實(shí)驗(yàn)二超氧化物歧化酶的活性測(cè)定

1、超氧化物歧化酶的活性測(cè)定 酶工程實(shí)驗(yàn)二酶工程實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)背景實(shí)驗(yàn)背景按按金屬輔基成分的不同可分成金屬輔基成分的不同可分成3種類型種類型 ： 銅鋅金屬輔基(CuZn-SOD) 藍(lán)綠色 存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi) 以及線粒體膜間隙 錳離子(Mn-SOD) 粉紅色 存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞中，以及植物的葉綠體基質(zhì)和 類囊體膜上 Fe-S0D 黃色或黃褐色 存在于原核細(xì)胞中，近來(lái)發(fā)現(xiàn)有一些真核藻類甚至某些高等植物中 也有存在。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理SOD的活力測(cè)定方法 : 化學(xué)法:黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，N BT-還原法，光化學(xué)擴(kuò)增法，Cy

2、te還原法等 免疫法 等電點(diǎn)聚焦法 本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法鄰苯三酚自氧化法 鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應(yīng)開始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。這里測(cè)定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長(zhǎng)出有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過計(jì)算即可求出SOD的酶活性。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理酶活力單位定義： 在25恒溫條件

3、下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。試劑和器材試劑和器材1、試劑（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 稱取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用雙蒸水溶解至80mL左右， 用HCl調(diào)節(jié)pH =8.20（用pH計(jì)校正），最后定容至100mL。（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L鄰苯三酚 稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。（4）SOD樣液試劑和器材試劑和器材1、試劑（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 稱取Tris 0.61g，EDT

4、A-2Na 0.037g，用雙蒸水溶解至80mL左右， 用HCl調(diào)節(jié)pH =8.20（用pH計(jì)校正），最后定容至100mL。（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L鄰苯三酚 稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。（4）SOD樣液試劑和器材試劑和器材2、器材（1）恒溫水浴槽（2）紫外分光光度計(jì)（3）試管、刻度吸管、微量注射器方法和步驟方法和步驟 1、鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定 取兩支試管按下表加入25預(yù)熱過的緩沖液,然后加入預(yù)熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚 ），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325n

5、m波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。 方法和步驟方法和步驟 試劑空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.020.0150 mmol/L鄰苯三酚-0.01方法和步驟方法和步驟 2、SOD樣液的活性測(cè)定 樣品管取代自氧化管。樣品管測(cè)定時(shí)先加入預(yù)熱的待測(cè)酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定。方法和步驟方法和步驟 試劑空白管（mL）樣品管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.02-SOD樣液-0.015