第二節(jié)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定方法PPT課件

1、第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu) 的測定的測定 一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)定義一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)定義(primary structure) (primary structure) 在每種蛋白質(zhì)中氨基酸按照一定的數(shù)目和組成在每種蛋白質(zhì)中氨基酸按照一定的數(shù)目和組成進(jìn)行排列，并進(jìn)一步折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)前者我進(jìn)行排列，并進(jìn)一步折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)前者我們稱為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，也叫初級結(jié)構(gòu)或基本結(jié)們稱為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，也叫初級結(jié)構(gòu)或基本結(jié)構(gòu)。構(gòu)。核心：蛋白質(zhì)中共價連接的核心：蛋白質(zhì)中共價連接的氨基酸氨基酸殘基的排列順序殘基的排列順序, ,包包括二硫鍵的位置。括二硫鍵的位置。意義：是理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、

2、作用機(jī)制以及與其同源蛋意義：是理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制以及與其同源蛋白質(zhì)生理功能的必要基礎(chǔ)白質(zhì)生理功能的必要基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)序列測定的基本戰(zhàn)略和步驟蛋白質(zhì)序列測定的基本戰(zhàn)略和步驟l 對于一個純蛋白質(zhì)，理想方法是從對于一個純蛋白質(zhì)，理想方法是從N端直接測至端直接測至C端，端，但目前只能測但目前只能測60個個N端氨基酸。端氨基酸。 l l 蛋白質(zhì)化學(xué)家收集的一個蛋白質(zhì)資料庫（蛋白質(zhì)化學(xué)家收集的一個蛋白質(zhì)資料庫（database or databank）可以在）可以在Altas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff,M.O.ed. 1972-1978,Vo

3、ls 1-5, Washington,DC:National Biomedical Researsh Foundation)中找到。然而現(xiàn)在大多數(shù)蛋白質(zhì)序列中找到。然而現(xiàn)在大多數(shù)蛋白質(zhì)序列 信息都信息都是從基因核苷酸序列（經(jīng)過密碼子）翻譯成氨基酸序列的。是從基因核苷酸序列（經(jīng)過密碼子）翻譯成氨基酸序列的。l 由于克隆核苷酸序列比測定核苷酸序列更快、由于克隆核苷酸序列比測定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少電子數(shù)據(jù)庫問世，更有效、信息更多，因此有不少電子數(shù)據(jù)庫問世，儲存的序列資料以驚人的速度不斷擴(kuò)充，并且個儲存的序列資料以驚人的速度不斷擴(kuò)充，并且個人電腦可以方便利用。如果現(xiàn)在需要確定一

4、個新人電腦可以方便利用。如果現(xiàn)在需要確定一個新蛋白質(zhì)的序列，研究者所做的第一件事就是將新蛋白質(zhì)的序列，研究者所做的第一件事就是將新蛋白質(zhì)的序列與數(shù)據(jù)庫中的其它已知序列進(jìn)行比蛋白質(zhì)的序列與數(shù)據(jù)庫中的其它已知序列進(jìn)行比較，確定其中是否存在同源性。這些數(shù)據(jù)庫中比較，確定其中是否存在同源性。這些數(shù)據(jù)庫中比較有名的就是美國較有名的就是美國National Biomedical Researsh Foundation（國家生物醫(yī)學(xué)研究基金（國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會）主持的會）主持的PIR（Protein Information Resource，蛋白質(zhì)信息庫或，蛋白質(zhì)信息庫或Protein Identifi

5、cation Resouece 蛋白質(zhì)鑒定庫）蛋白質(zhì)鑒定庫）,美國美國政府支持的政府支持的Gene Bank Gene Sequence Data Bank（基因序列數(shù)據(jù)庫）（基因序列數(shù)據(jù)庫），還有歐洲的，還有歐洲的EMBL（European Molecular Biology Laboratory,歐歐洲分子生物學(xué)實驗室數(shù)據(jù)庫）。洲分子生物學(xué)實驗室數(shù)據(jù)庫）。l l PDB(Protein Data Bank):蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫l PDB 原來有由美國原來有由美國Brookhaven 國家實驗室負(fù)國家實驗室負(fù)責(zé)維護(hù)和管理，為適應(yīng)結(jié)構(gòu)基因組和生物信息學(xué)責(zé)維護(hù)和管理，為適應(yīng)結(jié)構(gòu)基因

6、組和生物信息學(xué)研究的需要，研究的需要，1998年由美國國家科學(xué)基金委員會、年由美國國家科學(xué)基金委員會、能源部和衛(wèi)生研究院資助，成立結(jié)構(gòu)生物學(xué)合作能源部和衛(wèi)生研究院資助，成立結(jié)構(gòu)生物學(xué)合作研究協(xié)會（研究協(xié)會（Research Collaboratory for Structure Bioinformatics,RCSB） PDB由由RCSB 管理。管理。l PDB是目前最主要的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫是目前最主要的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 二、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定方法二、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定方法l 研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)從確定組成蛋白質(zhì)的單元研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)從確定組成蛋白質(zhì)的單元結(jié)構(gòu)從結(jié)構(gòu)從氨基酸氨基

7、酸算起，已有算起，已有150150年的悠久歷史，直到年的悠久歷史，直到19551955年，年，SangerSanger首次闡明胰島素的氨基酸排列順首次闡明胰島素的氨基酸排列順序，為研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)開辟了道路。這在序，為研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)開辟了道路。這在分子生物學(xué)的發(fā)展進(jìn)程中是一個重要突破。分子生物學(xué)的發(fā)展進(jìn)程中是一個重要突破。l 目前關(guān)于核酸的一級結(jié)構(gòu)研究，由于目前關(guān)于核酸的一級結(jié)構(gòu)研究，由于SangerSanger等發(fā)等發(fā)明了加減法，可以得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。對比明了加減法，可以得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。對比之下，關(guān)于蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展不如核酸之下，關(guān)于蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展不如核

8、酸迅速。迅速。l 但隨著但隨著EdmanEdman液相自動順序分析儀和固相順序分析儀液相自動順序分析儀和固相順序分析儀以及氣相色譜、質(zhì)譜以及氣相色譜、質(zhì)譜(GC(GCMS)MS)等方法的相繼出現(xiàn)。等方法的相繼出現(xiàn)。使結(jié)構(gòu)分析的速度也顯著加快。至今已完成近千種使結(jié)構(gòu)分析的速度也顯著加快。至今已完成近千種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析。目前不僅樣品用量減少，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析。目前不僅樣品用量減少，而且工作人員也大大減少。而且工作人員也大大減少。l 當(dāng)年當(dāng)年SangerSanger分析胰島素用了整整十年的時間，今天分析胰島素用了整整十年的時間，今天運(yùn)用自動化儀器，分析一個分子量在運(yùn)用自動化儀器，分析一個分

9、子量在1010萬左右的蛋萬左右的蛋白質(zhì)只需要幾天，可見新技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展對科學(xué)白質(zhì)只需要幾天，可見新技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展對科學(xué)發(fā)展起的促進(jìn)作用，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定方法的綜發(fā)展起的促進(jìn)作用，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定方法的綜述及專著文獻(xiàn)較多。述及專著文獻(xiàn)較多。三三 測定前的準(zhǔn)備工作測定前的準(zhǔn)備工作：要求：要求：鑒定方法：鑒定方法： 估算氨基酸殘基數(shù)，確定肽估算氨基酸殘基數(shù)，確定肽鏈數(shù)鏈數(shù) 方法：方法： SDS-PAGESDS-PAGE，凝膠過，凝膠過濾法，沉降系數(shù)法濾法，沉降系數(shù)法及測定的一般步驟及測定的一般步驟蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)測定，概括起來包含多蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)測定，概括起來包含多肽鏈的分離、降解

10、、肽段的分離和順序分析以肽鏈的分離、降解、肽段的分離和順序分析以及及SS定位等。定位等。 l （1） 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。l （2） 拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。l （3） 斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。l （4） 分析多肽鏈的分析多肽鏈的N末端和末端和C末端。末端。 l （5） 測定多肽鏈的氨基酸組成。測定多肽鏈的氨基酸組成。l （6） 多肽鏈部分裂解成肽段。多肽鏈部分裂解成肽段。l （7） 測定各個肽段的氨基酸順序測定各個肽段的氨基酸順序l （8） 確定肽段在多肽鏈中的順序。確定肽段在多肽鏈中的順序。l （9） 確定多肽鏈中

11、二硫鍵的位置。確定多肽鏈中二硫鍵的位置。一級結(jié)構(gòu)的測定方法一級結(jié)構(gòu)的測定方法 1. 多肽鏈的分離多肽鏈的分離1）肽鏈的拆開）肽鏈的拆開 蛋白質(zhì)分子多肽鏈的連接有共價結(jié)合和非共蛋白質(zhì)分子多肽鏈的連接有共價結(jié)合和非共價結(jié)合兩種。要拆開以共價結(jié)合的價結(jié)合兩種。要拆開以共價結(jié)合的-S-S-連接的多連接的多肽鏈，采用的化學(xué)處理方法有：肽鏈，采用的化學(xué)處理方法有： 過甲酸氧化過甲酸氧化 巰基乙醇還原巰基乙醇還原 Clelands試劑的還原作用試劑的還原作用 穩(wěn)定穩(wěn)定SH基的方法：基的方法： （A） 烷基化試劑使烷基化試劑使SH基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的硫醚衍生物基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的硫醚衍生物 穩(wěn)定穩(wěn)定SH基的方法：基的方法

12、： （B）氨乙基化）氨乙基化 l非共價結(jié)合非共價結(jié)合l尿素，尿素， SDS-PAGE，鹽酸胍，鹽酸胍， 高濃度高濃度的鹽的鹽2）末端分析）末端分析 （1）N-末端測定末端測定 A. 二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB，DNFB) （1）N-末端測定末端測定 B.氰酸鹽法氰酸鹽法異硫氰酸苯酯（異硫氰酸苯酯（PTC或或PITC）與）與N末端的末端的氨基發(fā)生的反應(yīng)，生成氨基發(fā)生的反應(yīng)，生成PTC鈦鈦,在弱在弱酸中自發(fā)環(huán)化轉(zhuǎn)變成酸中自發(fā)環(huán)化轉(zhuǎn)變成PTH衍生物。該試衍生物。該試劑稱為劑稱為Edman試劑。試劑。 由于由于PTH衍生物從多肽鏈上脫落下來衍生物從多肽鏈上脫落下來對其余部分沒有影響，所以常用來

13、測定蛋對其余部分沒有影響，所以常用來測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。（1）N-末端測定末端測定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法 在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯氯DNS-Cl）可以與）可以與N-端氨基酸的游離氨基端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰作用，得到丹磺酰-肽。肽。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達(dá)到質(zhì)，檢測靈敏度可以達(dá)到1 10-9mol。l氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的的N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)端逐個

14、的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的動力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘末端殘基順序?；樞颉最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。末端的肽鍵速度最大。2）末端分析）末端分析（2）C-末端分析末端分析A.肼解法肼解法 無水肼無水肼NHNH2 2NHNH2 2 100 5-10h 100 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C

15、 C端游離氨基酸端游離氨基酸留在上清中。留在上清中。GlnGln（谷氨酰胺）、（谷氨酰胺）、AsnAsn（天冬酰胺）、（天冬酰胺）、CysCys（半胱氨酸）、（半胱氨酸）、ArgArg（精氨酸）不能產(chǎn)生游（精氨酸）不能產(chǎn)生游離的羧基末端離的羧基末端aaaa。（2）C-末端分析末端分析 B.羧肽酶水解法羧肽酶水解法 羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據(jù)酶解的專一性不同，可區(qū)分為羧肽酶據(jù)酶解的專一性不同，可區(qū)分為羧肽酶A、B和和C。應(yīng)用羧肽酶測定末端時，需要事先進(jìn)行酶的動力學(xué)應(yīng)用羧肽酶測定末端時，需要事先進(jìn)行酶的動力學(xué)實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應(yīng)時

16、間，使釋放實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應(yīng)時間，使釋放出的氨基酸主要是出的氨基酸主要是C末端氨基酸。末端氨基酸。 羧肽酶羧肽酶法測法測C C 末端末端羧肽酶羧肽酶A A： 除除ProPro、ArgArg（精氨酸）、（精氨酸）、LysLys（賴氨酸）外的所有（賴氨酸）外的所有C C端氨基酸端氨基酸羧肽酶羧肽酶B B：只水解：只水解ArgArg、LysLysC-C-末端分析末端分析C. C-C. C-端氨基酸選擇性氚標(biāo)記法：端氨基酸選擇性氚標(biāo)記法： 使用氚標(biāo)記是測定使用氚標(biāo)記是測定C-C-端氨基酸最好的辦法，端氨基酸最好的辦法，專一性強(qiáng)，靈敏度高，但是這種方法不能用于專一性強(qiáng)，靈敏度高，但是這種方

17、法不能用于C-C-端脯氨酸（端脯氨酸（ProPro）和天冬氨酸（）和天冬氨酸（AspAsp）還原法：利用硼氫化鋰將還原法：利用硼氫化鋰將C-C-端氨基酸還原成端氨基酸還原成氨基醇。然后堿多肽水解，用色譜法鑒定氨基醇。然后堿多肽水解，用色譜法鑒定氨基醇的類別。氨基醇的類別。 常用常用6 mol/L6 mol/L的鹽酸或的鹽酸或4 mol/L4 mol/L的硫酸（磺酸）在的硫酸（磺酸）在105-110105-110條件下進(jìn)行水解，反應(yīng)時間約條件下進(jìn)行水解，反應(yīng)時間約2020小時。近年來小時。近年來用用4 mol/L4 mol/L的甲基磺酸代替鹽酸，效果比較好，被廣泛應(yīng)的甲基磺酸代替鹽酸，效果比較好

18、，被廣泛應(yīng)用。用。此法的優(yōu)點(diǎn)是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。此法的優(yōu)點(diǎn)是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點(diǎn)是缺點(diǎn)是色氨酸色氨酸被沸酸完全破壞，被沸酸完全破壞，含有羥基的氨基酸如絲氨含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；酸或蘇氨酸有一小部分被分解；天門冬酰胺和谷氨酰胺天門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。鏈的酰胺基被水解成了羧基。-COO+3）氨基酸組成分析）氨基酸組成分析 一般用一般用5 mol/L5 mol/L氫氧化鈉于真空或充氮條件氫氧化鈉于真空或充氮條件下進(jìn)行，下進(jìn)行，1101100 0C C煮沸煮沸10-2010-20小時。小時。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程

19、度的由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化產(chǎn)物發(fā)生消旋化。該法的優(yōu)點(diǎn)是該法的優(yōu)點(diǎn)是色氨酸色氨酸在水解中不受破壞。在水解中不受破壞。胰蛋白酶胰蛋白酶 （賴氨酸）（賴氨酸）LysLysX X （精氨酸）（精氨酸）ArgArg X(X Pro) X(X Pro) 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 （糜蛋白酶）（糜蛋白酶） （酪氨酸）（酪氨酸）TyrTyrX X （色氨酸）（色氨酸）TrpTrpX X （苯丙氨酸）（苯丙氨酸）PhePheX (X Pro) X (X Pro) 嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶 X-LeuX-Leu（亮氨酸）（亮氨酸）

20、,Ile,Ile（異亮氨酸）（異亮氨酸）, Phe, Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）, , TrpTrp（色氨酸），（色氨酸），ValVal（纈氨酸）（纈氨酸）,Tyr,Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），MetMet（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）胃蛋白酶胃蛋白酶 PhePhe （苯丙氨酸）（苯丙氨酸） ，TrpTrp（色氨酸）（色氨酸）Tyr Tyr （酪氨酸），（酪氨酸），LeuLeu （亮氨酸）（亮氨酸）X X 不能水解不能水解ProPro羧基參與形成的肽鍵。羧基參與形成的肽鍵。GluGlu蛋白酶蛋白酶 GluGlu（谷氨酸）（谷氨酸）X XArgArg蛋白酶蛋白酶 ArgArg（精氨酸）（精氨酸）

21、X XLysLys蛋白酶蛋白酶 X XLysLys（賴氨酸）（賴氨酸）ProPro蛋白酶蛋白酶 ProProX X 氨基酸的分離和含量測定氨基酸的分離和含量測定氨基酸的顏色反應(yīng)：紫色在570nm比色茚三酮與Pro生成黃色產(chǎn)物，在440nm比色層析層析l基于不同物質(zhì)在流動相和固定相之間的分基于不同物質(zhì)在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同而將混合組分分離的技術(shù)。當(dāng)配系數(shù)不同而將混合組分分離的技術(shù)。當(dāng)流動相流動相(液體或氣體液體或氣體)流經(jīng)固定相流經(jīng)固定相(多孔的固多孔的固體或覆蓋在固體支持物上的液體體或覆蓋在固體支持物上的液體)時，各組時，各組分沿固定相移動的速度不同而分離。能用分沿固定相移動的速度

22、不同而分離。能用于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。 氨基酸的分離l 色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物以流動相對固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最終達(dá)到分離的效果。終達(dá)到分離的效果。l 色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之動相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會不同，這使其隨流動相

23、運(yùn)動速度各不間的分配會不同，這使其隨流動相運(yùn)動速度各不相同，隨著流動相的運(yùn)動，混合物中的不同組分相同，隨著流動相的運(yùn)動，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。根據(jù)物質(zhì)的分離機(jī)制，又在固定相上相互分離。根據(jù)物質(zhì)的分離機(jī)制，又可以分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、可以分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類別。凝膠色譜、親和色譜等類別。l 薄膜層析薄膜層析 將多肽鏈完全酸水解成游離氨基酸，將多肽鏈完全酸水解成游離氨基酸，然后進(jìn)行然后進(jìn)行Dansyl標(biāo)記，聚酰胺薄膜層析，標(biāo)記，聚酰胺薄膜層析，此方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中是一種超微量此方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中是一種超微量的分析術(shù)，但

24、此方法用于定量分析尚不夠的分析術(shù)，但此方法用于定量分析尚不夠準(zhǔn)確。準(zhǔn)確。 氨基酸自動分析儀就是利用氨基酸自動分析儀就是利用離子交換離子交換的的方法方法l離子交換色譜法：利用離子交換原理和液離子交換色譜法：利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法，利用被分離陰離子的一種分離分析方法，利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現(xiàn)分離。離子交換色譜主要是用來異來實現(xiàn)分離。離子交換色譜主要是用來分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛地應(yīng)用于無機(jī)離子

25、的分離，而且廣泛地應(yīng)地應(yīng)用于無機(jī)離子的分離，而且廣泛地應(yīng)用于有機(jī)和生物物質(zhì)，如氨基酸、核酸、用于有機(jī)和生物物質(zhì)，如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等的分離。蛋白質(zhì)等的分離。 氨基酸自動分析儀就是利用氨基酸自動分析儀就是利用離子交換離子交換的方法的方法 若要測定某蛋白質(zhì)樣品的氨基酸組成，事先若要測定某蛋白質(zhì)樣品的氨基酸組成，事先把樣品經(jīng)酸水解，調(diào)節(jié)水解液的把樣品經(jīng)酸水解，調(diào)節(jié)水解液的pHpH為為3 3，使所有的，使所有的氨基酸都帶負(fù)電荷，由于各種氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸都帶負(fù)電荷，由于各種氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的復(fù)雜性，各種復(fù)雜性，各種氨基酸所帶的電荷強(qiáng)度差異比較大氨基酸所帶的電荷強(qiáng)度差異比較大，pH3pH3時時,

26、,對于酸性氨基酸來說雖然也帶正電荷，但對于酸性氨基酸來說雖然也帶正電荷，但由于谷氨酸由于谷氨酸-羧基和天冬氨酸的羧基和天冬氨酸的-羧基，都有羧基，都有不同程度的離解，導(dǎo)致整個分子偏中性，對于堿不同程度的離解，導(dǎo)致整個分子偏中性，對于堿性氨基酸來說，本來結(jié)合質(zhì)子的能力就很強(qiáng)，此性氨基酸來說，本來結(jié)合質(zhì)子的能力就很強(qiáng)，此時，它所帶的正點(diǎn)荷強(qiáng)度就更大。時，它所帶的正點(diǎn)荷強(qiáng)度就更大。 酸水解破壞了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺酸水解破壞了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的谷氨酸和天冬氨酸。為了分離效果轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的谷氨酸和天冬氨酸。為了分離效果好，在洗脫過程中，使用不同好，在洗脫過程中，使用不同pHpH

27、和離子強(qiáng)度的洗和離子強(qiáng)度的洗脫液。經(jīng)氨基酸自動分析儀洗脫下來的氨基酸，脫液。經(jīng)氨基酸自動分析儀洗脫下來的氨基酸，按順序進(jìn)行染色，由記錄儀自動描繪出各種氨基按順序進(jìn)行染色，由記錄儀自動描繪出各種氨基酸的光吸收圖譜。酸的光吸收圖譜。3）氨基酸組成分析）氨基酸組成分析離子交換層析法離子交換層析法 l 離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現(xiàn)分離。離子交換色譜離子交換的能力差異來實現(xiàn)分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結(jié)構(gòu)中的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結(jié)構(gòu)中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的存在許多可

28、以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成離子離子會與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，并隨著流動相互爭奪固定相中的離子交換中心，并隨著流動相的運(yùn)動而運(yùn)動，最終實現(xiàn)分離。的運(yùn)動而運(yùn)動，最終實現(xiàn)分離。 各種氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)對于氨基酸與離子各種氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)對于氨基酸與離子交換樹脂，結(jié)合的情況有相當(dāng)復(fù)雜的影響。在氨基酸交換樹脂，結(jié)合的情況有相當(dāng)復(fù)雜的影響。在氨基

29、酸自動分析儀的記錄上可以看出：天冬氨酸（自動分析儀的記錄上可以看出：天冬氨酸（pIpI為為2.982.98）最先隨洗脫液下來，賴氨酸（最先隨洗脫液下來，賴氨酸（pIpI為為9.749.74）最后下來，）最后下來，三個中性氨基酸如三個中性氨基酸如: :甘氨酸（甘氨酸（pIpI為為5.975.97）、蘇氨酸）、蘇氨酸（pIpI為為6.536.53）和亮氨酸（）和亮氨酸（pIpI為為5.985.98）洗脫的順序又如）洗脫的順序又如何呢何呢? ? 蘇氨酸應(yīng)當(dāng)帶有較多的正電荷，與樹脂結(jié)合比蘇氨酸應(yīng)當(dāng)帶有較多的正電荷，與樹脂結(jié)合比較緊，不易被洗脫下來，但是由于羥基具有極性，減較緊，不易被洗脫下來，但是由于

30、羥基具有極性，減弱了樹脂對氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮弱了樹脂對氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脫下來。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸側(cè)氨酸后被洗脫下來。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸側(cè)鏈?zhǔn)杷詮?qiáng)，與樹脂結(jié)合緊，后甘氨酸被洗脫下來。鏈?zhǔn)杷詮?qiáng)，與樹脂結(jié)合緊，后甘氨酸被洗脫下來。 綜上所述：影響離子交換樹脂分離氨基酸的因綜上所述：影響離子交換樹脂分離氨基酸的因素：素： （1 1）氨基酸分子所帶的電荷；）氨基酸分子所帶的電荷； （2 2）氨基酸分子的極性；）氨基酸分子的極性； （3 3）氨基酸分子的形狀和大小。）氨基酸分子的形狀和大小。3 3 特殊氨基酸的測定特殊氨基酸的測定 巰基：

31、巰基： SH , Cys SH , Cys（半胱氨酸）（半胱氨酸） 特性：弱酸性特性：弱酸性 pKapKa=10.28=10.28；具有極強(qiáng)的還原性，兩個；具有極強(qiáng)的還原性，兩個半胱氨酸的巰基靠近脫氫形成二硫鍵。半胱氨酸的巰基靠近脫氫形成二硫鍵。 pKa(電離程度電離程度) 反應(yīng)：反應(yīng)： 與鹵代烴，如：芐氧、碘乙酰胺，反應(yīng)生成穩(wěn)與鹵代烴，如：芐氧、碘乙酰胺，反應(yīng)生成穩(wěn)定的烴基衍生物。該反應(yīng)常用于對巰基的保護(hù)。定的烴基衍生物。該反應(yīng)常用于對巰基的保護(hù)。 與各種金屬形成穩(wěn)定性不同的絡(luò)合物，該反應(yīng)與各種金屬形成穩(wěn)定性不同的絡(luò)合物，該反應(yīng)在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，制備蛋白質(zhì)晶體過程中具有重要作用。在研究蛋白質(zhì)

32、結(jié)構(gòu)，制備蛋白質(zhì)晶體過程中具有重要作用。 與某些重金屬生成不溶性的硫酸鹽，導(dǎo)致蛋白與某些重金屬生成不溶性的硫酸鹽，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。質(zhì)失活。 與硝基苯甲酸二硫化合物（與硝基苯甲酸二硫化合物（DTNBDTNB）反應(yīng)，生成）反應(yīng)，生成的產(chǎn)物在的產(chǎn)物在412 nm412 nm處有強(qiáng)烈的光吸收，應(yīng)用該反應(yīng)可以用比色處有強(qiáng)烈的光吸收，應(yīng)用該反應(yīng)可以用比色法測定半胱氨酸的含量。法測定半胱氨酸的含量。 在強(qiáng)氧化劑，如過氧甲酸的作用下，半胱氨酸在強(qiáng)氧化劑，如過氧甲酸的作用下，半胱氨酸的巰基和胱氨酸的二硫鍵都可被氧化生成磺基丙氨酸。的巰基和胱氨酸的二硫鍵都可被氧化生成磺基丙氨酸。 羥基：羥基：SerSer（絲氨酸

33、），（絲氨酸）， ThrThr（蘇氨酸），（蘇氨酸），OHOH 特性：在一般條件下，絲氨酸和蘇氨酸分子中的羥基特性：在一般條件下，絲氨酸和蘇氨酸分子中的羥基都不解離。都不解離。 反應(yīng)：反應(yīng)： 與酸作用生成酯，如絲氨酸磷酯，蛋白質(zhì)的與酸作用生成酯，如絲氨酸磷酯，蛋白質(zhì)的磷酸化絕大多數(shù)都發(fā)生在絲氨酸殘基上。磷酸化絕大多數(shù)都發(fā)生在絲氨酸殘基上。 許多種?；瘎┠軌蚺c酶活性中心的絲氨酸羥許多種?；瘎┠軌蚺c酶活性中心的絲氨酸羥基作用，導(dǎo)致酶失活?；饔?，導(dǎo)致酶失活。 酪氨酸的酚基可與酪氨酸的酚基可與FolinFolin反應(yīng)的基礎(chǔ)，可作反應(yīng)的基礎(chǔ)，可作為蛋白質(zhì)定量。為為蛋白質(zhì)定量。為MillonMillon

34、反應(yīng)的基礎(chǔ)。反應(yīng)的基礎(chǔ)。 咪唑基：咪唑基：HisHis（組氨酸）（組氨酸）, , 特性：在生理條件（特性：在生理條件（pH 7pH 7）下，組氨酸的咪唑基具有）下，組氨酸的咪唑基具有緩沖作用。這是因為咪唑基一側(cè)的去質(zhì)子化和另一側(cè)的質(zhì)子緩沖作用。這是因為咪唑基一側(cè)的去質(zhì)子化和另一側(cè)的質(zhì)子化作用同步進(jìn)行?；饔猛竭M(jìn)行。pH 6 pH 6 時，時， 5050質(zhì)子化，質(zhì)子化， pH 7pH 7時，時，9090去去質(zhì)子化。也就是說，在生理條件（質(zhì)子化。也就是說，在生理條件（pH 7pH 7）下，組氨酸的咪唑）下，組氨酸的咪唑基既可以作為質(zhì)子的受體，也可以作為質(zhì)子的供體。因此組基既可以作為質(zhì)子的受體，也

35、可以作為質(zhì)子的供體。因此組氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。 反應(yīng)：反應(yīng)：Pauly反應(yīng)（反應(yīng)（對氨基苯磺酸的重氮鹽對氨基苯磺酸的重氮鹽 ，紅色產(chǎn)物）胍基：胍基：ArgArg（精氨酸）（精氨酸） 特性特性: : 具有很強(qiáng)的堿性。具有很強(qiáng)的堿性。 反應(yīng)：與板口試劑（萘酚、次溴酸鹽）反應(yīng)生成紅色，反應(yīng)：與板口試劑（萘酚、次溴酸鹽）反應(yīng)生成紅色，該反應(yīng)是鑒定精氨酸存在的定性反應(yīng)。也可用于定量測定該反應(yīng)是鑒定精氨酸存在的定性反應(yīng)。也可用于定量測定甲硫基：甲硫基： MetMet（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）, , S SCHCH3 3 特性：甲硫氨基酸側(cè)鏈上的甲硫基是

36、一個強(qiáng)的親核中心，特性：甲硫氨基酸側(cè)鏈上的甲硫基是一個強(qiáng)的親核中心，容易與鹵代烷發(fā)生親核反應(yīng)，生成烷基化產(chǎn)物。該種產(chǎn)物容易與鹵代烷發(fā)生親核反應(yīng)，生成烷基化產(chǎn)物。該種產(chǎn)物用巰基試劑處理可以除去烷基和原有的甲基，因此與帶有用巰基試劑處理可以除去烷基和原有的甲基，因此與帶有1414C C標(biāo)記的碘甲烷反應(yīng)，再用巰基試劑處理能夠得到含有同標(biāo)記的碘甲烷反應(yīng)，再用巰基試劑處理能夠得到含有同位素位素1414C C標(biāo)記的甲硫氨酸。標(biāo)記的甲硫氨酸。2.多肽鏈的降解多肽鏈的降解1）化學(xué)法）化學(xué)法l溴化氫法 溴化氰溴化氰 l Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）X 溴化氫化學(xué)降解法其優(yōu)點(diǎn)：溴化氫化學(xué)降解法其優(yōu)點(diǎn)：一般蛋白質(zhì)

37、含甲硫氨酸較少，由此可獲得大片段一般蛋白質(zhì)含甲硫氨酸較少，由此可獲得大片段專一性強(qiáng)專一性強(qiáng)產(chǎn)率高達(dá)產(chǎn)率高達(dá)80%以上以上作用條件溫和，在室溫中用幾到十幾小時即可作用條件溫和，在室溫中用幾到十幾小時即可 1）化學(xué)法）化學(xué)法羥胺法 這種方法近十年來開始受人注意，羥胺能專一性地裂這種方法近十年來開始受人注意，羥胺能專一性地裂解解Asn（天冬酰胺）（天冬酰胺）-Glu（谷氨酸）的肽鍵，酸性條件下（谷氨酸）的肽鍵，酸性條件下裂解裂解Asn-Pro肽鍵。已用于某些蛋白質(zhì)的分析。肽鍵。已用于某些蛋白質(zhì)的分析。l Asn（天冬酰胺）（天冬酰胺）Leu（亮氨酸）（亮氨酸） Asn（天冬酰（天冬酰胺）胺）Ala（

38、丙氨酸）（丙氨酸） N-溴代琥珀酰亞胺法溴代琥珀酰亞胺法 主要裂解主要裂解Tyr（酪氨酸）處的肽鍵，五十年代研究較（酪氨酸）處的肽鍵，五十年代研究較多。但由于它也能斷裂多。但由于它也能斷裂Tyr（酪氨酸）（酪氨酸）His(組氨酸組氨酸)肽肽鍵，因此應(yīng)用不廣。鍵，因此應(yīng)用不廣。 l NTCB（2-硝基硝基-5-硫氰苯甲酸）硫氰苯甲酸）l XCys（半胱氨酸）（半胱氨酸）XCys（半胱氨酸）鍵的裂解：（半胱氨酸）鍵的裂解：l2硝基硝基5硫氰苯甲酸（硫氰苯甲酸（NTCB）和）和2甲基甲基N1苯磺酰苯磺酰 N4（溴乙酰）（溴乙酰）醌二亞酰胺（也稱醌二亞酰胺（也稱Cyssor，專切半胱氨酸），專切半胱氨

39、酸）l亞碘?；郊姿醽喌怩；郊姿?Trp（色氨酸）（色氨酸）X 產(chǎn)率產(chǎn)率70-100%1）化學(xué)法）化學(xué)法（2）部分酸水解法）部分酸水解法 Sanger在分析胰島素的一級結(jié)構(gòu)中采用了此在分析胰島素的一級結(jié)構(gòu)中采用了此法，即用法，即用0.1N鹽酸在鹽酸在110或用或用6N鹽酸在鹽酸在37水水解。這種部分酸水解的方法特異性不強(qiáng)，因此對解。這種部分酸水解的方法特異性不強(qiáng)，因此對大片段的蛋白質(zhì)和肽均不合適。大片段的蛋白質(zhì)和肽均不合適。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：專一性高，降解后的多肽容易純化，產(chǎn)率高，副作用小專一性高，降解后的多肽容易純化，產(chǎn)率高，副作用小。注意事項：注意事項： 適合酶作用的溫度和酸堿度（適合酶作用的

40、溫度和酸堿度（pHpH），反應(yīng)時間。），反應(yīng)時間。 酶的用量，待裂解蛋白質(zhì)的物理狀態(tài)。緩沖溶液的離子酶的用量，待裂解蛋白質(zhì)的物理狀態(tài)。緩沖溶液的離子強(qiáng)度等強(qiáng)度等酶裂解前需要作預(yù)備實驗，掌握好各種條件。酶裂解前需要作預(yù)備實驗，掌握好各種條件。2.多肽鏈的降解多肽鏈的降解 2）酶解法）酶解法NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1胰蛋白酶胰蛋白酶Trypsin ：R1=R1=賴氨酸賴氨酸LysLys和精和精氨酸氨酸ArgArg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。解速度快）。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1糜蛋白

41、酶糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin：（：（糜蛋糜蛋白酶白酶） 對疏水性氨基酸水解速對疏水性氨基酸水解速度比較快。度比較快。 R R1 1= =苯丙氨酸苯丙氨酸PhePhe, ,色氨色氨酸酸TrpTrp, ,酪氨酸酪氨酸Tyr; Tyr; 亮氨亮氨酸酸LeuLeu，蛋氨酸，蛋氨酸MetMet和組氨和組氨酸酸HisHis水解稍慢。水解稍慢。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1胃蛋白酶胃蛋白酶 水解專一性比較廣。水解專一性比較廣。Pepsin：R R1 1和和/ /或或R R2 2= =苯苯丙氨酸丙氨酸PhePhe, ,色氨酸色氨酸TrpTrp

42、, ,酪氨酸酪氨酸Tyr; Tyr; 亮氨酸亮氨酸LeuLeu以及其它疏水性氨基酸以及其它疏水性氨基酸水解速度較快水解速度較快NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶 中性金屬酶它的專一性取決于氨基參與形成的中性金屬酶它的專一性取決于氨基參與形成的肽鍵。肽鍵。 thermolysin：R R2 2= =苯丙氨酸苯丙氨酸PhePhe, ,色氨酸色氨酸TrpTrp, ,酪氨酪氨酸酸Tyr; Tyr; 亮氨酸亮氨酸LeuLeu，異亮氨酸，異亮氨酸IleuIleu, ,甲硫氨酸甲硫氨酸MetMet以及其它疏水性強(qiáng)的氨基酸水解速度較快。以及

43、其它疏水性強(qiáng)的氨基酸水解速度較快。l 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌Glu蛋白酶蛋白酶l GluX l 谷氨酸羧基端參與形成的肽鍵。谷氨酸羧基端參與形成的肽鍵。l 梭菌梭菌Arg蛋白酶蛋白酶 (clostripain) l ArgX l 精氨酸羧基端參與形成的肽鍵。精氨酸羧基端參與形成的肽鍵。l Lys蛋白酶蛋白酶 l XLys l 賴氨酸氨基端參與形成的肽鍵。賴氨酸氨基端參與形成的肽鍵。l 小羊腎小羊腎Pro蛋白酶蛋白酶 ProX 胰蛋白酶胰蛋白酶 （賴氨酸）（賴氨酸）LysX，（精氨酸），（精氨酸）Arg X(X Pro) 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 （糜蛋白酶）（糜蛋白酶） （酪氨酸）（酪氨

44、酸）TyrX ，（色氨酸），（色氨酸）TrpX （苯丙氨酸）（苯丙氨酸）PheX (X Pro) 嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶 X-Leu（亮氨酸）（亮氨酸）,Ile（異亮氨酸）（異亮氨酸）, Phe（苯（苯丙氨酸）丙氨酸）, Trp（色氨酸），（色氨酸），Val（纈氨酸）（纈氨酸）,Tyr（酪（酪氨酸），氨酸），Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）2）酶解法）酶解法胃蛋白酶胃蛋白酶 PhePhe （苯丙氨酸）（苯丙氨酸） ，TrpTrp（色氨酸）（色氨酸）Tyr Tyr （酪氨酸），（酪氨酸），LeuLeu （亮氨酸）（亮氨酸）X X 不能水不能水解解ProPro羧基參與形成的肽鍵。羧基參與形成的肽鍵

45、。GluGlu蛋白酶蛋白酶 GluGlu（谷氨酸）（谷氨酸）X XArgArg蛋白酶蛋白酶 ArgArg（精氨酸）（精氨酸）X XLysLys蛋白酶蛋白酶 X XLysLys（賴氨酸）（賴氨酸）ProPro蛋白酶蛋白酶 ProProX X氨基酸的修飾與保護(hù)氨基酸的修飾與保護(hù)（1）賴氨酸的修飾）賴氨酸的修飾胰蛋白酶胰蛋白酶2）酶解法）酶解法（1）賴氨酸的修飾）賴氨酸的修飾 蛋白質(zhì)中的賴氨酸，經(jīng)順丁烯?；饔煤?，被胰蛋白質(zhì)中的賴氨酸，經(jīng)順丁烯?；饔煤?，被胰蛋白酶水解蛋白酶水解 2）氨基酸的修飾與保護(hù)氨基酸的修飾與保護(hù)（2）精氨酸的修飾胰蛋白酶胰蛋白酶2）酶解法）酶解法（3）半胱氨酸的修飾 l肽鏈

46、的裂解和重組大致有三種情況：一種肽鏈的裂解和重組大致有三種情況：一種是非特異性裂解，如酸水解。由于裂解的是非特異性裂解，如酸水解。由于裂解的片段較小，造成分離的困難。因此這種非片段較小，造成分離的困難。因此這種非特異性裂解對大分子肽鏈?zhǔn)遣贿m用的。第特異性裂解對大分子肽鏈?zhǔn)遣贿m用的。第二種是特異性裂解，采用兩種以上的專一二種是特異性裂解，采用兩種以上的專一裂解，然后進(jìn)行組合，這種方法一般也適裂解，然后進(jìn)行組合，這種方法一般也適用于分子量小于用于分子量小于5萬的蛋白質(zhì)。第三種是逐萬的蛋白質(zhì)。第三種是逐步的專一裂解，首先將某種氨基酸進(jìn)行化步的專一裂解，首先將某種氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，使水解酶專一斷裂某

47、一種氨基酸，學(xué)修飾，使水解酶專一斷裂某一種氨基酸，分成若干片段，然后解除化學(xué)封閉，再用分成若干片段，然后解除化學(xué)封閉，再用此酶裂解，使曾被封閉過的氨基酸斷裂。此酶裂解，使曾被封閉過的氨基酸斷裂。目前傾向于采用這種裂解方式。目前傾向于采用這種裂解方式。 大部分肽段的分離主要通過大部分肽段的分離主要通過凝膠過濾法凝膠過濾法，由于大分子，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有機(jī)溶劑使之肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有機(jī)溶劑使之溶解。單用凝膠過濾法分離肽段一般純度不高，常需輔以溶解。單用凝膠過濾法分離肽段一般純度不高，常需輔以離子交換層析法離子交換層析法，大片段肽可用離子交換葡聚糖

48、作載體，大片段肽可用離子交換葡聚糖作載體，小肽則多用小肽則多用Dowex-50等樹脂。等樹脂。小肽分離還常采用高壓電泳與層析相結(jié)合的指紋圖譜法，得小肽分離還常采用高壓電泳與層析相結(jié)合的指紋圖譜法，得到純凈肽到純凈肽 3 3 肽段的分離和純度鑒定肽段的分離和純度鑒定凝膠過濾法凝膠過濾法l 凝膠過濾法又稱分子排阻法，凝膠過濾法又稱分子排阻法， 這是一種高效分離這是一種高效分離純化蛋白質(zhì)的方法。原理是不同的蛋白質(zhì)分子對純化蛋白質(zhì)的方法。原理是不同的蛋白質(zhì)分子對固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結(jié)固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結(jié)合能力。選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合能力。選擇與待

49、純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價鏈接。將這種有配基的載體裝入層析柱中，體共價鏈接。將這種有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時，該蛋當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其他蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在上，而其他蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫脫 離子交換層析離子交換層析l固定相是離子交換劑的層析分離技術(shù)。

50、樣固定相是離子交換劑的層析分離技術(shù)。樣品中待分離的溶質(zhì)離子，與固定相上所結(jié)品中待分離的溶質(zhì)離子，與固定相上所結(jié)合的離子交換，不同的溶質(zhì)離子與離子交合的離子交換，不同的溶質(zhì)離子與離子交換劑上離子化的基團(tuán)的親和力和結(jié)合條件換劑上離子化的基團(tuán)的親和力和結(jié)合條件不同，洗脫液流過時，樣品中的離子按結(jié)不同，洗脫液流過時，樣品中的離子按結(jié)合力的弱強(qiáng)先后洗脫。在生物化學(xué)和分子合力的弱強(qiáng)先后洗脫。在生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域此法常用于分離蛋白質(zhì)、核酸生物學(xué)領(lǐng)域此法常用于分離蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子。等生物大分子。 l 支持物是人工交聯(lián)的帶有能解離基團(tuán)的有機(jī)高分支持物是人工交聯(lián)的帶有能解離基團(tuán)的有機(jī)高分子，如離子交

51、換樹脂、離子交換纖維素、離子交子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團(tuán)的，如磺酸基（換凝膠等。帶陽離子基團(tuán)的，如磺酸基（SO3H）、羧甲基（）、羧甲基（CH2COOH）和磷酸基等）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團(tuán)的，如為陽離子交換劑。帶陰離子基團(tuán)的，如DEAE（二乙基胺乙基）和（二乙基胺乙基）和QAE（四級胺乙基）等為（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用于能在水中陰離子交換劑。離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物，包括有機(jī)物和無機(jī)物。對于蛋白解離的化合物，包括有機(jī)物和無機(jī)物。對于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的質(zhì)、核酸、氨基酸及核苷

52、酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團(tuán)在水溶液中解離后，能吸分辨力。離子交換基團(tuán)在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物的離子，各種物質(zhì)在離子交換劑引水中被分離物的離子，各種物質(zhì)在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數(shù)，態(tài)，各種離子有不同的交換常數(shù)，K值愈高，被值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強(qiáng)度，如改吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強(qiáng)度，如改變變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按脫過程中，按K值不同，分成不同的區(qū)帶。值不同，分成不同的區(qū)帶。 蛋

53、白質(zhì)分離純化（細(xì)分級）的方法都可以用。蛋白質(zhì)分離純化（細(xì)分級）的方法都可以用。對角線法：雙向電泳和雙向?qū)游?，第一相電泳后對角線法：雙向電泳和雙向?qū)游?，第一相電泳后不作任何處理進(jìn)行第二相電泳，得到對角線圖譜不作任何處理進(jìn)行第二相電泳，得到對角線圖譜說明肽段純度高。改良對角線技術(shù)可以確定二硫說明肽段純度高。改良對角線技術(shù)可以確定二硫鍵的存在。鍵的存在。高效液相色譜：目前已經(jīng)成為純化蛋高效液相色譜：目前已經(jīng)成為純化蛋白質(zhì)和多肽的有力工具。白質(zhì)和多肽的有力工具。層析和電泳層析和電泳游離末端鑒定游離末端鑒定純度鑒定：純度鑒定：4. 肽的順序分析肽的順序分析 1）化學(xué)法）化學(xué)法Edman降解法降解法 （一

54、）（一）EdmanEdman化學(xué)降解法：分析短肽最基本、最有效的方法化學(xué)降解法：分析短肽最基本、最有效的方法 EdmanEdman試劑：異硫氰酸苯酯（試劑：異硫氰酸苯酯（PITCPITC或或PTCPTC） 降解過程：降解過程： （1 1）耦聯(lián)反應(yīng)：）耦聯(lián)反應(yīng)： PITCPITC與肽段與肽段N N末端氨基酸的末端氨基酸的氨基氨基（游離）在堿性條件下發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)，生成（游離）在堿性條件下發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)，生成PTCPTC肽。肽。 （2 2）斷裂反應(yīng)：在強(qiáng)酸作用下，）斷裂反應(yīng)：在強(qiáng)酸作用下， 離離PTCPTC肽最近的氨肽肽最近的氨肽鍵斷裂，形成鍵斷裂，形成2 2苯胺苯胺5 5噻唑啉酮衍生物（噻唑啉酮衍生

55、物（PTZPTZ）, ,原來的原來的肽段少一個氨基酸殘基。肽段少一個氨基酸殘基。 （3 3）轉(zhuǎn)化（環(huán)化）：）轉(zhuǎn)化（環(huán)化）： PTZPTZ不穩(wěn)定，在酸性條件下，自發(fā)不穩(wěn)定，在酸性條件下，自發(fā)環(huán)化轉(zhuǎn)變成環(huán)化轉(zhuǎn)變成3 3苯基苯基2 2乙內(nèi)酰脲（乙內(nèi)酰脲（PTHPTHAAAA）。）。 利用Edman試劑降解一次最多可以測出多少殘基，關(guān)鍵在于，肽片段轉(zhuǎn)變?yōu)镻TC肽及隨后的Edman降解反應(yīng)的產(chǎn)率。一般來說，反應(yīng)產(chǎn)率逐漸降低。Edman化學(xué)降解的圖示耦聯(lián)斷裂轉(zhuǎn)化1）化學(xué)法）化學(xué)法Edman降解法降解法PTH氨基酸的鑒定改進(jìn)氨基酸的鑒定改進(jìn) A.1967年年Edman及及Begg介紹了一種介紹了一種Edma

56、n降解的液相自動分析裝置，使順序分析開始降解的液相自動分析裝置，使順序分析開始走向自動化。將樣品先在反應(yīng)杯內(nèi)旋轉(zhuǎn)成薄走向自動化。將樣品先在反應(yīng)杯內(nèi)旋轉(zhuǎn)成薄膜，使之固定。然后與膜，使之固定。然后與PITC試劑反應(yīng)。再試劑反應(yīng)。再用有機(jī)溶劑多次抽提除去過剩試劑，因而樣用有機(jī)溶劑多次抽提除去過剩試劑，因而樣品易丟失，且儀器昂貴，使用受到限制。品易丟失，且儀器昂貴，使用受到限制。 1）化學(xué)法）化學(xué)法Edman降解法降解法PTH氨基酸的鑒定改進(jìn)氨基酸的鑒定改進(jìn) B.1970年年Laursen改進(jìn)為固相氨基酸順序儀。此法改進(jìn)為固相氨基酸順序儀。此法樣品用量少，檢出靈敏，可分析超過樣品用量少，檢出靈敏，可分

57、析超過2000肽，其肽，其原理是將肽共價結(jié)合到惰性支持物上，固定后裝原理是將肽共價結(jié)合到惰性支持物上，固定后裝柱再行柱再行Edman降解。降解。 （二）（二）DNSDNSEdmanEdman序列分析法序列分析法 這是這是EdmanEdman降解的改良技術(shù)，此項技術(shù)將靈敏度降解的改良技術(shù)，此項技術(shù)將靈敏度高的高的DNSDNS分析法和能夠連續(xù)降解的分析法和能夠連續(xù)降解的EdmanEdman降解法結(jié)合起降解法結(jié)合起來。來。原理如（原理如（p 109p 109）所示。）所示。 用用DNSDNSClCl（丹磺酰氯）分析鑒定氨基酸的種類，用（丹磺酰氯）分析鑒定氨基酸的種類，用EdmanEdman試劑降解肽

58、段。試劑降解肽段。 DNSDNSAAAA帶有熒光，鑒定氨基酸的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)帶有熒光，鑒定氨基酸的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高于PTHPTHAA AA ，EdmanEdman試劑可以連續(xù)降解，而不破壞試劑可以連續(xù)降解，而不破壞肽段。肽段。 缺點(diǎn)是高溫，酸性條件下降解，色氨酸被破壞，谷缺點(diǎn)是高溫，酸性條件下降解，色氨酸被破壞，谷酰胺和天冬酰胺轉(zhuǎn)變成谷氨酸和天冬氨酸酰胺和天冬酰胺轉(zhuǎn)變成谷氨酸和天冬氨酸（三）減數(shù)（三）減數(shù)EdmanEdman序列分析法序列分析法 這也是這也是EdmanEdman降解的改良技術(shù)。降解的改良技術(shù)。 分析用分析用EdmanEdman試劑降解后肽段的氨基酸組成，每一試劑降解后肽段的氨基酸組

59、成，每一次丟失的氨基酸就是次丟失的氨基酸就是N N末端的氨基酸。末端的氨基酸。 優(yōu)點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、樣品需要量少。優(yōu)點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、樣品需要量少。 需要有氨基酸自動分析儀。需要有氨基酸自動分析儀。（四）（四）DABITC/PITCDABITC/PITC雙耦聯(lián)法雙耦聯(lián)法 DABITCDABITC（4 4N N，N N二甲氨基偶氮苯二甲氨基偶氮苯44異硫異硫氰酸苯酯）是改進(jìn)的氰酸苯酯）是改進(jìn)的EdmanEdman試劑。試劑。 N N末端的氨基酸從肽段末端的氨基酸從肽段上裂解下來后，生成的顏色明顯的上裂解下來后，生成的顏色明顯的DABITHDABITHAAAA。在聚酰。在聚酰胺薄膜上層析分離，鹽酸蒸汽

60、熏，顯示紅色斑點(diǎn)，雜質(zhì)胺薄膜上層析分離，鹽酸蒸汽熏，顯示紅色斑點(diǎn)，雜質(zhì)顯藍(lán)紫色。其原理與顯藍(lán)紫色。其原理與EdmanEdman降解法相同。降解法相同。（五）酶降解法進(jìn)行肽段序列分析（五）酶降解法進(jìn)行肽段序列分析1 1 氨肽酶法：氨肽酶法： 各種氨肽酶的專一性各種氨肽酶的專一性2 2 羧肽酶法：羧肽酶法： 3 3 二肽酶法：二肽酶法： 每次切下兩個氨基酸殘基，進(jìn)行分析測定。每次切下兩個氨基酸殘基，進(jìn)行分析測定。自動序列分析自動序列分析 蛋白質(zhì)序列儀蛋白質(zhì)序列儀 （一）液相序列儀：自旋式反應(yīng)器，使用微量樣品測定（一）液相序列儀：自旋式反應(yīng)器，使用微量樣品測定大片斷，不適于小肽片段。大片斷，不適于小