DB15∕T 2484-2021 胡蘿卜小孢子培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

1、 ICS 65.020.20CCS B0515內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T 24842021胡蘿卜小孢子培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程Technical code of practice for microspore culture of carrot2021-12-25發(fā)布2022-01-25實(shí)施 DB15/T 24842021前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。I DB15/T 24842021胡蘿卜小孢子培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程12范圍本文件規(guī)定了胡蘿卜小孢子培養(yǎng)技術(shù)的操作流程。本文件適用于胡蘿卜的小孢子培養(yǎng)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的

2、規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682NY/T 2306分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。小孢子 microspore高等植物生活史中雄配子體發(fā)育過程中短暫而重要的階段，是減數(shù)分裂后四分體釋放出的單倍性單細(xì)胞。小孢子培養(yǎng) microspore culture采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，把發(fā)育到一定階段的小孢子，通過無菌操作技術(shù)接種在人工培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成愈傷組織或胚狀體，進(jìn)而形成完整植株的一種培養(yǎng)方式。單倍

3、體 haploid體細(xì)胞中含有本物種配子染色體數(shù)目的個(gè)體。4試劑超純水應(yīng)符合GB/T 6682中規(guī)定的三級超純水。1 DB15/T 24842021藥品消毒試劑：乙醇，氯化汞。無機(jī)試劑：硝酸銨，硝酸鉀，硫酸銨，氯化鈣、硝酸鈣，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉，碘化鉀，硼酸，硫酸錳，硫酸鋅，鉬酸鈉，硫酸銅，氯化鈷，硫酸亞鐵，EDTA二鈉鹽。有機(jī)試劑：肌醇，煙酸，鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸，葉酸，生物素，谷氨酰胺，絲氨酸，谷胱甘肽。生長調(diào)節(jié)劑：2,4-D，6-BA。其他試劑：瓊脂，活性炭，蔗糖。所有藥品等級均為分析純。5儀器設(shè)備純水儀，萬分之一分析天平，pH計(jì)，移液槍，恒溫培養(yǎng)箱，電磁爐，超凈工

4、作臺，高壓滅菌鍋，離心機(jī)，光學(xué)顯微鏡。6培養(yǎng)基配制滅菌與分裝小孢子培養(yǎng)各階段使用商品化的B5、NLN、MS和1/2MS基本培養(yǎng)基，具體成分及含量見附錄A。按培養(yǎng)基說明書用量加入基本培養(yǎng)基、根據(jù)附錄A的用量加入除瓊脂外的其它成分，待培養(yǎng)基內(nèi)所有組分充分溶解后，調(diào)pH值至5.8，定容，按附錄A的用量加入瓊脂粉，分別制成分離培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。將配制好的培養(yǎng)基分裝至三角瓶中封口后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌應(yīng)符合NY/T 2306的規(guī)定。滅菌結(jié)束后，待培養(yǎng)基溫度降至5560時(shí)，在超凈工作臺中將分離培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基分裝至培養(yǎng)皿中、生根培養(yǎng)基分裝至三角瓶中，自然冷卻。7小

5、孢子培養(yǎng)技術(shù)流程采樣選擇生長勢好、無病蟲害的健壯植株，于晴天上午取開花后15 d25 d的花序。剝?nèi)』ㄋ帀浩⑹褂?%醋酸洋紅染色，鏡檢篩選花粉母細(xì)胞處于單核期的花序。外植體消毒將花序用自來水沖洗10 min，用剪刀將小花依次剪下，置于燒杯中，在超凈工作臺中依次用75 %乙醇50 s、0.1 %氯化汞4 min消毒、無菌水沖洗6次，瀝干水分。小孢子分離將消毒后的小花轉(zhuǎn)入無菌研缽，加入1倍體積的分離培養(yǎng)基，用研棒輕研，液體經(jīng)400目篩過濾至10mL離心管中，700 r/min離心3 min，去上清液，沉淀用1 mL分離培養(yǎng)基懸浮。重復(fù)上述步驟2次后，將懸浮液加入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將小孢子濃度調(diào)至

6、1×10個(gè)·mL。吸取2 ml移入固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。5 -1誘導(dǎo)胚狀體2 DB15/T 24842021將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中33下暗培養(yǎng)2 d，然后25下暗培養(yǎng)50 d120 d至胚狀體產(chǎn)生。胚狀體分化當(dāng)小孢子分化出胚狀體時(shí)，將胚狀體接種于分化培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500 lx，16 h·d，溫度26。培養(yǎng)30 d左右可以形成小苗。-1誘導(dǎo)生根選取生長健壯的離體再生苗移植到生根培養(yǎng)基上，每個(gè)三角瓶中放置23株。將培養(yǎng)瓶放至培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500 lx，16 h·d，溫度26，培養(yǎng)2至4周直至小苗生出完整根系

7、。-1煉苗與移栽將培養(yǎng)瓶放置于日光溫室中，打開瓶蓋，加水至培養(yǎng)基上1 cm，煉苗3 d，然后將根部培養(yǎng)基清洗干凈，栽種于裝有消毒育苗基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，澆水后用塑料袋覆蓋保濕，7 d后取掉塑料袋。溫度白天控制在25±3，夜晚12±3。8倍性鑒定取幼苗根尖，采用根尖壓片法進(jìn)行壓片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目，當(dāng)再生植株染色體數(shù)目為9條時(shí)，證明該植株為單倍體。3 DB15/T 24842021AA附錄 A（資料性）培養(yǎng)基成分及用量A.1商品基本培養(yǎng)基成分用量見表A.1。表A.1商品基本培養(yǎng)基成分及用量表單位為毫克每升分離培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基NLN1250分化培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基1/2MS95

8、08250培養(yǎng)基成分B5MS190016500KNO32500NH4NO30(NH4)2SO4CaCl2·2H2OCa(NO3)2·4H2OMgSO41340150044002200050061.041250122.09180170090KH2PO4085NaH2PO4130.440MnSO4·H2OH3BO31018.941022.36.28.60.250.0250.0250.8327.837.31000.10.50.5222.36.28.60.250.0250.0250.8327.837.31000.10.50.5232ZnSO4·7H2ONa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2OKI100.250.0250.0250.7527.837.3100100.250.0250.0250FeSO4·7H2ONa2EDTA·2H2O肌醇27.837.31000.50.55鹽酸硫胺素鹽酸吡哆醇煙酸11甘氨酸02葉酸00.50.058001003000生物素000L-谷氨酰胺L-絲氨酸谷胱甘肽0000000004 DB15/T 24842021