發(fā)光免疫分析技術(shù)

1、 化學發(fā)光免疫分析技術(shù)化學發(fā)光免疫分析技術(shù) 化學發(fā)光免疫分析技術(shù)化學發(fā)光免疫分析技術(shù) 慨慨 述述 - 化學發(fā)光 - 化學發(fā)光效率 化學發(fā)光劑和標記技術(shù)化學發(fā)光劑和標記技術(shù) - 化學發(fā)光劑 - 發(fā)光劑的標記技術(shù) 化學發(fā)光免疫分析的類型化學發(fā)光免疫分析的類型 - 直接化學發(fā)光免疫分析 - 化學發(fā)光酶免疫分析 - 電化學發(fā)光免疫分析什么是發(fā)光免疫分析？什么是發(fā)光免疫分析？是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫分析種新的檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫分析技術(shù)。技術(shù)。 放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù) 三大經(jīng)典標記技

2、術(shù) 發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài) （較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再 返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。 根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為: 光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學發(fā)光等。 發(fā)光的基礎(chǔ)知識 光照發(fā)光（photoluminescence）指發(fā)光劑（熒光素） 經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā) 態(tài)，其回至基態(tài)時，發(fā)射出較長波長的光。 生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的 發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光 素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧 化型熒光素，它在回復基態(tài)時多余的能量以光子的形 式釋放出來。

3、化學發(fā)光 發(fā)光的基本類型發(fā)光的基本類型化學發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光?；瘜W發(fā)光又分為：直接化學發(fā)光間接化學發(fā)光 什么是化學發(fā)光什么是化學發(fā)光一些化學反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學發(fā)光。反應(yīng)過程簡單地描述如下： A十B C* C* C h為光子，C*表示C處于

4、激發(fā)態(tài) 直接化學發(fā)光直接化學發(fā)光若激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學反應(yīng)的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)光，這種過程叫間接化學發(fā)光。反應(yīng)過程表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h 間接化學發(fā)光間接化學發(fā)光 化學發(fā)光劑和標記技術(shù)在化學發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式在化學發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學發(fā)光劑或發(fā)光底物。釋放能量的化合物，稱為化學發(fā)光劑或發(fā)光底物。 一、化學發(fā)光劑一、化學發(fā)光劑 發(fā)光的量子產(chǎn)率高； 它的物理-化學特性要與被標記或測定的 物質(zhì)相匹配； 能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；

5、 其化學發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果； 在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性 化學發(fā)光劑的基本條件化學發(fā)光劑的基本條件直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。 （一）直接化學發(fā)光劑（一）直接化學發(fā)光劑一一. . 代表物質(zhì)：吖啶酯，在堿性條件下被代表物質(zhì)：吖啶酯，在堿性條件下被H H2 2O O2 2氧化時氧化時, ,發(fā)出發(fā)出波長波長470nm470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)

6、態(tài)產(chǎn)物的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-N-甲甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體?；灌ね窃摪l(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。 二二. . 另一類代表物質(zhì)：另一類代表物質(zhì)：三聯(lián)吡啶釕，三聯(lián)吡啶釕，RU(bpy)3RU(bpy)32+2+是電化學發(fā)光劑，是電化學發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（它和電子供體三丙胺（TPATPA）在陽電極表面可同時失去）在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。 三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕電化學發(fā)光劑反應(yīng)原理電化學發(fā)光劑反應(yīng)原理 利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑。（底物）發(fā)光，這一

7、類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑。代表物質(zhì)：代表物質(zhì)：魯米諾及其衍生物，魯米諾及其衍生物，AMPPDAMPPD （二）酶促化學發(fā)光劑（二）酶促化學發(fā)光劑 魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理 AMPPD3-(2-螺旋金剛烷螺旋金剛烷)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基)苯苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷二氧雜環(huán)丁烷化學發(fā)光免疫分析的類型化學發(fā)光免疫分析的類型 用吖啶酯直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器

8、和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。一、直接化學發(fā)光免疫分析一、直接化學發(fā)光免疫分析發(fā)光發(fā)光Y YY磁微粒子磁微粒子被測抗原被測抗原+ 抗體抗體+丫啶酯標丫啶酯標記物抗體記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10） 直接化學發(fā)光分析直接化學發(fā)光分析-夾心法夾心法電化學發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體， 在電場中因電子轉(zhuǎn)移而

9、發(fā)生特異性化學發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。 二、電化學發(fā)光免疫分析二、電化學發(fā)光免疫分析 磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標記抗體(抗原)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測標本與相應(yīng)的抗原 (抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標記抗體復合物，這時將上述復合物吸入流動室，同時引人TPA緩沖液。 當磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學發(fā)光，光強度與待測抗原濃度成正比。 電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析電

10、化學發(fā)光免疫分析示意圖電化學發(fā)光免疫分析示意圖以TSH為例：第一步：結(jié)合了活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即Ru(bpy)32+ + N羥基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗體和結(jié)合了生物素的TSH抗體與待測血清同時加入一個反應(yīng)杯中，孵育9分鐘。第二步：將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應(yīng)杯中，再次孵育9分鐘，使生物素通過與親和素的結(jié)合將磁珠、TSH抗體連接為一體，形成雙抗體夾心法。下一步，蠕動泵將形成的Ru(bpy)32+抗體抗原抗體磁珠復合體吸入流動測量室，此時，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時，游離的TSH抗體（與生物素結(jié)合的和與Ru(bpy)32+結(jié)合的抗體）也被吸出測量室。緊接著，蠕動泵加

11、入含三丙胺（TPA）的緩沖液，同時電極加電壓，啟動ECL反應(yīng)過程。發(fā)光劑Ru(bpy)32+和電子供體TPA在陽極表面可同時各失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)，使二價的Ru(bpy)32+被氧化成三價，后者是一種強氧化劑；另一方面，TPA 被氧化成陽離子自由基TPA+q，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去一個質(zhì)子（H+），形成自由基TPAq，這是一種很強的還原劑，可將一個電子給三價的Ru(bpy)33+，使其形成激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+通過熒光機制衰減，發(fā)射出一個波長620nm的光子，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+。該過程在電極表面周而復

12、始地進行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強度，光強度與Ru(bpy)32+的濃度呈線性關(guān)系，故可測出待測抗原的含量。最后，終止電壓，移開磁珠，加入清洗液沖洗流動測量室，準備下一個樣品測定。 化學發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑?/p>

13、大，處理信號計算出測定物的濃度。三、化學發(fā)光酶免疫分析三、化學發(fā)光酶免疫分析 該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標記抗體復合物，這時加入魯米這時加入魯米諾發(fā)光劑、諾發(fā)光劑、H H2 2O O2 2和化學發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。和化學發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。 （一）（一）HRP標記化學發(fā)光免疫分析標記化學發(fā)光免疫分析 HRP標記化學發(fā)光免疫分析標記化學發(fā)光免疫分析 該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，這時加入這時加入AMPPDAMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶發(fā)光劑，堿性磷酸酶使使AMPPDAMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。脫去磷酸根基團而發(fā)光。 （二）（二）AKP標記化學發(fā)光免疫分析標記化學發(fā)光免疫分析 AKP標記化學發(fā)光免疫分析標記化學發(fā)光免疫分析 加樣品、磁顆加樣品、磁顆粒子、試劑粒子、試劑孵育，使反孵育，使反應(yīng)物結(jié)合應(yīng)物結(jié)合清洗去除未清洗去除未結(jié)合物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)加入底物加入底物 產(chǎn)生信