蛋白質結構的研究技術

1、蛋白質結構的研究技術小組成員：王鵬、任楠楠、陳瑤、占希、宮婷婷主講人：xx蛋白質結構的研究技術 1.X射線單晶衍射分析技術 2.核磁共振技術 3.蛋白質的二維結晶及三維重構技術 4.蛋白質溶液構象的光譜技術 5.掃描探針顯微鏡技術 6.交聯(lián)質譜技術 7.分子模擬技術X射線單晶衍射技術的原理 當一束X射線照射到晶體上時，X射線在晶體中產生衍射現象。晶體所產生的衍射花樣都反映出晶體內部的原子分布規(guī)律。 若用照相法收集衍射線，則可使膠片感光，留下相應若用照相法收集衍射線，則可使膠片感光，留下相應的衍射花樣的衍射花樣( (衍射光斑、衍射光環(huán)或衍射線條衍射光斑、衍射光環(huán)或衍射線條) ) 。 X射線晶體衍

2、射分析（Xray Crystallography）主要包括以下五個步驟： 1）晶體培養(yǎng) 2）數據收集和處理 3）測定相位 4）電子密度圖的計算和解釋 5）結構模型修正 1）晶體培養(yǎng)。 結構測定的精度依賴于晶體所能達到的衍射分辨率，所以獲得具有強衍射能力的晶體是蛋白質晶體結構測定分析的關鍵步驟，是蛋白質晶體結構分析的瓶頸。 2）數據收集和處理 一般來講，中等大小晶胞的一套高分辨率數據，至少要收集幾萬個衍射強度數據，再經過專門的數據處理程序包處理，給出這一套數據的各種統(tǒng)計結果，以判斷數據質量的好壞。 3）電子密度圖的計算和解釋 有了每個衍射點的相位，加上已經收集到的每個衍射點的結構振幅，就可計算電

3、子密度圖。由于蛋白質分子結構的復雜性，它的電子密度圖隨著分辨率的不同，從圖上能識別出的結構層次也不同。 4）結構模型修正 從電子密度圖上最初建立的蛋白質分子結構模型是比較粗糙的，需要進一步精華。 英國生物化學家肯德魯（英國生物化學家肯德魯（John Cowdery Kendrew）和佩）和佩魯茲（魯茲（Max Ferdinand Perutz），用），用X-射線衍射分析法研射線衍射分析法研究血紅蛋白和肌紅蛋白，而且共同研究究血紅蛋白和肌紅蛋白，而且共同研究X-射線衍射晶體照射線衍射晶體照相術，以及蛋白質和核酸的結構與功能。相術，以及蛋白質和核酸的結構與功能。 1960年，他們把一些蛋白質分子和

4、衍射年，他們把一些蛋白質分子和衍射X-射線效率特別射線效率特別高的大質量原子（如金或汞的原子）結合起來，首次精確高的大質量原子（如金或汞的原子）結合起來，首次精確地測定了蛋白質晶體的結構?？系卖敽团弭敶姆窒砹说販y定了蛋白質晶體的結構?？系卖敽团弭敶姆窒砹?962年的諾貝爾化學獎。年的諾貝爾化學獎。 萊納斯萊納斯.鮑林（鮑林（Linus Carl Pauling）將）將X-射線衍射晶體結射線衍射晶體結構測試的方法引入到蛋白質結構測定中，并且推導了經衍構測試的方法引入到蛋白質結構測定中，并且推導了經衍射圖譜計算蛋白質中重原子坐標的公式。至今，通過蛋白射圖譜計算蛋白質中重原子坐標的公式。至今，通過蛋

5、白質結晶進行質結晶進行X-射線衍射實驗仍然是測定蛋白質三級結構的射線衍射實驗仍然是測定蛋白質三級結構的主要方法，人類已知結構的絕大部分蛋白質都是經由這種主要方法，人類已知結構的絕大部分蛋白質都是經由這種方法測定獲得的。方法測定獲得的。 結合血紅蛋白的晶體衍射圖譜，鮑林提出蛋白質中的肽結合血紅蛋白的晶體衍射圖譜，鮑林提出蛋白質中的肽鏈在空間中是呈螺旋形排列的，這是最早的鏈在空間中是呈螺旋形排列的，這是最早的螺旋結構模螺旋結構模型。型。 2000年，美國科學家阿格雷（年，美國科學家阿格雷（Peter Agre）與其他研究人）與其他研究人員應用場發(fā)射電子源的電子衍射方法得到分辨率為員應用場發(fā)射電子源

6、的電子衍射方法得到分辨率為3.8埃埃的的AQPl 水通道電子密度圖，發(fā)現了一種被稱為水通道蛋水通道電子密度圖，發(fā)現了一種被稱為水通道蛋白的細胞膜蛋白就是人們尋找已久的水通道，并公布了世白的細胞膜蛋白就是人們尋找已久的水通道，并公布了世界第一張水通道蛋白的高清晰度立體照片。界第一張水通道蛋白的高清晰度立體照片。 阿格雷和麥金農因為對膜蛋白分子和離子通道開創(chuàng)性的阿格雷和麥金農因為對膜蛋白分子和離子通道開創(chuàng)性的研究，而共同分享了研究，而共同分享了2003 年的諾貝爾化學獎。年的諾貝爾化學獎。核磁共振技術 核磁矩不為零的核在外磁場的作用下，核自旋能級發(fā)生塞曼分裂，共振吸收某一特定頻率的射頻（RF）輻射

7、，這一物理過程就是核磁共振。 滿足共振條件可以有兩種方法滿足共振條件可以有兩種方法一是固定電磁波的頻率而逐漸改變外加磁場，稱為掃場掃場另一種是固定磁場而改變電磁波的頻率，稱為掃頻掃頻。目前應用最廣的是脈沖傅立葉變換的核磁共振技術。即應用一個短時間方波脈沖激發(fā)樣品，這種方波中包含各種不同的頻率在內，因此樣品中不同的核可在同一時間內都得到激發(fā)。但是脈沖過后得到的是指數衰減的時域函數，借助Fourier變換的數學方法把時域函數轉換成頻域函數，這時就能見到已經產生的若干共振峰，這種變化過程可以由計算機自動完成。 一維核磁共振只能測定小分子的結構如氨基酸，要測定大分子物質就需要利用二維核磁共振以及多維核

8、磁共振。 一維核磁共振是在一個脈沖之后的t1時間進行數據收集 二維核磁共振在t1時間后再加一個脈沖后在t2時間內收集數據S（t1，t2），然后分別以t2和t1為變量進行傅立葉變換就得到二維譜S（w1，w2）。二維譜就是把作為對角線的一維譜的峰進一步分開。 核磁共振應用于測定蛋白質三維結構 950年，Proctor等人研究發(fā)現：質子的共振頻率與其結構（化學環(huán)境）有關。在高分辨率下，吸收峰產生化學位移和裂分，由有機化合物的核磁共振圖，可獲得質子所處化學環(huán)境的信息，進一步確定化合物結構 1971 年，比利時科學家J. Jeener 提出二維核磁共振的概念 1985年，Kurt Wthrich在此基礎

9、上發(fā)明了一種新的方法，他選擇生物大分子中的質子(氫原子核)作為測量對象，連續(xù)測定所有相鄰的兩個質子之間的距離和方位，這些數據經計算機處理后就可形成生物大分子的三維結構圖 核磁共振技術的優(yōu)點優(yōu)點：具有高分辨率，僅次于X- 射線晶體學技術，可以在溶液中操作，在近似蛋白質生理環(huán)境下測定其結構，甚至可以對活細胞中的蛋白質進行分析，獲得“活”的蛋白質結構。缺點缺點：所能測定的樣品的分子量要比較小，一般在50KD以下。另外核磁共振衍射技術的反應體系是溶液，這對不溶的蛋白比較困難，如膜蛋白，只有用去垢劑才能溶解，這就使研究復雜化。在核磁共振衍射的觀察中，去垢劑會造成很大的噪音和假相。實驗周期較長，采用核磁共

10、振方法尋找蛋白質結構較為耗費人力及時間，尤其是圖譜分析工作極為困難和費時。 蛋白質三維電鏡重構技術 在電鏡下觀察生物大分子時，觀察的對象是三維結構，電鏡圖像是這些三維結構的二維投影。由生物結構的二維電鏡圖像推知其三維結構的方法稱為三維電鏡方法 三維電鏡技術的新進展：冷凍電子顯微鏡技術 冷凍電鏡三維重構是結構生物學研究中的一種較新的技術。它的基本技術路線為：利用快速冷凍技術對樣品進行冷凍固定，然后利用冷凍電鏡和低劑量成像技術對樣品進行電子成像，利用高靈敏底片進行成像記錄，利用高分辨率掃描儀對底片進行數字化，對數字化的圖像進行二維圖像分析選點、分類、校正和平均，最后完成樣品的三維重構計算。 相對于

11、其他兩種成熟的結構生物學研究手段X射線晶體學和核磁共振技術,主要有以下一些優(yōu)勢： 1）可以直接獲得分子的形貌信息，即使在較低分辨率下，電子顯微學也可給出有意義的結構信息； 2）適于解析那些不適合應用X射線晶體學和核磁共振技術進行分析的樣品，如難以結晶的膜蛋白，大分子復合體等； 3）適于捕捉動態(tài)結構變化信息； 4）易同其他技術相結合得到分子復合體的高分辨率的結構信息； 5）電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上要比X射線晶體學直接和方便。 三維電鏡重構技術的缺點： 由于生物樣品易受輻照損傷、圖像襯度低、信噪比低的特點，它對生物大分子的高分辨率結構解析非常困難。蟑螂濃核病毒通過冷凍電子顯微鏡技術

12、進行的病毒 衣殼空間結構的三維重構分析蛋白質溶液構象的光譜技術1.同步輻射圓二色光譜（SRCD）研究蛋白質結構 采用同步輻射光源，可以將測定波長低至160nm，從而提供低波長的信息。而且，SRCD的真空紫外輻射不破壞蛋白質短的整體性，并且有高的信噪比，更快的測量等特點，在高濃度緩沖液和其它吸附成分存在時仍可以完成樣品的檢測。2.紫外共振拉曼光譜和二維相關紅外光譜 共振拉曼光譜是在吸收區(qū)選擇激發(fā)樣品，在紫外區(qū)選擇激發(fā)蛋白質分子的不同區(qū)域，開展蛋白質結構的研究工作，很大程度地提高了拉曼散射截面，排除了熒光干擾，使光譜的信噪比顯著提高。 二維相關紅外光譜作為一種新的分析技術被用來分析蛋白質的酰胺、帶

13、。此技術非常有用，因為二維相關紅外光譜能夠按不同的二級結構將酰胺帶去卷積成各成分帶；能夠給予一個擾動，通過選擇性的相關峰，將不同的二級結構關聯(lián)；能夠提供各種環(huán)境下，二級結構變化和氨基酸殘基變化的特有規(guī)律。掃描探針顯微鏡（SPM）技術 SPM家族通常分為掃描隧道顯微鏡（STM）和原子力顯微鏡(AFM)兩大類。其成像及工作原理分別是檢測針尖和樣品之間的隧穿電流和相互作用力。 SPM具有很高的空間分辨率，可以原位實時成像，并且可以在一定條件下成原子級像。蛋白質分子由于必須依靠一定的媒介環(huán)境才能保持其生物活性和化學活性，因而蛋白質的成像通常是在特定的緩沖液中例如用AFM納米嫁接的方法，在添加了三氟乙醇的緩沖溶液中，將鐵硫金屬蛋白修飾到已經組裝了硫醇的金電極上（如圖），圖中可以明顯的看出最高的蛋白質分子，次高的硫醇自組裝膜區(qū)域以及金基底。納米嫁接的蛋白質AFM三維形貌圖交聯(lián)質譜技術（CXMS） 核磁共振技術、X射線晶體衍射技術等，對于蛋白質的純度、結晶性和絕對量均有比較高的要求，限制了其廣泛應用，交聯(lián)質譜技術是近十年來發(fā)展起來的新技術，它將質譜技術與交聯(lián)技術相結合，在研究