第九章 原生質(zhì)體育種

1、 原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種 微生物原生質(zhì)體融合育種微生物原生質(zhì)體融合育種 細菌原生質(zhì)體融合育種細菌原生質(zhì)體融合育種 放線菌原生質(zhì)體融合育種放線菌原生質(zhì)體融合育種 酵母菌原生質(zhì)體融合育種酵母菌原生質(zhì)體融合育種 霉菌原生質(zhì)體融合育種霉菌原生質(zhì)體融合育種第一節(jié)第一節(jié) 原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體具有的新特性：原生質(zhì)體具有的新特性：1 1、對誘變劑敏感、對誘變劑敏感2 2、對噬菌體不敏感、對噬菌體不敏感3 3、不受感受態(tài)影響、不受感受態(tài)影響什么是原生質(zhì)體？什么是原生質(zhì)體？包括：原生質(zhì)體再生育種，原生質(zhì)體誘變育種，原包括：原生質(zhì)體再生育種，原生質(zhì)體誘變育種，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種，原生質(zhì)體融合育種及其他原

2、生質(zhì)生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種，原生質(zhì)體融合育種及其他原生質(zhì)體育種。體育種。一、微生物一、微生物原生質(zhì)體再生育種原生質(zhì)體再生育種 1 1原生質(zhì)體再生育種的一般程序原生質(zhì)體再生育種的一般程序 ：出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇菌種活化和預培養(yǎng)菌種活化和預培養(yǎng)原生質(zhì)體原生質(zhì)體制備制備原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體再生高產(chǎn)菌株分高產(chǎn)菌株分離離（初篩）（初篩）復篩復篩遺傳穩(wěn)定性鑒定遺傳穩(wěn)定性鑒定菌種特性及發(fā)酵特菌種特性及發(fā)酵特性研究。性研究。2 2原生質(zhì)體再生育種實例原生質(zhì)體再生育種實例 小單孢菌福小單孢菌福堤堤霉素霉素微生物制備原微生物制備原生質(zhì)體后直接生質(zhì)體后直接再生，從再生再生，從再生菌落中分離篩菌落中分離篩選變異菌株，

3、選變異菌株，最終得到優(yōu)良最終得到優(yōu)良性狀提高的正性狀提高的正突變株。突變株。 敏感，細胞壁的重建敏感，細胞壁的重建和分裂能力的再生，和分裂能力的再生，對數(shù)期細胞，不需要對數(shù)期細胞，不需要遺傳標記遺傳標記二、微生物原生質(zhì)體誘變育種二、微生物原生質(zhì)體誘變育種 （一）原生質(zhì)體誘變育種方法（一）原生質(zhì)體誘變育種方法1 1物理誘變劑誘變原生質(zhì)體的一般程序：物理誘變劑誘變原生質(zhì)體的一般程序： 取取10 ml10 ml對數(shù)生長期微生物培養(yǎng)物，離心收集菌體，對數(shù)生長期微生物培養(yǎng)物，離心收集菌體，無菌無菌水水洗洗滌滌離心，菌體離心，菌體沉沉淀物用酶液懸浮，水解去壁制淀物用酶液懸浮，水解去壁制成原生質(zhì)體成原生質(zhì)體

4、離離心，高滲溶液洗滌原生質(zhì)體心，高滲溶液洗滌原生質(zhì)體原生質(zhì)體懸原生質(zhì)體懸浮液稀釋至一定密度，取適量放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)浮液稀釋至一定密度，取適量放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)將培養(yǎng)將培養(yǎng)皿移至紫外燈下誘變處理皿移至紫外燈下誘變處理置暗處后處理一定時間置暗處后處理一定時間移入移入再生培養(yǎng)基中再生培養(yǎng)（由再生培養(yǎng)基中再生培養(yǎng)（由于于原生質(zhì)體較脆弱，用雙層平原生質(zhì)體較脆弱，用雙層平板法再生）板法再生）分離優(yōu)質(zhì)菌株分離優(yōu)質(zhì)菌株突變株穩(wěn)定性試驗突變株穩(wěn)定性試驗突變株突變株鑒定。鑒定。 是以微生物原生質(zhì)體為育種材料，采用物理或化學誘變是以微生物原生質(zhì)體為育種材料，采用物理或化學誘變劑處理，然后分離到再生培養(yǎng)基中再生，并從再

5、生菌落劑處理，然后分離到再生培養(yǎng)基中再生，并從再生菌落中篩選高產(chǎn)突變菌株。中篩選高產(chǎn)突變菌株。2 2化學誘變劑誘變原生質(zhì)體的一般程序化學誘變劑誘變原生質(zhì)體的一般程序 通常操作程序包括：出發(fā)菌株培養(yǎng)和原生質(zhì)體制備及通常操作程序包括：出發(fā)菌株培養(yǎng)和原生質(zhì)體制備及再生再生選選擇擇合適的化學誘變劑，配制成合適的濃度合適的化學誘變劑，配制成合適的濃度加入加入原生質(zhì)體懸浮液，混合（含有高滲溶液，穩(wěn)定原生質(zhì)體）原生質(zhì)體懸浮液，混合（含有高滲溶液，穩(wěn)定原生質(zhì)體）誘變處理誘變處理離心棄誘變劑、原生質(zhì)體沉淀用穩(wěn)定液洗滌離心棄誘變劑、原生質(zhì)體沉淀用穩(wěn)定液洗滌稀釋、分離到再生平板上（雙層平板法）稀釋、分離到再生平板上

6、（雙層平板法）再生培養(yǎng)再生培養(yǎng)觀察、篩選突變株觀察、篩選突變株復篩復篩突變株鑒定。突變株鑒定。 原生原生質(zhì)體誘變周期一般質(zhì)體誘變周期一般比常規(guī)誘變育種要長，難度更比常規(guī)誘變育種要長，難度更大。大。（二）原生質(zhì)體誘變育種實例（二）原生質(zhì)體誘變育種實例1 1擴展青霉原生質(zhì)體擴展青霉原生質(zhì)體制備制備2 2、原生質(zhì)體再生、原生質(zhì)體再生3 3、原生質(zhì)體誘變、原生質(zhì)體誘變4 4、突變株篩選、突變株篩選三、微生物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種三、微生物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種 整條整條DNADNA或或DNADNA片段的轉(zhuǎn)化片段的轉(zhuǎn)化四、微生物原生質(zhì)融合育種四、微生物原生質(zhì)融合育種五、其他微生物原生質(zhì)體育種五、其他微生物原生質(zhì)體育

7、種 用水解酶除去遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的最大障礙用水解酶除去遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的最大障礙細胞壁，制細胞壁，制成由原生質(zhì)膜包被的裸細胞，然后用物理、化學或生物學成由原生質(zhì)膜包被的裸細胞，然后用物理、化學或生物學方法，誘導遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體融合，經(jīng)染色方法，誘導遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體融合，經(jīng)染色體交換、重組而達到雜交的目的，經(jīng)篩選獲得具有雙親優(yōu)體交換、重組而達到雜交的目的，經(jīng)篩選獲得具有雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子良性狀于一體的穩(wěn)定融合子。 聚乙二醇誘導和電融和聚乙二醇誘導和電融和 聚乙二醇種內(nèi)融合率可高達聚乙二醇種內(nèi)融合率可高達27%27%，種間的融合率也，種間的融合率也可達可達10%10%，

8、比常規(guī)的雜交重組頻率提高千倍以上。電場誘，比常規(guī)的雜交重組頻率提高千倍以上。電場誘導融合又將融合率提高導融合又將融合率提高1010倍。倍。 原生質(zhì)體融合育種的特點原生質(zhì)體融合育種的特點1 1、雜交率高、雜交率高2 2、受接合型或致育型的限制小、受接合型或致育型的限制小3 3、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整4 4、存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能、存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能5 5、有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株、有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株6 6、提高菌株產(chǎn)量的潛力較大、提高菌株產(chǎn)量的潛力較大7 7、有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系、有

9、助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系 原生質(zhì)體融合育種五大步驟原生質(zhì)體融合育種五大步驟：直接親本及其遺傳標記選擇直接親本及其遺傳標記選擇；雙親本原生質(zhì)體制備與再生雙親本原生質(zhì)體制備與再生；親本原生質(zhì)體誘導融合親本原生質(zhì)體誘導融合；融合重組體（稱為融合子）分離融合重組體（稱為融合子）分離；遺傳特性分析與測定遺傳特性分析與測定； 二、原生質(zhì)體制備與再生二、原生質(zhì)體制備與再生（一）（一）原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體制備 最有效和最常用最有效和最常用的是酶法。的是酶法。一、直接親本及其遺傳標記的選擇一、直接親本及其遺傳標記的選擇 一般把誘變系譜中篩選獲得的不同正突變株作為一般把誘變系譜中篩選獲得的不同正突變株作為直接親

10、本直接親本 直接親本都帶有遺傳標記直接親本都帶有遺傳標記 超聲波處理菌體釋放原超聲波處理菌體釋放原生質(zhì)體生質(zhì)體酶解脫壁釋放原生質(zhì)體酶解脫壁釋放原生質(zhì)體處理細菌細胞壁用酶處理細菌細胞壁用酶 溶菌酶溶菌酶LysozymeLysozyme處理放線菌細胞壁用酶處理放線菌細胞壁用酶 Lytic EnzymeLytic Enzyme裂解酶、裂解酶、 LysozymeLysozyme溶菌酶溶菌酶纖維素酶纖維素酶 CellulaseCellulase 酵母裂解酶酵母裂解酶 Zymolyase Zymolyase -1,3-1,3葡聚糖酶葡聚糖酶幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)酶 ChitinaseChitinase商品酶商品酶

11、 Novozyme234Novozyme234來自來自 Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum Lywallzyme Lywallzyme 廣東微生物研究所溶壁酶廣東微生物研究所溶壁酶 Glucuronidase Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶葡聚糖苷酸酶 ( (for yeastfor yeast) 原生質(zhì)體的好壞與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件，菌齡和預處原生質(zhì)體的好壞與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件，菌齡和預處理等因素有關(guān)。理等因素有關(guān)。 1 1、 酶法分離原生質(zhì)體的影響因素酶法分離原生質(zhì)體的影響因素 （1 1）培養(yǎng)基組成）培養(yǎng)基組成 （2 2）菌體培

12、養(yǎng)方式：）菌體培養(yǎng)方式：絲狀菌常用平板玻璃紙法，細菌絲狀菌常用平板玻璃紙法，細菌和酵母菌多用振蕩沉沒培養(yǎng)法。和酵母菌多用振蕩沉沒培養(yǎng)法。 （3 3）菌體菌齡：）菌體菌齡：絲狀真菌以年輕的菌絲用來分離原生絲狀真菌以年輕的菌絲用來分離原生質(zhì)體最佳。尤其是菌絲體尖端細胞。認為對數(shù)期的前質(zhì)體最佳。尤其是菌絲體尖端細胞。認為對數(shù)期的前期和對數(shù)期效果最好期和對數(shù)期效果最好。 酵母菌酵母菌制備原生質(zhì)體時，要使菌體同步化，才能大幅度地提高制備原生質(zhì)體時，要使菌體同步化，才能大幅度地提高制備率；制備率；放線菌放線菌制備原生質(zhì)體，以對數(shù)期到靜止期的轉(zhuǎn)換期比較理想，制備原生質(zhì)體，以對數(shù)期到靜止期的轉(zhuǎn)換期比較理想，不

13、僅制備量多，而且細胞壁再生能力也比較強；不僅制備量多，而且細胞壁再生能力也比較強；細菌細菌適合在對數(shù)期分適合在對數(shù)期分離原生質(zhì)體離原生質(zhì)體（4 4）穩(wěn)定劑）穩(wěn)定劑：高滲溶液；：高滲溶液；無機鹽對絲狀真菌效果較好，而糖和糖醇無機鹽對絲狀真菌效果較好，而糖和糖醇對酵母更為合適，細菌多使用蔗糖或?qū)湍父鼮楹线m，細菌多使用蔗糖或NaClNaCl，（5 5）酶解前的預處理）酶解前的預處理：SH-SH-化合物（如巰基乙醇）廣泛應(yīng)用于酵母自化合物（如巰基乙醇）廣泛應(yīng)用于酵母自和某些絲狀真菌中和某些絲狀真菌中 ，（6 6）酶系和酶的濃度）酶系和酶的濃度：真菌：真菌-0.5-0.5蝸牛酶和蝸牛酶和0.5%0.5

14、%纖維素酶纖維素酶 ，（7 7）酶的作用溫度和作用）酶的作用溫度和作用pHpH值值：通常細菌水解細胞壁的溫度在：通常細菌水解細胞壁的溫度在 35 35左右。一般放線菌的溫度在左右。一般放線菌的溫度在 30 303232。 （8 8）菌體密度）菌體密度：（9 9）酶解方式）酶解方式：酶解時保持較好的通氣條件和適當振蕩可促進原生：酶解時保持較好的通氣條件和適當振蕩可促進原生質(zhì)體釋放和分離。質(zhì)體釋放和分離。 2 2原生質(zhì)體的鑒別原生質(zhì)體的鑒別（1 1）低滲爆破法：）低滲爆破法： （2 2）熒光染色法：）熒光染色法：0.05%-0.1%0.05%-0.1%的熒光增白劑（的熒光增白劑（VBLVBL）3

15、3原生質(zhì)體的收集和純化原生質(zhì)體的收集和純化（1 1）過濾法：使用砂芯漏斗。）過濾法：使用砂芯漏斗。（2 2）密度梯度離心法：）密度梯度離心法： （3 3）界面法：）界面法： （4 4）漂浮法：）漂浮法： 4 4原生質(zhì)體的活力鑒定原生質(zhì)體的活力鑒定（1 1）熒光素雙醋酸鹽（）熒光素雙醋酸鹽（FDAFDA）染色法）染色法（2 2）酚藏花紅染色法（）酚藏花紅染色法（0.01%0.01%染料染色，活紅，死白）染料染色，活紅，死白） （3 3）伊文思籃染色法）伊文思籃染色法 （0.25%0.25%伊文思籃，活無色，死藍色）伊文思籃，活無色，死藍色）5 5原生質(zhì)體的保存原生質(zhì)體的保存 （1 1）立即進行融

16、合或其它方式育種）立即進行融合或其它方式育種（2 2） 5 5的二甲亞砜或甘油等其他保護劑；液氮。的二甲亞砜或甘油等其他保護劑；液氮。 （二）原生質(zhì)體再生（二）原生質(zhì)體再生 l l、原生質(zhì)體再生的影響因素、原生質(zhì)體再生的影響因素菌體生理狀態(tài)菌體生理狀態(tài) 穩(wěn)定劑穩(wěn)定劑 酶濃度和酶作用時間酶濃度和酶作用時間 再生培養(yǎng)基：絲狀真菌、釀酒酵母等的原生質(zhì)體僅能再生培養(yǎng)基：絲狀真菌、釀酒酵母等的原生質(zhì)體僅能在固體培養(yǎng)基上再生，在液體培養(yǎng)基中細胞壁再生不在固體培養(yǎng)基上再生，在液體培養(yǎng)基中細胞壁再生不徹底，不能完全復原。再生培養(yǎng)基要用穩(wěn)定劑配制，徹底，不能完全復原。再生培養(yǎng)基要用穩(wěn)定劑配制，還含有還含有CaC

17、a2+2+和和MgMg2+2+, ,濃度和原生質(zhì)體形成時的酶解液相濃度和原生質(zhì)體形成時的酶解液相類似，菌種不同稍有差別。類似，菌種不同稍有差別。 殘存菌體的分離殘存菌體的分離原生質(zhì)體密度原生質(zhì)體密度 排除再生培養(yǎng)基上的冷凝水，排除再生培養(yǎng)基上的冷凝水， 再再生方法，生方法， 大分子的合成和大分子的合成和原生質(zhì)體生長；原生質(zhì)體生長；細胞壁的合成與細胞壁的合成與再生；分裂能力再生；分裂能力的恢復并開始分的恢復并開始分裂繁殖裂繁殖細菌、放線菌和酵母菌多用糖醇系統(tǒng)的穩(wěn)定液；霉菌多細菌、放線菌和酵母菌多用糖醇系統(tǒng)的穩(wěn)定液；霉菌多用鹽溶液系統(tǒng)。用鹽溶液系統(tǒng)。2 2再生率及其計算再生率及其計算再生頻率再生頻

18、率= =（再生培養(yǎng)基上的總菌落數(shù)（再生培養(yǎng)基上的總菌落數(shù)- -酶處理后酶處理后未原生質(zhì)化菌落數(shù)）未原生質(zhì)化菌落數(shù)）/ /原生質(zhì)體數(shù)原生質(zhì)體數(shù)100%細菌原生質(zhì)體再生頻率在細菌原生質(zhì)體再生頻率在9090以上，以上，放線菌的放線菌的50506060，真菌為真菌為20207070。三、原生質(zhì)體融合三、原生質(zhì)體融合（一）原生質(zhì)體融合過程（一）原生質(zhì)體融合過程 兩親株原生質(zhì)體混合于高滲透壓的穩(wěn)定液中，兩親株原生質(zhì)體混合于高滲透壓的穩(wěn)定液中，在在PEGPEG的誘導下，兩個或兩個以上凝聚成團，相鄰的誘導下，兩個或兩個以上凝聚成團，相鄰原生質(zhì)體緊密接觸的質(zhì)膜面擴大，相互接觸的質(zhì)原生質(zhì)體緊密接觸的質(zhì)膜面擴大，相

19、互接觸的質(zhì)膜消失，細胞質(zhì)融合，形成一個異核體細胞，異膜消失，細胞質(zhì)融合，形成一個異核體細胞，異核體的細胞在繁殖過程中發(fā)生核的融合，形成雜核體的細胞在繁殖過程中發(fā)生核的融合，形成雜合二倍體，通過染色體交換，產(chǎn)生各種重組體，合二倍體，通過染色體交換，產(chǎn)生各種重組體，稱為融合子稱為融合子 原生質(zhì)體原生質(zhì)體 、PEG PEG 及適量的及適量的CaClCaCl2 2、MgClMgCl2 2（二）原生質(zhì)體融合的影響因素二）原生質(zhì)體融合的影響因素 1 1融合劑融合劑： 化學融合劑：不同種類微生物對化學融合劑：不同種類微生物對P PE EG G分分子量的要求不盡子量的要求不盡相同。相同。 物理融合劑：電場和激

20、光物理融合劑：電場和激光 2 2溫度：溫度：絲狀真菌適宜融合的溫度約為絲狀真菌適宜融合的溫度約為3030；而細菌；而細菌原生質(zhì)體融合的適溫往往偏低，據(jù)認為原生質(zhì)體融合的適溫往往偏低，據(jù)認為44或或2020比比3737更好；放線菌通常在常溫（約更好；放線菌通常在常溫（約2020）下進行融合。）下進行融合?？偟膩碚f在總的來說在20-3020-30下進行融合效果較理想。融合處理下進行融合效果較理想。融合處理時間從時間從1min-1h1min-1h，但大多數(shù)微生物，但大多數(shù)微生物1 110 min10 min， 3 3、親株的親和力和原生質(zhì)體的活性、親株的親和力和原生質(zhì)體的活性 4 4無機離子：無機離

21、子： 在在PEGPEG介導融合時，介導融合時，通常需要一定梯度的通常需要一定梯度的CaCa2+2+、MgMg2+2+有效地促進融合有效地促進融合 5 5其他條件其他條件 ：細胞密度細胞密度，不少于，不少于10106 6/ml/ml；應(yīng)采用年輕；應(yīng)采用年輕的含殘余菌絲少的的原生質(zhì)體進行融合。的含殘余菌絲少的的原生質(zhì)體進行融合。 四、融四、融合合體再生體再生（一）融合體再生（一）融合體再生 雙親融合后形成的融合體不等于重組體，以霉菌雙親融合后形成的融合體不等于重組體，以霉菌來來說說，可能是異核體或雜合二倍體或重組體，它們?nèi)?，可能是異核體或雜合二倍體或重組體，它們?nèi)诤虾鬆I養(yǎng)互補，經(jīng)過再生，均可在基本

22、培養(yǎng)基上形成合后營養(yǎng)互補，經(jīng)過再生，均可在基本培養(yǎng)基上形成菌落。菌落。 融合體的再生包括融合體細胞壁的合成、重建和融合體的再生包括融合體細胞壁的合成、重建和融合體的再生。融合體的再生。 酵母菌、細菌常用雙層平板法，酵母菌、細菌常用雙層平板法，與融合前原生與融合前原生質(zhì)再生率測定相同。霉菌和放線菌除了用雙層平板法質(zhì)再生率測定相同。霉菌和放線菌除了用雙層平板法外，也可把原生質(zhì)體直接分離到高滲培養(yǎng)基平板上，外，也可把原生質(zhì)體直接分離到高滲培養(yǎng)基平板上，同樣能得到再生菌落。同樣能得到再生菌落。 復原：原生質(zhì)體本身形成細胞壁，而且還能從原生質(zhì)復原：原生質(zhì)體本身形成細胞壁，而且還能從原生質(zhì)體細胞上長出有細

23、胞壁的菌絲體體細胞上長出有細胞壁的菌絲體（二）融合體的檢出與分離（二）融合體的檢出與分離1 1利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體2 2利用抗性選擇融合體利用抗性選擇融合體3 3用滅活用滅活原生原生質(zhì)體檢出融合體質(zhì)體檢出融合體4 4利用熒光染色法選擇融利用熒光染色法選擇融合合體體5 5雙親對碳源利用不同而檢出融合雙親對碳源利用不同而檢出融合體體6 6融合體的其他選擇方法融合體的其他選擇方法對昆蟲的毒力測定進行融合體的選擇對昆蟲的毒力測定進行融合體的選擇利用形態(tài)差異選擇利用形態(tài)差異選擇 生化測定指標選擇融合體生化測定指標選擇融合體 五、融合重組體檢出與遺傳分析五、融合重組體檢出與遺傳分析分離重組體，并試驗其遺傳穩(wěn)定性研究分離重組體，并試驗其遺傳穩(wěn)定性研究 （一）重組體的檢出和鑒別的方法（一）重組體的檢出和鑒別的方法1 1直接法直接法2 2間接選擇法間接選擇法3 3鈍化選擇法鈍化選擇法（二）融合率（二）融合率 如采用直接法，