旋、螺旋、 - -折疊、折疊、 - -轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲曲等。等。（1 1） - -螺旋螺旋( ( - -helix)helix)最常見最常見多肽鏈中的各個肽平面圍繞多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為即螺距為0.540.54nm,nm,含含3.63.6個個AaAa殘基；兩個殘基；兩個AaAa之間的距離為之間的距離為0.150.15nmnm；AaAa殘基殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰的螺圈之間的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵；形成鏈內(nèi)氫鍵；天然蛋白質(zhì)的天然蛋白

9、質(zhì)的 - -螺旋通常都螺旋通常都是右手是右手 - -螺旋。螺旋。氫鍵的取向幾乎與軸平行，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個氨基酸殘基的酰胺基第一個氨基酸殘基的酰胺基團的團的- -COCO基與第五個氨基酸基與第五個氨基酸殘基酰胺基團的殘基酰胺基團的- -NHNH基形成基形成氫鍵。氫鍵。 - -螺旋有左旋和右螺旋有左旋和右旋兩種，右旋比左旋兩種，右旋比左旋更加穩(wěn)定，因此旋更加穩(wěn)定，因此也更常見。也更常見。影響影響 - -helixhelix不穩(wěn)定的因素：不穩(wěn)定的因素：a. 多肽鏈中連續(xù)存在帶相同電荷的氨基酸；多肽鏈中連續(xù)存在帶相同電荷的氨基酸；b.多肽鏈中有多肽鏈中有ProPro時，則時，則helix

10、helix中斷，產(chǎn)中斷，產(chǎn)生一個生一個“結(jié)節(jié)結(jié)節(jié)”；c. R R基團太大，造成空間阻礙作用。基團太大，造成空間阻礙作用。（2 2）折疊折疊( (pleatedpleated sheet) sheet)兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈通過兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈通過鏈間的氫鏈間的氫鍵鍵交聯(lián)而形成的；交聯(lián)而形成的；肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象，肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象，R R基團處于基團處于折折疊平面的兩側(cè)。疊平面的兩側(cè)。平行式平行式反平行式反平行式折疊中的折疊中的氫鍵與氫鍵與-螺螺旋中的氫鍵有旋中的氫鍵有何不同？何不同？（3 3）轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角（turnturn）或或迴迴 轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)（reverse

11、reverse turn turn）多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)180180的回折，這個回折角就是的回折，這個回折角就是 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)；它由四個它由四個AaAa殘基組成殘基組成; ;回折處的第一個回折處的第一個AaAa殘殘 基的基的 - -C=OC=O 和第四個和第四個 AaAa殘基的殘基的 N-HN-H 之間之間 形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)。形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)。（4 4）無規(guī)卷曲）無規(guī)卷曲（nonregularnonregular coil coil） 或自由回轉(zhuǎn)或自由回轉(zhuǎn)（random coil)random coil)沒有一定規(guī)律的松散的肽鏈結(jié)構(gòu)，通常沒有一

12、定規(guī)律的松散的肽鏈結(jié)構(gòu)，通常酶的活性中心酶的活性中心常處在這一構(gòu)象區(qū)域里。常處在這一構(gòu)象區(qū)域里。轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角折疊折疊 螺旋螺旋無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲4.4.超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域v 超二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)( (supersecondarysupersecondary structure) structure)： 是指若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼是指若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼 此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能 辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體。通常有辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體。通常有， ， 。v 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域（domaindomain） ：是在超二級結(jié)構(gòu)：是在超

13、二級結(jié)構(gòu) 基礎(chǔ)上進一步卷曲折疊成緊密的近似基礎(chǔ)上進一步卷曲折疊成緊密的近似 球狀的結(jié)構(gòu)，在空間上彼此分隔，各球狀的結(jié)構(gòu)，在空間上彼此分隔，各 自具有自具有部分生物功能部分生物功能的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)。 由由4 4個個組成的組成的/桶結(jié)構(gòu)域桶結(jié)構(gòu)域/桶結(jié)構(gòu)域：丙酮酸激酶桶結(jié)構(gòu)域：丙酮酸激酶 小的蛋白質(zhì)分子只有一個小的蛋白質(zhì)分子只有一個 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域 結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu) 大的蛋白質(zhì)分子有數(shù)個結(jié)大的蛋白質(zhì)分子有數(shù)個結(jié) 構(gòu)域構(gòu)域丙酮酸激酶己糖激酶前清蛋白肌紅蛋白免疫球蛋白5.5.三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)（Tertiary StructureTertiary Structure）在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈不同區(qū)

14、段的側(cè)在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈不同區(qū)段的側(cè)鏈基團相互作用，進一步盤繞、折疊形鏈基團相互作用，進一步盤繞、折疊形成的的空間結(jié)構(gòu)。成的的空間結(jié)構(gòu)。維系這種特定結(jié)構(gòu)的力主要有氫鍵、疏維系這種特定結(jié)構(gòu)的力主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力和二硫鍵、配水鍵、離子鍵、范德華力和二硫鍵、配位鍵等。位鍵等。肌紅蛋白肌紅蛋白輔基血紅素結(jié)構(gòu)圖輔基血紅素結(jié)構(gòu)圖多肽鏈多肽鏈疏水鍵疏水鍵氫鍵氫鍵二硫鍵二硫鍵離子鍵離子鍵CHCH2 2OHOH CHCH2 2OHOH范德華力范德華力維持三級結(jié)構(gòu)的作用力維持三級結(jié)構(gòu)的作用力6.6.四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)（Quaternary StructureQuaternary Structu

15、re）由兩條或兩條以上具有三級結(jié)構(gòu)的肽由兩條或兩條以上具有三級結(jié)構(gòu)的肽鏈聚合而成的特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子鏈聚合而成的特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子叫蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)；叫蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)；其中具有獨立三級結(jié)構(gòu)的一條肽鏈叫其中具有獨立三級結(jié)構(gòu)的一條肽鏈叫亞基亞基（subunit)subunit)，無生物功能；無生物功能；由幾個亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱由幾個亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱為寡聚蛋白。為寡聚蛋白。 4 4個亞基締合而成個亞基締合而成 2 2種亞基種亞基（、） 亞基呈亞基呈球形球形 亞基間靠亞基間靠次級鍵次級鍵連接連接 亞基兩兩相同，分別亞基兩兩相同，分別 為為1 1 、2 2、1 1、2 每個亞基都

16、含有一個每個亞基都含有一個 血紅素輔基血紅素輔基血紅蛋白血紅蛋白 氨基酸序列大氨基酸序列大 不相同，但結(jié)不相同，但結(jié) 構(gòu)構(gòu)（三級）（三級）相相 似，功能也相似，功能也相 似（載氧）似（載氧） 結(jié)構(gòu)決定功能結(jié)構(gòu)決定功能維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力v 一級結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵肽鍵、二硫鍵（都屬于共價鍵）（都屬于共價鍵）v 二級結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu)：氫鍵氫鍵（主鏈上（主鏈上C=OC=O和和N NH H之之 間形成）間形成）v 三、四級結(jié)構(gòu)：三、四級結(jié)構(gòu)：次級鍵次級鍵（氫鍵、疏水鍵、（氫鍵、疏水鍵、 離子鍵、范德華力、配位鍵）離子鍵、范德華力、配位鍵） 7.7.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

17、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系a.a.同源蛋白質(zhì)中氨基酸順序的種屬差異同源蛋白質(zhì)中氨基酸順序的種屬差異 同源蛋白質(zhì)同源蛋白質(zhì)（homologous proteinhomologous protein）：）：指指不同的有機體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)。不同的有機體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)。 例如：胰島素和細胞色素例如：胰島素和細胞色素C C（1 1）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系b.b.同種蛋白質(zhì)中氨基酸順序的個體差異（分子?。┩N蛋白質(zhì)中氨基酸順序的個體差異（分子?。?血紅蛋白的一級結(jié)構(gòu)變化引起鐮刀型貧血病血紅蛋白的一級結(jié)構(gòu)變化引起鐮刀型貧血病正常細胞正常細胞 鐮刀形細胞鐮刀形細

18、胞 血液中大量出現(xiàn)鐮刀血液中大量出現(xiàn)鐮刀 型紅細胞，患者因此型紅細胞，患者因此 缺氧窒息；缺氧窒息； 它是最早認識的一種它是最早認識的一種 分子病。流行于非洲，分子病。流行于非洲，死亡率極高，大部分患死亡率極高，大部分患者童年時就夭折者童年時就夭折,活過活過童年的壽命也不長，它童年的壽命也不長，它是由于遺傳基因突變導(dǎo)是由于遺傳基因突變導(dǎo)致血紅蛋白分子致血紅蛋白分子 結(jié)構(gòu)的突變。結(jié)構(gòu)的突變。w 正常型正常型鏈鏈 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys -w HbA 谷氨酸谷氨酸w 鐮刀型鐮刀型鏈鏈 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys -w HbS 纈氨酸纈

19、氨酸w 谷谷A A（極性）極性） 纈纈A A（非極性）非極性）w ( (了解了解) )由于纈氨酸上的非極性基團與相鄰非極性基團由于纈氨酸上的非極性基團與相鄰非極性基團 間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束 狀，整個狀，整個蛋白質(zhì)由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結(jié)合功能喪蛋白質(zhì)由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結(jié)合功能喪 失，失， 導(dǎo)致病人窒息甚至死亡，但病人可抗非洲瘧疾。導(dǎo)致病人窒息甚至死亡，但病人可抗非洲瘧疾。（2 2）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)構(gòu)象并不是固定不變的，有些蛋白蛋白質(zhì)構(gòu)象并不是固定不變的，有些蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能時，

20、構(gòu)象發(fā)生改變，從質(zhì)表現(xiàn)其生物功能時，構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變了整個分子的性質(zhì)，這種現(xiàn)象稱為而改變了整個分子的性質(zhì)，這種現(xiàn)象稱為別構(gòu)（變構(gòu)）現(xiàn)象別構(gòu)（變構(gòu)）現(xiàn)象。 別構(gòu)蛋白各部位之間的影響是通過構(gòu)象變別構(gòu)蛋白各部位之間的影響是通過構(gòu)象變化傳遞的，這種構(gòu)象變化可以從一個亞基化傳遞的，這種構(gòu)象變化可以從一個亞基傳到另一個亞基，引起傳到另一個亞基，引起協(xié)同的相互作用協(xié)同的相互作用。 以血紅蛋白的載以血紅蛋白的載O O2 2為例為例血中氧分子的運送：任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力環(huán)境氧低時HbHb 迅速釋放氧分子動脈環(huán)境氧高時HbHb 快速吸收氧分子( (R)R)松弛態(tài)松弛態(tài)(

21、(T) T) 緊張態(tài)緊張態(tài)靜脈釋放氧分子后HbHb 變回 T T 態(tài)肌肉肌肉肺肺六、蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)v蛋白質(zhì)由氨基酸組成，和氨基酸一樣，蛋白質(zhì)由氨基酸組成，和氨基酸一樣， 是兩性電解質(zhì)。是兩性電解質(zhì)。v可解離的基團有：可解離的基團有： 肽鏈末端的肽鏈末端的- -氨基和氨基和- -羧基；羧基； 側(cè)鏈基團側(cè)鏈基團1.1.蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點v蛋白質(zhì)在某一蛋白質(zhì)在某一pHpH時所帶的凈電荷為零，在時所帶的凈電荷為零，在電場中既不向陽極，也不向陰極移動，這電場中既不向陽極，也不向陰極移動，這一一pHpH稱為稱為蛋白質(zhì)的等電點（蛋白質(zhì)的等電點（pIpI)

22、)。v蛋白質(zhì)帶電的多少，帶電的符號與溶液的蛋白質(zhì)帶電的多少，帶電的符號與溶液的pHpH值有關(guān)。值有關(guān)。等電點與等離子點等電點與等離子點 中性鹽的存在常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的等電點發(fā)中性鹽的存在常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的等電點發(fā)生明顯的改變生明顯的改變 實際測得的等電點與介質(zhì)的離子組成有實際測得的等電點與介質(zhì)的離子組成有關(guān)關(guān) 在在不含任何鹽的純水不含任何鹽的純水中測得的等電點稱中測得的等電點稱為為蛋白質(zhì)的等離子點蛋白質(zhì)的等離子點，是蛋白質(zhì)的特征，是蛋白質(zhì)的特征常數(shù)常數(shù)vpIpI時，蛋白質(zhì)的時，蛋白質(zhì)的溶解度、粘度、滲透壓、導(dǎo)溶解度、粘度、滲透壓、導(dǎo)電能力及膨脹性電能力及膨脹性最小。最小。vpIpI的應(yīng)用：的應(yīng)用： 溶

23、解度最小溶解度最小分離提純蛋白質(zhì)（沉淀法）分離提純蛋白質(zhì)（沉淀法） 帶電性質(zhì)帶電性質(zhì)分離鑒定蛋白質(zhì)（電泳法）分離鑒定蛋白質(zhì)（電泳法）2.2.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)v蛋白質(zhì)是高分子化合物，在水溶液中形成蛋白質(zhì)是高分子化合物，在水溶液中形成的顆粒具有膠體溶液的特征如布朗運動、的顆粒具有膠體溶液的特征如布朗運動、丁達爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象丁達爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象, ,不能透過半透膜不能透過半透膜, ,并具有吸附能力。并具有吸附能力。v由于蛋白質(zhì)不能透過半透由于蛋白質(zhì)不能透過半透 膜，因此可用羊皮紙、玻膜，因此可用羊皮紙、玻 璃紙等將非蛋白的小分子璃紙等將非蛋白的小分子 雜質(zhì)除去雜質(zhì)除去（透析法）（透

24、析法）。 蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團，蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團， 形成形成水膜水膜（水化層）（水化層）； 同種蛋白質(zhì)帶有同種蛋白質(zhì)帶有同種同種電荷電荷，相互排斥。，相互排斥。v蛋白質(zhì)膠體溶液比較穩(wěn)定的原因是：蛋白質(zhì)膠體溶液比較穩(wěn)定的原因是：3.3.蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)的沉淀作用 蛋白質(zhì)在水中形成了穩(wěn)定的膠體，蛋白質(zhì)在水中形成了穩(wěn)定的膠體， 如果加入適當?shù)脑噭茐牧说叭绻尤脒m當?shù)脑噭?，破壞了?白質(zhì)的水膜（水化層）或中和了白質(zhì)的水膜（水化層）或中和了 蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)膠體溶蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)膠體溶 液就不穩(wěn)定而出現(xiàn)沉淀。液就不穩(wěn)定而出現(xiàn)沉淀。 蛋白質(zhì)的沉淀作用分類：分類

25、：可逆沉淀可逆沉淀：在沉淀過程中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)：在沉淀過程中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液。，可以重新溶解形成溶液。不可逆沉淀不可逆沉淀：在沉淀過程中，蛋白質(zhì)的結(jié)：在沉淀過程中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都發(fā)生了變化，沉淀不可能再重構(gòu)和性質(zhì)都發(fā)生了變化，沉淀不可能再重新溶解于水新溶解于水 加入中性鹽加入中性鹽 若在蛋白質(zhì)溶液中加入若在蛋白質(zhì)溶液中加入少量的少量的中性鹽，則蛋白中性鹽，則蛋白質(zhì)的溶解度會增加，這種現(xiàn)象叫質(zhì)的溶解度會增加，這種現(xiàn)象叫鹽溶鹽溶。 分子在其分子在其pIpI時，容易互相吸引，聚合沉淀；加入鹽離子時，容易

26、互相吸引，聚合沉淀；加入鹽離子會破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。會破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。3.3.蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)的沉淀作用 若在蛋白質(zhì)溶液中加入若在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的大量的中性鹽，使蛋白中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象叫質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象叫鹽析鹽析。（用于分離純化蛋白質(zhì)）（用于分離純化蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，當?shù)鞍踪|(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，當鹽鹽濃度高濃度高時，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相時，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合，形成沉淀。互結(jié)合，形成沉淀。加入有機溶劑加入有機溶劑 向蛋白質(zhì)溶液中加入有機溶

27、劑（如甲醇、乙向蛋白質(zhì)溶液中加入有機溶劑（如甲醇、乙醇、丙酮）會使蛋白質(zhì)沉淀，原因是：醇、丙酮）會使蛋白質(zhì)沉淀，原因是： 這些有機溶劑與水的親和力大于蛋白質(zhì)，這些有機溶劑與水的親和力大于蛋白質(zhì)，破壞了蛋白質(zhì)周圍的水膜；破壞了蛋白質(zhì)周圍的水膜； 有機溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶有機溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶液的極性減小，增加了蛋白質(zhì)之間的靜電吸液的極性減小，增加了蛋白質(zhì)之間的靜電吸引力，從而聚集沉淀。引力，從而聚集沉淀。加入重金屬加入重金屬 如如HgClHgCl2 2 、AgNOAgNO3 3 、Pb(AcPb(Ac) )2 2 、FeClFeCl3 3 等等與蛋白質(zhì)中帶負電荷的基團形成難溶鹽

28、與蛋白質(zhì)中帶負電荷的基團形成難溶鹽加入生物堿和某些酸類加入生物堿和某些酸類如：秋水仙堿，茶堿如：秋水仙堿，茶堿 如：鞣酸、單寧酸、苦味酸、三氯醋酸如：鞣酸、單寧酸、苦味酸、三氯醋酸與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團形成難溶鹽與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團形成難溶鹽 哪些沉淀為可逆沉淀？哪些沉淀為可逆沉淀？ 哪些沉淀為不可逆沉淀（變性沉淀哪些沉淀為不可逆沉淀（變性沉淀）4.4.蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性q天然蛋白質(zhì)受到理化因素的影響，分子天然蛋白質(zhì)受到理化因素的影響，分子內(nèi)部嚴格的空間結(jié)構(gòu)受到破壞，從而引內(nèi)部嚴格的空間結(jié)構(gòu)受到破壞，從而引起蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)發(fā)生起蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)

29、發(fā)生改變，但改變，但并不導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破并不導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破壞壞，這種現(xiàn)象稱為，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性作用蛋白質(zhì)變性作用。 q蛋白質(zhì)變性的因素有：蛋白質(zhì)變性的因素有：物理因素物理因素加熱（加熱（7070100100）、?。×艺袷幓驍嚢?、紫外線、烈振蕩或攪拌、紫外線、X X射線、超聲波射線、超聲波化學因素化學因素強酸、強堿、尿素、胍、強酸、強堿、尿素、胍、去污劑、甲醛、重金屬鹽、三氯醋酸、去污劑、甲醛、重金屬鹽、三氯醋酸、磷鎢酸、苦味酸、濃乙醇磷鎢酸、苦味酸、濃乙醇q蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)是：蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)是：維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的次級鍵被破壞；維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的次級鍵被破壞；蛋白質(zhì)

30、分子從有序卷曲結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序松散結(jié)蛋白質(zhì)分子從有序卷曲結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序松散結(jié)構(gòu)；構(gòu)；一級結(jié)構(gòu)沒有變化，分子量和分子組成不變。一級結(jié)構(gòu)沒有變化，分子量和分子組成不變。q變性蛋白的特征：變性蛋白的特征：生物活性喪失生物活性喪失（最主要）（最主要）；理化性質(zhì)改變理化性質(zhì)改變?nèi)芙舛认陆?，易沉淀、溶解度下降，易沉淀、結(jié)晶能力喪失、粘度增加、擴散速度下降結(jié)晶能力喪失、粘度增加、擴散速度下降等等; ;生化性質(zhì)改變生化性質(zhì)改變肽鏈松散、反應(yīng)基肽鏈松散、反應(yīng)基 團增加、易被蛋白酶水解。團增加、易被蛋白酶水解。q變性條件若不過于激烈，變性條件若不過于激烈，一旦條件去除，則變性蛋一旦條件去除，則變性蛋白恢復(fù)原來的構(gòu)象，這

31、種白恢復(fù)原來的構(gòu)象，這種現(xiàn)象叫作變性蛋白的現(xiàn)象叫作變性蛋白的復(fù)性復(fù)性作用作用(renaturation)。q隨隨變性時間的增加、變性變性時間的增加、變性條件的加劇及變性程度的條件的加劇及變性程度的加深加深，復(fù)性的可能性逐漸，復(fù)性的可能性逐漸降低降低核糖核酸酶核糖核酸酶A沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性，如鹽析沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性，如鹽析作用作用變性的蛋白質(zhì)也不一定沉淀，如牛變性的蛋白質(zhì)也不一定沉淀，如牛奶加熱沸騰奶加熱沸騰思考：蛋白質(zhì)變性與沉淀之間的關(guān)系5.5.蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)( (BiuretBiuret Reaction) Reaction) 雙縮脲在堿性溶液中與雙縮脲在堿性溶液中