實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌鑒定中常見的生理生化反應(yīng)

1、實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌鑒定中常見的生理生化反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?) 了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒定中常見的生理生化反應(yīng)方法。2) 了解不同細(xì)菌對(duì)不同含碳、含氮化合物的分解利用情況。3) 了解細(xì)菌在不同培養(yǎng)基的不同生長(zhǎng)現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義。二、實(shí)驗(yàn)原理。各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物存在差別。以此用生理生化試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱之為細(xì)菌的生理生化反應(yīng)。1. 糖（醇）類發(fā)酵試驗(yàn)不同的細(xì)菌含有發(fā)酵不同的糖（醇）的酶，因而發(fā)酵糖（醇）的能力各不相同，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同：有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的產(chǎn)酸不產(chǎn)

2、氣。指示劑溴甲酚紫，pH5.2黃色pH6.8紫色，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，培養(yǎng)基將由紫變黃。產(chǎn)氣可由杜氏小管中有無氣泡來證明。2. 甲基紅試驗(yàn)（M.R試驗(yàn)）甲基紅試驗(yàn)，pH4.4紅色pH6.2黃色，是用來檢測(cè)由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些細(xì)菌分解糖類產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步反應(yīng)形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下。有些細(xì)菌在培養(yǎng)的早期產(chǎn)生有機(jī)酸，但在后期將有有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。3. Voges-Proskauer試驗(yàn)（伏-普試驗(yàn)，V.P. 試驗(yàn)）伏-普試驗(yàn)是用來測(cè)定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。某些細(xì)菌分

3、解葡萄糖成丙酮酸，再將丙酮酸縮合脫羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下，被氧化為二乙酰，二乙酰與培養(yǎng)基中所含的胍基作用，生成紅色化合物為V.P.反應(yīng)陽(yáng)性。4. 靛基質(zhì)試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌，如大腸桿菌，能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)，靛基質(zhì)與對(duì)二甲基氨基苯甲酸結(jié)合，形成玫瑰色靛基質(zhì)。5. 硫化氫試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解含硫的氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)，形成黑色的硫化鐵沉淀，為硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性。6. 明膠液化實(shí)驗(yàn)明膠在25度以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體狀態(tài)存在，而在25度以上時(shí)明膠就會(huì)液化。有些微生物可產(chǎn)生一種成為明膠酶的胞外酶，水解這種蛋白質(zhì)，而使明膠液化，甚至在4度仍

4、能保持液化狀態(tài)。7. 檸檬酸鹽利用試驗(yàn)有的細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時(shí)培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑pH6.0(黃)7.6(藍(lán))，由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。8. 淀粉水解實(shí)驗(yàn)細(xì)菌水解淀粉的過程可以通過底物的變化來證明，即用碘測(cè)定不再產(chǎn)生藍(lán)色。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和用具實(shí)驗(yàn)儀器：32度恒溫培養(yǎng)箱、4度冰箱；微生物材料：大腸桿菌、變形桿菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣桿菌、待鑒定的未知菌的平板單菌落；試劑：甲基紅試劑、V.P.試劑、吲哚試劑，KOH溶液；實(shí)驗(yàn)用具：試管：每個(gè)試驗(yàn)3根試驗(yàn)管，1根對(duì)照管，8個(gè)試驗(yàn)，共32管；杜氏小管、接種

5、環(huán)、接種針、酒精燈、火柴、試管架、記號(hào)筆。四、實(shí)驗(yàn)步驟。1. 配制培養(yǎng)基（上次實(shí)驗(yàn)完成）2. 鑒別實(shí)驗(yàn)1）糖(醇)類發(fā)酵試驗(yàn)編號(hào)：在各試管上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，所接種的菌名和組號(hào)，下同。接種：取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基3支，按編號(hào)1支接種大腸桿菌，另1支接種普通變形桿菌，第3支不接種，作為對(duì)照。同樣取3支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，1支接種大腸桿菌，1支接種普通變形桿菌，第3支不接種，作為對(duì)照。將已接種好的培養(yǎng)基置32溫箱中培養(yǎng)24h。2）. 甲基紅試驗(yàn)(M.R.試驗(yàn))將大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，32培養(yǎng) 24h，加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。3）

6、. 伏一普試驗(yàn)(VP試驗(yàn))將被檢菌接種到葡萄糖蛋白胨水中，32培養(yǎng)24h，取出，加入40KOH 7滴，然后再加入等量的5a-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37溫箱中保溫30min，以加快反應(yīng)速度。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏普反應(yīng)陽(yáng)性。4)靛基質(zhì)(吲哚)試驗(yàn) 將被檢菌接種到胰蛋白胨水培養(yǎng)基中，32培養(yǎng)24h后，滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，輕輕搖動(dòng)，觀察結(jié)果。 出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，出現(xiàn)黃色者為陰性。5). 硫化氫試驗(yàn)：將大腸桿菌和變形桿菌以接種針穿刺接種到醋酸鉛或檸檬酸鐵氨培養(yǎng)基中，32培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，若有黑色出現(xiàn)者為陽(yáng)性。6)明膠液化試驗(yàn) 取大腸桿菌和枯草桿菌的純培養(yǎng)物少許，以接種針分別穿刺接種到

7、營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基中，置32培養(yǎng)24小時(shí)。故觀察結(jié)果時(shí)，應(yīng)將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4冰箱30min，此時(shí)明膠又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，說明明膠被試驗(yàn)細(xì)菌液化，是為陽(yáng)性。7） 檸檬酸鹽利用試驗(yàn)取少量被檢菌接種到檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，32培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變深藍(lán)色者為陽(yáng)性。8） 淀粉水解試驗(yàn)在培養(yǎng)進(jìn)表面滴加碘液，觀察是否變紫。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1.觀察結(jié)果如下表：表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號(hào)大腸桿菌枯草桿菌產(chǎn)氣桿菌變形桿菌未知菌空白對(duì)照葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)變黃色，有氣泡/變黃色，無氣泡變黃色，無氣泡紫色，無氣泡乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)變黃色，有氣泡/紫色，無氣泡紫色，無氣泡紫色，無氣泡甲基紅試驗(yàn)紅色/黃色/桔

8、紅色淡黃色伏-普試驗(yàn)黃色紅色紅色淡黃色吲哚試驗(yàn)玫瑰紅色/玫瑰紅色/無色淡黃色硫化氫試驗(yàn)黃色/黑色從中間向外蔓延黃色黃色明膠液化試驗(yàn)無液體/無液體/液體無液體檸檬酸鹽利用試驗(yàn)下藍(lán)上黃/下黃上藍(lán)/下藍(lán)上黃綠色淀粉試驗(yàn)紫色紫色紫色黃色紫色紫色表2. 各項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及意義陽(yáng)性陰性（對(duì)照）現(xiàn)象意義現(xiàn)象意義葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)溶液變黃細(xì)菌代謝產(chǎn)有機(jī)酸溶液仍為紫色細(xì)菌代謝不產(chǎn)酸杜氏小管中有氣體（體積10% ）細(xì)菌代謝產(chǎn)生氣體杜氏小管中無氣體細(xì)菌代謝不產(chǎn)生氣體乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)溶液變黃細(xì)菌代謝產(chǎn)有機(jī)酸溶液仍為紫色細(xì)菌代謝不產(chǎn)酸杜氏小管中有氣體（體積10% ）細(xì)菌代謝產(chǎn)生氣體杜氏小管中無氣體細(xì)菌代謝不產(chǎn)生氣體甲基紅試

9、驗(yàn)加入甲基紅，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色pH下降到4.2以下加入甲基紅，培養(yǎng)基為黃色pH值大于6伏-普試驗(yàn)培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色細(xì)菌代謝產(chǎn)生乙酰基甲醇培養(yǎng)基為黃色細(xì)菌代謝不產(chǎn)生乙?；状歼胚嵩囼?yàn)培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色細(xì)菌代謝可分解色氨酸培養(yǎng)基為黃色細(xì)菌代謝不能分解色氨酸硫化氫試驗(yàn)產(chǎn)生黑色固體細(xì)菌代謝產(chǎn)生硫化氫無黑色固體產(chǎn)生細(xì)菌代謝不產(chǎn)生硫化氫明膠液化試驗(yàn)明膠在4仍能保持液化狀態(tài)細(xì)菌可產(chǎn)生明膠酶明膠在25以下不能液化細(xì)菌不能產(chǎn)生明膠酶檸檬酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色細(xì)菌可利用檸檬酸鹽作為碳源培養(yǎng)基仍為綠色細(xì)菌不能利用檸檬酸鹽作為碳源淀粉水解試驗(yàn)不變，黃色細(xì)菌可利用淀粉變紫細(xì)胞無法利用淀粉2.照片及分析：1）糖(醇)類

10、發(fā)酵試驗(yàn)現(xiàn)象：葡萄糖發(fā)酵中，三個(gè)菌種的溶液都變黃，為陽(yáng)性；僅大腸桿菌杜氏小管含氣泡。分析：大腸桿菌能分解葡萄糖，產(chǎn)生甲酸等產(chǎn)物，并有甲酸解氫酶，可將其分解為CO2和H2，故生化反應(yīng)結(jié)果為產(chǎn)酸產(chǎn)氣。而另外兩種菌代謝產(chǎn)生了酸，但沒有氣體產(chǎn)生。另外，未知菌溶液臨近表面處有一層深色區(qū)域，不像指示劑的顏色，可能為某種代謝產(chǎn)物。圖1 葡萄糖發(fā)酵（從左到右依次為對(duì)照、大腸桿菌、未知菌、變形桿菌）現(xiàn)象：乳糖發(fā)酵中，未知菌和變形桿菌都不變色，大腸桿菌的培養(yǎng)液變黃。只有大腸桿菌杜氏小管有氣泡。分析：變形桿菌無法利用乳糖，未知菌無法利用乳糖或在乳糖代謝途徑中沒有產(chǎn)生有機(jī)酸，大腸桿菌乳糖代謝途徑產(chǎn)生了有機(jī)酸，且產(chǎn)生了

11、氣體圖2 乳糖發(fā)酵（從左到右依次為對(duì)照、未知菌、變形桿菌、大腸桿菌）2）. 甲基紅試驗(yàn)(M.R.試驗(yàn))現(xiàn)象：甲基紅試驗(yàn)中，大腸桿菌為深紅色，說明其產(chǎn)生的酸最多；未知菌為桔紅色，說明它產(chǎn)酸量中等；產(chǎn)氣桿菌為黃色，說明它基本不產(chǎn)酸。分析：大腸桿菌分解糖類產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步反應(yīng)形成甲酸等，使培養(yǎng)基的pH降低，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色。產(chǎn)氣桿菌在培養(yǎng)的早期產(chǎn)生有機(jī)酸，但在后期將有有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為非酸性末端產(chǎn)物，使pH升至大約6，培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色。圖3 甲基紅試驗(yàn)（從左到右依次為對(duì)照、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、未知菌）3）. 伏一普試驗(yàn)(VP試驗(yàn))現(xiàn)象：大腸桿菌黃色（即無變化），產(chǎn)氣桿菌稍有紅色，未知菌為紅色。分析：，

12、說明大腸桿菌在葡萄糖蛋白胨水中代謝不產(chǎn)生乙酰基甲醇；產(chǎn)氣桿菌產(chǎn)生了少量乙?；状?；未知菌產(chǎn)生了較多乙酰基甲醇注：V.P.試驗(yàn)一開始是沒有現(xiàn)象的，最后把其他的試管都洗了后(這也是沒有對(duì)照的原因)，我們重新滴加了邊臺(tái)的NaOH，然后用a-萘酚溶液處理，所以估計(jì)一開始沒有現(xiàn)象的原因可能和KOH失效有關(guān)。圖4 V.P試驗(yàn)（從左到右依次是大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、未知菌）4)靛基質(zhì)(吲哚)試驗(yàn)現(xiàn)象：吲哚試驗(yàn)中，未知菌沒有變化；產(chǎn)氣桿菌和大腸桿菌溶液表面產(chǎn)生了少量玫瑰紅。分析：未知菌無法分解色氨酸，產(chǎn)氣桿菌和大腸桿菌可以分解色氨酸。另外，對(duì)照組也出現(xiàn)了玫瑰紅，照理說里面沒有微生物分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)的

13、話，是不會(huì)反應(yīng)產(chǎn)生紅色化合物的，估計(jì)試劑有污染，比如有含色氨酸酶的雜菌引入。圖5 吲哚試驗(yàn)（從左到右依次是對(duì)照、未知菌、產(chǎn)氣桿菌、大腸桿菌）5). 硫化氫試驗(yàn)：圖片不是很清晰，請(qǐng)見諒?，F(xiàn)象：硫化氫試驗(yàn)中，僅有變形桿菌產(chǎn)生了黑色物質(zhì)。三只試管接種周圍都有向外擴(kuò)展現(xiàn)象。分析：僅變形桿菌能分解含硫的氨基酸并產(chǎn)生硫化氫。三種菌均具有運(yùn)動(dòng)能力圖6 硫化氫試驗(yàn)（從左到右依次是對(duì)照、未知菌、變形桿菌、大腸桿菌）6). 明膠液化試驗(yàn)現(xiàn)象：明膠液化試驗(yàn)中，僅有未知菌使明膠在25以下液化分析：僅未知菌可產(chǎn)生明膠酶圖7 明膠液化試驗(yàn)（從左到右依次是對(duì)照、未知菌、大腸桿菌、枯草桿菌）7). 檸檬酸鹽利用試驗(yàn)現(xiàn)象：檸檬

14、酸鹽利用實(shí)驗(yàn)中，未知菌和大腸桿菌使培養(yǎng)基變黃；產(chǎn)氣桿菌培養(yǎng)基變藍(lán)。分析：未知菌和大腸桿菌不能利用檸檬酸鈉作碳源或在利用檸檬酸鹽時(shí)產(chǎn)生了酸，產(chǎn)氣桿菌在利用檸檬酸鹽時(shí)產(chǎn)生了堿圖8 檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)（從左到右依次是對(duì)照、未知菌、產(chǎn)氣桿菌、大腸桿菌）8). 淀粉水解試驗(yàn)變形桿菌空白對(duì)照未知菌枯草桿菌產(chǎn)氣桿菌大腸桿菌圖9 淀粉水解實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：淀粉水解實(shí)驗(yàn)中，除了未知菌外，所有菌均有變藍(lán)的現(xiàn)象。分析：未知菌分解了淀粉，其他菌無法分解或只能少量利用淀粉。六、實(shí)驗(yàn)小結(jié)這次實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)是觀察，而且要注意觀察前的操作，比如明膠要觀察必須先在4冰箱冷藏，拿出來后要盡快觀察防止其在室溫下融化；而吲哚試驗(yàn)要注意不要晃動(dòng)，因?yàn)?/p>

15、產(chǎn)生的玫瑰色靛基質(zhì)本來就不多，如果劇烈晃動(dòng)使之?dāng)U散開來的話，就基本上看不見了；V.P.試驗(yàn)是最糾結(jié)的，很多組在32下放了很久還是沒有現(xiàn)象，我們開始認(rèn)為是因?yàn)闇囟炔粔?，可是加熱也沒有效果，于是考慮是不是試劑的問題，于是擅自用了實(shí)驗(yàn)室邊臺(tái)用于調(diào)pH的NaOH溶液，結(jié)果果然變紅了。七、思考1. 接種后的明膠試管可以在37度培養(yǎng)，在培養(yǎng)后你必須采取什么措施才能證明液化的存在？將明膠培養(yǎng)基放入4冰箱30min，仍不凝固說明明膠被試驗(yàn)細(xì)菌液化，為陽(yáng)性。2. 在吲哚試驗(yàn)和硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)中細(xì)菌各分解哪種氨基酸？吲哚試驗(yàn):含有色氨酸酶的細(xì)菌（如大腸桿菌、變形桿菌等）可分解色氨酸生成吲哚。硫化氫試驗(yàn)：變形桿菌、乙型副傷寒桿菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氫。3. 假設(shè)某種微生物可以有氧代謝