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1、分子生物學(xué)整理2013/12/10根據(jù)每份PPT后的老師給的題目整理的,據(jù)說(shuō)考試不超過(guò)那個(gè)范圍,大家認(rèn)真復(fù)習(xí),若有錯(cuò)誤的地方,請(qǐng)積極批評(píng)指正! 第一份PPT1. 分子生物學(xué):是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué),是人類(lèi)從分子水平上正式揭示生物界的奧秘,有被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)為主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。2. 生物大分子( biomacromolecule ):主要包括核酸(DNA和RNA)、蛋白質(zhì)、多糖等,其主要特征是由小分子的構(gòu)件分子(如:核苷酸、氨基酸、單糖等)組成,具有較復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),而且空間結(jié)構(gòu)與其生物活性密切相關(guān)。 3. DNA重組技
2、術(shù)(又稱(chēng)基因工程)是指將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞,并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。4. 結(jié)構(gòu)分子生物學(xué):研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)變化與其生物學(xué)功能關(guān)系的學(xué)科。5. 基因組(Genome):是生物體內(nèi)遺傳信息的集合,是某個(gè)特定物種細(xì)胞內(nèi)全部DNA分子的總和。6. 基因組計(jì)劃( genome project):以獲得某物種基因組全序列為主要目標(biāo)的科學(xué)計(jì)劃。7. 基因組學(xué)(genomics):是指研究基因組結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué),包括基因組作圖、核苷酸序列測(cè)定、基因定位及基因功能分析等。8. 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics):以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo),以建
3、立生物體高分辨率遺傳、物理和轉(zhuǎn)錄圖譜為主。9. 功能基因組學(xué)(functional genomics):以基因功能鑒定為目標(biāo),根據(jù)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息,以高通量、大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)方法,借助計(jì)算機(jī)分析,系統(tǒng)地對(duì)基因功能進(jìn)行詮釋。10. 生物信息學(xué)是以生物大分子為研究對(duì)象,以計(jì)算機(jī)為工具,運(yùn)用數(shù)學(xué)和信息科學(xué)的觀(guān)點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象,組織和分析呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的生物信息數(shù)據(jù)的一門(mén)科學(xué)。1. 什么是分子生物學(xué)?其研究對(duì)象是什么?分子生物學(xué):是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué),是人類(lèi)從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘,由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組
4、自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。 研究對(duì)象:生物大分子( biomacromolecule ):主要包括核酸(DNA和RNA)、蛋白質(zhì)、多糖等,其主要特征是由小分子的構(gòu)件分子(如:核苷酸、氨基酸、單糖等)組成,具有較復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),而且空間結(jié)構(gòu)與其生物活性密切相關(guān)。2. 試舉出5例分子生物學(xué)發(fā)展史上的重要科學(xué)事件 Charles Darwin進(jìn)化論:物競(jìng)天擇,適者生存 施旺細(xì)胞學(xué)說(shuō):動(dòng)植物都是由細(xì)胞組成的。 Gregor Mendel經(jīng)典遺傳學(xué):遺傳因子 Morgan基因?qū)W說(shuō) Watson和CrickDNA雙螺旋模型:里程碑3. 什么是DNA重組技術(shù)?有何應(yīng)用?DNA重組技術(shù)(又稱(chēng)基因工程)是指將外源基因通
5、過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞,并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。應(yīng)用: 基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用基因組測(cè)序基因定位基因功能研究基因表達(dá)和調(diào)控研究 多肽類(lèi)(如激素、抗生素、酶類(lèi)和抗體等)產(chǎn)品的生產(chǎn)微生物基因工程與多肽類(lèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與蛋白藥物的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物與蛋白藥物的生產(chǎn) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與人類(lèi)器官移植 物種改良轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物、工程微生物4. 什么是結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)?結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)是研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)變化與其生物學(xué)功能關(guān)系的科學(xué)。內(nèi)容:結(jié)構(gòu)測(cè)定、結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)變化規(guī)律探索、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系手段:X-射線(xiàn)衍射晶體學(xué)(蛋白質(zhì)晶體學(xué))、二維或多維核磁共振研究液相結(jié)構(gòu)、電鏡三維重組、電子衍射、中
6、子衍射和各種頻譜學(xué)方法。第二份PPT分子生物學(xué)研究法核酸:是遺傳信息的攜帶者,是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)(包括DNA與RNA)SDS裂解法:將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中,用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁,去壁細(xì)菌再用SDS裂解,從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲液中,然后用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA。熒光光度法:用EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定核酸制品的純度。DNA分子較RNA大得多,電泳遷移率低。紫外分光光度法:該法主要通過(guò)A260與A280的比值來(lái)判定有無(wú)蛋白質(zhì)的污染。在TE緩沖液中,純DNA的A260/A280為1.8,純RNA的比值為2.0。比值升高與降低均提示不純。玻棒纏
7、繞法:兩個(gè)關(guān)鍵步驟,一是基因組DNA沉淀在細(xì)胞裂解液和乙醇的交界面;二是將DNA沉淀纏繞在帶鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段DNA從無(wú)水乙醇中轉(zhuǎn)移至pH8.0的TE緩沖液中。壓碎與浸泡法:將含待回收DNA條帶的凝膠塊切出,用吸頭或接種針將其壓碎,然后以洗脫緩沖液浸泡,使DNA洗脫出來(lái)。堿裂解法:在NaOH提供的高pH(12.012.6)條件下,用強(qiáng)陽(yáng)離子去垢劑SDS破壞細(xì)胞壁,裂解細(xì)胞,與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性,釋放出質(zhì)粒DNA。(盡管堿溶液能破壞DNA中的堿基配對(duì),但CCC質(zhì)粒DNA因纏繞緊密而不易解鏈,只要不在堿性條件下變性太久,當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí),CCC質(zhì)粒DNA就
8、可重新恢復(fù)天然的超螺旋。)酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法:以含4mmol/L的異硫氰酸胍與0.1mmol/L的-巰基乙醇的變性溶液裂解細(xì)胞,然后在pH4.0的酸性條件下,用酚/氯仿抽提裂解溶液,最后通過(guò)異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌來(lái)制備RNA。變性 :在某些理化因素的作用下,維系DNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞,DNA由雙螺旋變成單鏈過(guò)程。增色效應(yīng):DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。融解溫度(Tm):在熱變性過(guò)程中,紫外吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱(chēng)為DNA的解鏈溫度或融解溫度。(爆發(fā)式:熱變性是在變性溫度范圍內(nèi)突發(fā)的躍變過(guò)程,很像結(jié)晶達(dá)到熔點(diǎn)時(shí)的融化現(xiàn)象,故名融解溫度。
9、狹窄性:變性溫度范圍很小。)復(fù)性:指變性 DNA 在適當(dāng)條件下,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程。退火:熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過(guò)程稱(chēng)之為“退火”。核酸分子雜交:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補(bǔ)的原則締合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程稱(chēng)為分子雜交或核酸分子雜交。(雜交的本質(zhì):就是在一定條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性。)核酸探針:是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)雜交,雜交后可用特殊方法檢測(cè)的已知被標(biāo)記的核酸分子。cDNA(complementary DNA):是指與mRNA互補(bǔ)的DNA分子。固相分子雜交:是將待測(cè)的靶核苷酸鏈
10、預(yù)先固定在固體支持物上,然后放入含有標(biāo)記探針的雜交液中,進(jìn)行雜交反應(yīng)后,使雜交分子留在支持物上,故稱(chēng)固體雜交。原位雜交:是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其檢測(cè)的方法基因芯片(gene chip):又稱(chēng)DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA microarray),是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纖維膜等載體。問(wèn)答:1、 簡(jiǎn)述核酸純化的原則和要求。原則:保持核酸堿基序列的完整性。 盡量清除其它分子的污染,保證核酸制品的純度要求:在整個(gè)操作過(guò)程中應(yīng)盡量避免各種有害因素對(duì)核酸的破壞。 1、溫度不要過(guò)高(0-4) (高溫破壞氫鍵) ; 2、控制
11、pH值范圍(pH4-10) (極端酸堿破壞磷酸二酯鍵) ; 3、減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力; 4、保持一定離子強(qiáng)度。核酸純度的要求 1、核酸樣品中不存在過(guò)高濃度的金屬離子和對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑; 2、其它生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和多糖分子的污染應(yīng)降至最低程度; 3、排除其它核酸分子的污染,如提取DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA,提取RNA分子時(shí)應(yīng) 去除DNA。2、 說(shuō)明核酸凝膠電泳技術(shù)的原理和要點(diǎn)。原理:一種分子被放置到電場(chǎng)中,它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度,叫做電泳的遷移率,它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比,與片段大小成反比。生理?xiàng)l件下,
12、核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài),帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì),相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因此,遷移率與核酸分子大小成反比。要點(diǎn):凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小,濃度越高,孔隙越小,其分辨能力就越強(qiáng)。電泳鑒定方法:熒光染料溴化乙錠(EB)嵌入堿基平面后,本身無(wú)熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。3、 為何沉淀是濃縮核酸的最常用且高效的方法? 改變核酸的溶解緩沖液; 重新調(diào)整核酸的濃度; 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。4、 簡(jiǎn)述核酸鑒定的要點(diǎn)。 1、核酸濃度鑒定 紫外分光光度法:該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可以吸收
13、紫外 線(xiàn),其最大吸收波長(zhǎng)為260nm。 熒光光度法:核酸在嵌入EB后,發(fā)出紅色熒光,且熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的 含量呈正比。 2、核酸純度鑒定 紫外分光光度法:該法主要通過(guò)A260與A280的比值來(lái)判定有無(wú)蛋白質(zhì)的污染。在TE 緩沖液中,純DNA的A260/A280為1.8,純RNA的比值為2.0。比值升高與降低均提示 不純。 熒光光度法:用EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定核酸制品的純度。DNA分子 較RNA大得多,電泳遷移率低核酸純度鑒定 3、完整性鑒定 瓊脂糖凝膠電泳法:以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結(jié)果為依據(jù)。 A、基因組DNA片段如發(fā)生降解,電泳圖呈拖尾狀。 B、完整的或降解很
14、少的總RNA電泳圖譜中,三條帶的熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特定的比值, 如有改變則提示有RNA的降解。 C、若在點(diǎn)樣孔附近有著色條帶,則說(shuō)明存在DNA 的污染。5、 什么是酚抽提法?什么是堿裂解法?酚抽提法:以含EDTA、SDS及無(wú)DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細(xì)胞,經(jīng)蛋白酶K處理 后,用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA,重復(fù)抽提至一定純度后,根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。裂解液成分的作用:EDTA:離子螯合劑,抑制DNase活性,降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性。SDS:溶解細(xì)胞膜、核膜,乳化脂質(zhì)、蛋白,并使其變性沉淀,同時(shí)變性DNase。無(wú)DNase的RNase:可高效水解RNA而避免D
15、NA的消化。蛋白酶K:消化DNase和胞中的蛋白質(zhì)。酚:變性沉淀蛋白,抑制DNase活性。pH 8.0的Tris緩沖液:保證抽提時(shí)DNA進(jìn)入水相,防止DNA變性。堿裂解法:在NaOH提供的高pH(12.012.6)條件下,用強(qiáng)陽(yáng)離子去垢劑SDS破壞細(xì)胞壁,裂解細(xì)胞,與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性,釋放出質(zhì)粒DNA6、 簡(jiǎn)述RNA提取的要點(diǎn)。 RNA極易被RNase水解,除胞內(nèi)的RNase外,它還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周?chē)沫h(huán)境中;RNase分子很難失去活性,而且容易復(fù)性,在RNA的制備過(guò)程中,排除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵。
16、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步分離總RNA它以含異硫氰酸胍,-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細(xì)胞,然后在pH4.0的條件下,用酚/氯仿抽提細(xì)胞裂解溶液,最后通過(guò)異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌而獲得總RNA7、 什么核酸變性、核酸復(fù)性和融解溫度?分別受哪些因素影響? 核酸變性:在某些理化因素的作用下,維系DNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受 到破壞,DNA由雙螺旋變成單鏈過(guò)程 影響因素:凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件。如:加熱,極端的pH 有機(jī)試劑(甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等) 核酸復(fù)性:指變性 DNA 在適當(dāng)條件下,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu) 的現(xiàn)象,它是
17、變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程。 影響因素:1、溫度和時(shí)間 2、DNA濃度 3、DNA分子大小和復(fù)雜度 4、離子強(qiáng)度 融解溫度:在熱變性過(guò)程中,紫外吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱(chēng)為DNA的解鏈 溫度或融解溫度。 影響因素:1、DNA分子大小和堿基的組成 2、溶液的離子強(qiáng)度 3、pH值 4、變性劑8、 什么是核酸分子雜交?其本質(zhì)是什么? 核酸分子雜交:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補(bǔ)的原則締合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程稱(chēng)為分子雜交或核酸分子雜交。 本質(zhì):在一定條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性。9、 什么是核酸探針?有哪些類(lèi)型?其設(shè)計(jì)需要遵循哪些原則? 核酸探針:是指能與特定核苷酸序列發(fā)生
18、特異性互補(bǔ)雜交,雜交后可用特殊方法檢測(cè)的 已知被標(biāo)記的核酸分子。 類(lèi)型:基因組DNA探針 cDNA探針 RNA探針 寡核苷酸探針 探針設(shè)計(jì)原則: 1、探針長(zhǎng)度:一般要求在1050bp。 2、 GC含量為4060。 3、 探針?lè)肿又袘?yīng)避免互補(bǔ)序列。 4、避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn),一般不能多于4個(gè),如GGGG-或 -CCCC-。 5、借助計(jì)算機(jī)相應(yīng)軟件與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較。10、理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有什么特點(diǎn)? 檢測(cè)物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便。 標(biāo)記物與探針結(jié)合后,應(yīng)不影響雜交反應(yīng),尤其是雜 交特異性、穩(wěn)定性和Tm值。 標(biāo)記物對(duì)環(huán)境污染小,對(duì)人體無(wú)損傷,價(jià)格低廉。 標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)方法無(wú)干擾
19、。11、 簡(jiǎn)述核酸分子雜交技術(shù)的一般流程。 探針制備及標(biāo)記(同位素或非同位素) 待測(cè)核酸樣品制備(分離,純化) 雜交(液相,固相,原位雜交) 雜交后處理(去掉非特異雜交分子) 顯示結(jié)果(顯色,發(fā)光,放射自顯影) 結(jié)果分析12、 有哪些常用的核酸分子雜交技術(shù)?其檢測(cè)對(duì)象分別是什么?13、 什么是固相分子雜交?其優(yōu)點(diǎn)是什么? 是將待測(cè)的靶核苷酸鏈預(yù)先固定在固體支持物上,然后放入含有標(biāo)記探針的雜交液中, 進(jìn)行雜交反應(yīng)后,使雜交分子留在支持物上,故稱(chēng)固體雜交。 優(yōu)點(diǎn):未雜交的游離探針通過(guò)漂洗可容易除去,膜上的雜交分子容易檢測(cè),還能防止 靶DNA的自我復(fù)性,所以被廣泛應(yīng)用。14、 請(qǐng)比較Southern
20、印跡雜交和Northern印跡雜交的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)。相同點(diǎn):雜交流程相同,探針?lè)N類(lèi)和標(biāo)記方法相同,檢測(cè)方法相同不同點(diǎn):Southern印跡是與酶切后的電泳DNA片段雜交,Northern印跡雜交是應(yīng)用DNA 探針檢測(cè)特異mRNA的一種膜上印跡技術(shù)。15、 什么是原位雜交?其特點(diǎn)是什么? 原位雜交:是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn) 行雜交并對(duì)其檢測(cè)的方法。 特點(diǎn):原位雜交技術(shù)除了具有核酸分子雜交的特異性高的特點(diǎn)之外,并可精確定位,16、 如何進(jìn)行核酸分子雜交條件的優(yōu)化? 1、探針的選擇 檢測(cè)單個(gè)堿基改變選用寡核苷酸探針。 檢測(cè)單鏈靶序列選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針
21、或RNA探針。 長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng),適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體。 100bp左右的探針適合原位雜交。2、探針的標(biāo)記方法在檢測(cè)單拷貝基因序列時(shí),應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對(duì)靈敏要求不高時(shí),可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和價(jià)廉的HRP顯示系統(tǒng)等 。3、 探針的濃度 隨探針濃度增加,雜交率也增加,在較窄的范圍內(nèi),隨探針濃度增加,敏感性增加4、雜交最適溫度 若反應(yīng)溫度低于Tm 1015,堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈,錯(cuò)配 對(duì)減少。 一般情況下,在不含變性劑甲酰胺時(shí),大多數(shù)雜交反應(yīng)在65進(jìn)行,當(dāng)含50%甲酰 胺時(shí),在42進(jìn)行。5、 反應(yīng)時(shí)間和洗膜溫度 雜
22、交時(shí)間短了,反應(yīng)無(wú)法完成;長(zhǎng)了引起非特異結(jié)合增多。一般雜交20 h左右。 雜交后的最終洗膜溫度一般應(yīng)低于Tm值512進(jìn)行 。17、 什么是基因芯片?其突出特點(diǎn)是什么?有何應(yīng)用? 基因芯片(gene chip):又稱(chēng)DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA microarray), 是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纖維膜等載體。突出特點(diǎn):建立在基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)上的一種高效、快速的核酸序列分析手段 應(yīng)用:基因表達(dá)水平的檢測(cè) 基因突變和多態(tài)性的檢測(cè) 基因芯片在藥物篩選中的應(yīng)用 預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 基因芯片在疾病診斷中的應(yīng)用第三份PPT名詞解釋?zhuān)簅ne-step RT-PCR:在同
23、一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液,直接以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增,稱(chēng)為一步法RT-PCR熒光定量PCR:是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)產(chǎn)物熒光信號(hào)的檢測(cè),對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR:是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光閾值:CR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào),熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。 Ct值:C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)
24、的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。PCR-限制性酶切片段多態(tài)性(PCR-RFLP):不同的限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別特異的DNA序列,所以用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的DNA分子進(jìn)行消化,得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)出目的DNA分子的序列信息。(用途:傳染病病原體基因分型、人類(lèi)基因變異研究。)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法(PCR-SSCP):本法就是將PCR 產(chǎn)物雙鏈DNA(dsDNA)變性為單鏈DNA (ssDNA),加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,由于DNA 分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān),而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此,電泳結(jié)束后,ssDNA帶位
25、置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。PCR-ELISA:引物采用雙標(biāo)記,即一個(gè)引物5端標(biāo)記便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團(tuán)(如生物素),另一個(gè)引物5端標(biāo)記便于PCR產(chǎn)物檢測(cè)的基團(tuán)(如地高辛、熒光素等)。非特異性擴(kuò)增:PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。熒光染料法:SYBR熒光染料能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈,發(fā)出熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)出任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。復(fù)合探針?lè)ǎ╟omplex probes)基本原理:首先合成兩個(gè)探針,一是熒光探針(25bp),5端接一熒光分子,另一為
26、淬滅探針(15bp),3端接一淬滅分子,淬滅探針能與熒光探針5端雜交。問(wèn)答:1、 簡(jiǎn)述聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的原理和反應(yīng)體系。原理:模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過(guò)程,在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下,依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促反應(yīng),由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。反應(yīng)體系:模板(template) 引物(primer) DNA 聚合酶(DNA polymerase) dNTP PCR buffer 2、 PCR引物的設(shè)計(jì)需要遵循哪些原則?1、長(zhǎng)度1530 b,過(guò)短特異性降低,過(guò)長(zhǎng)則成本增加,產(chǎn)量也下降。2、引物堿基盡可能隨機(jī)分布,避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象,引物 G+C 含量宜在45
27、 55%左右。3、引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列,否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu);兩個(gè)引物之間尤其在 3 末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在,不然會(huì)形成引物二聚體4、物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域同源性小于70%或連續(xù)互補(bǔ)堿基少于8個(gè)。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。5、引物的3末端與模板DNA一定要配對(duì)。另外 3末端的末位堿基最好選T、G、C,而不選A(引物3末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異)。6、只要與模板DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠,引物的 5 末端堿基最多可以有10個(gè)堿基不與模板DNA匹配,并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行。 3、 簡(jiǎn)述PCR的一般方案。 1、50 ul PCR反應(yīng)體系的組成 樣品
28、DNA 0.11ug; 正鏈引物(25umol/L)1.0ul; 負(fù)鏈引物(25umol/L)1.0ul; dNTP (各2.5mmol/L)4.0ul; 10PCR緩沖液 5.0ul; MgCl2(25mmol/L)3.0ul; Taq DNA聚合酶12.5u; 蒸餾的去離子水補(bǔ)至50ul。 2、對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照分別以陽(yáng)性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。 3、PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置:94 3060sec,553060sec,723060sec,循環(huán)30 次,最后72延伸5min。 4、PCR產(chǎn)物的保存:PCR產(chǎn)物于4保存。4、 請(qǐng)分別說(shuō)明假陽(yáng)性、非特異性擴(kuò)增、假陰性、引物二
29、聚體、無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物、拖尾等現(xiàn)象出現(xiàn)的原因及應(yīng)采取的對(duì)策。 假陽(yáng)性原因:PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。 含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。 陽(yáng)性對(duì)照的污染。 標(biāo)本之間的交叉污染。 在采集標(biāo)本時(shí),其他污染源帶來(lái)的污染。 Taq聚合酶中帶有細(xì)菌DNA,當(dāng)PCR擴(kuò)增片段為保守的rRNA序列時(shí),易造成假陽(yáng)性 對(duì)策:1、操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。 2、除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及 加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。3、各種試劑最好先進(jìn)行分裝,然后低溫貯存。非特異性擴(kuò)增原因:1、引物特異性差 2、模板或引物濃度過(guò)高 3、酶量過(guò)多 4、Mg2+ 濃度偏高
30、5、退火溫度偏低 6、循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策:1、重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR 2、適當(dāng)降低模板或引物濃度 3、適當(dāng)減少酶量 4、降低鎂離子濃度 5、適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 6、減少循環(huán)次數(shù) 假陰性原因:1、標(biāo)本處理的原因 處理標(biāo)本時(shí),靶DNA丟失。 處理標(biāo)本時(shí),雜質(zhì)成分沒(méi)有去除干凈,帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。 標(biāo)本放置不當(dāng),模板發(fā)生降解(尤其是RNA) 2)PCR試劑問(wèn)題 Taq DNA聚合酶失活。Mg2+濃度過(guò)低或是沒(méi)有加。 3)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的問(wèn)題 PCR擴(kuò)增儀故障。PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒(méi)有加液體石蠟油。 4)PCR產(chǎn)物鑒定中的問(wèn)題 電泳時(shí)沒(méi)有加溴化乙錠。電泳緩沖液和凝膠
31、使用次數(shù)過(guò)多。 凝膠濃度過(guò)低,使擴(kuò)增帶跑散。 對(duì)策:依原因,自己總結(jié)引物二聚體的原因有:1、兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對(duì),特別是 引物3端有互補(bǔ)區(qū)。 2、引物模板比例太高,可增加模板用量。 3、退火溫度過(guò)低。4、熱循環(huán)次數(shù)過(guò)多。對(duì)策:增加模板用量。提高退火溫度。減少熱循環(huán)次數(shù)。減少引物3端有互補(bǔ)區(qū)堿基配對(duì)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的原因:模板含有抑制物,含量低。Buffer對(duì)樣品不合適。引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解。退火溫度太高,延伸時(shí)間太短。 對(duì)策:純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量。 更換Buffer或調(diào)整濃度。降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間。 重新設(shè)計(jì)引物(避免鏈間二聚體和鏈
32、內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu))或者換一管新引物。拖尾產(chǎn)生原因:模板不純、Buffer不合適、退火溫度偏低、酶量過(guò)多、 dNTP、Mg2+濃度偏高、循環(huán)次數(shù)過(guò)多 對(duì)策:純化模板、更換Buffer、適當(dāng)提高退火溫度、適量用酶 適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度、減少循環(huán)次數(shù)5、 簡(jiǎn)述熒光定量PCR的原理和定量方法。 原理:基于熒光能量傳遞技術(shù),通過(guò)受體發(fā)色團(tuán)之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán),轉(zhuǎn)移效率與兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成比例,受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號(hào)強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比,檢測(cè)PCR過(guò)程的熒光訊號(hào)便可得知靶序列初始濃度。 定量方法: 熒光染料法,熒光探針?lè)?、熒光定量PCR有哪
33、些類(lèi)型? 熒光染料法、熒光探針?lè)āaqman技術(shù)、LightCycler探針技術(shù)、molecular Beacon技 術(shù)、復(fù)合探針?lè)~解釋?zhuān)夯蚬こ?是指將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞,并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。分子克隆:是指將目的DNA片段與載體重組,然后導(dǎo)入受體細(xì)胞,并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增,以獲得該DNA分子大量拷貝的技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶:是一類(lèi)能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。回文結(jié)構(gòu):指雙鏈DNA分子上按對(duì)稱(chēng)軸排列的反向互補(bǔ)序列(常為限制酶所識(shí)別)。粘性末端:指限制酶錯(cuò)位切開(kāi)兩條對(duì)稱(chēng)軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。平末端:指限制酶平齊切開(kāi)兩條對(duì)稱(chēng)軸
34、互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。同工異源酶:指來(lái)源不同,但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。 同尾酶:指識(shí)別序列不同,但能產(chǎn)生相同粘性末端的酶。載體:指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA。克隆載體:能將載體外源DNA在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的DNA的載體多克隆位點(diǎn):載體上具有的多個(gè)限制酶的單一酶切位點(diǎn)表達(dá)載體:指能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體。報(bào)告基因:是指處于待測(cè)基因下游并通過(guò)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平來(lái)反映上游待測(cè)基因功能的基因,又稱(chēng)報(bào)道基因基因組文庫(kù):是指含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群感受態(tài)細(xì)胞:細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有
35、攝取外源DNA能力的細(xì)胞轉(zhuǎn)化:是指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程問(wèn)答:1、 Klenow片段、Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶和DNA連接酶分別有哪些作用? Klenow片段:補(bǔ)齊雙鏈DNA的3末端,同時(shí)可使3 末端DNA標(biāo)記上同位素。 cDNA克隆中,合成cDNA第二鏈。DNA序列分析。Taq酶:具有53聚合酶活性和依賴(lài)于聚合作用的53外切酶活性。可用于DNA 測(cè)序及通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。 逆轉(zhuǎn)錄酶:依賴(lài)RNA的DNA聚合酶,它以RNA為模板,4種dNTP為底物,催化合成DNA,逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。 RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性(RD
36、DP) 核糖核酸酶H活性(RNaseH) DNA聚合酶活性(DDDP)末端轉(zhuǎn)移酶:在二價(jià)陽(yáng)離子存在下,催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子 的3末端-OH上。 功能主要有:1、在載體或目的基因 3末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾,形成人工粘性末端,便于DNA重組連接。2、用于DNA 3末端的同位素探針標(biāo)記。DNA連接酶:催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5磷酸基團(tuán)與3羥 基形成磷酸二酯鍵,將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來(lái)2、 克隆載體應(yīng)具備什么特征? 能自我復(fù)制并具較高的拷貝數(shù)。 分子量一般 10Kb。 帶有遺傳篩選標(biāo)記。 有適當(dāng)?shù)南拗泼该盖形稽c(diǎn),便于外源DNA的插入和篩選
37、。3、 請(qǐng)比較pBR322載體、pUC系列載體、l噬菌體載體、M13噬菌體載體和粘粒載體的結(jié)構(gòu)特征和用途。 pBR322載體和pUC系列載體的用途: 用于保存和擴(kuò)增 2Kb目的DNA。 構(gòu)建cDNA文庫(kù)。 目的DNA的測(cè)序。 作為核酸雜交時(shí)的探針來(lái)源。 pBR322載體:由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的雙鏈克隆 載體,長(zhǎng)為4.36Kb。含有一個(gè)能保證高拷貝自我復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)(Ori),并裝有四環(huán)素抗性(Tetr)基因和氨芐青霉素抗性(Ampr)基因供菌落篩選。兩個(gè)抗性基因中分別含有BamH I和Pst I等限制酶的單一酶切位點(diǎn),用于插入外源DNA片段pUC系列載體:由p
38、BR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體。多克隆位點(diǎn)互為相反方向排列外,其它序列均相同。含Ampr,可供菌落篩選。載體中裝入一個(gè)來(lái)自大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因,該基因序列中含有多克隆位點(diǎn)。 噬菌體載體:噬菌體載體:全長(zhǎng)約48.5Kb,其中60%(約30Kb)是溶菌生長(zhǎng)所必需,中間40%的區(qū)域?yàn)榉潜匦瑁杀煌庠碊NA片段代替而不影響噬菌體的生存。5末端 含12核苷酸的互補(bǔ)單鏈順序,是天然的粘性末端,稱(chēng)為cos位點(diǎn),噬菌體感染宿主菌后,其粘端通過(guò)堿基配對(duì)而結(jié)合,形成環(huán)狀DNA分子用途: 用作一般的克隆載體。 用于構(gòu)建基因組或cDNA文庫(kù)(22Kb)。 用于抗體庫(kù)或隨機(jī)肽庫(kù)
39、的構(gòu)建。 核酸的序列分析。M13噬菌體:為6.4Kb左右的閉環(huán)正鏈DNA分子??寺〉耐庠椿蚱?kb。M13中引入的多克隆位點(diǎn),正好插入LacZ基因內(nèi),可利用藍(lán)白色噬菌斑篩選重組體。粘粒克隆載體:由質(zhì)粒和噬菌體的cos位點(diǎn)構(gòu)建而成。組成: 質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(diǎn)(Ori)。攜帶抗藥基因。 用于插入目的基因的單一酶切位點(diǎn)。噬菌體的cos位點(diǎn)。特點(diǎn):粘粒載體大小為46Kb,而插入外源基因長(zhǎng)達(dá)4050kb。 加入噬菌體頭部和尾部蛋白,可將粘粒包裝成類(lèi)似于噬菌體的具感染能力的顆粒,容易進(jìn)入大腸桿菌。粘粒進(jìn)入細(xì)菌后則完全失去噬菌體的功能,而表現(xiàn)質(zhì)粒的特性。 用途: 克隆大片段DNA。 構(gòu)建基因組文庫(kù)。4、
40、 簡(jiǎn)述大腸桿菌表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。 在克隆載體的基礎(chǔ)上導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控元件:?jiǎn)?dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。5、 簡(jiǎn)述基因工程的基本步驟。目的基因的獲取載體的選擇目的基因和載體的連接重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞重組體的篩選和鑒定6、 目的基因的獲取有哪些途徑?1)從基因文庫(kù)中獲取2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3)人工合成DNA片段4)直接從染色體DNA中分離目的基因7、有哪些目的基因和載體連接的方法?1)粘性末端連接:本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點(diǎn)。2) 平末端連接:質(zhì)粒和目的基因上沒(méi)有相同的酶切位點(diǎn)3)人工接頭:本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒(méi)有相同的酶切位點(diǎn)4)通過(guò)同聚尾連接:本法適用于在
41、質(zhì)粒和目的基因上沒(méi)有相同的酶切位點(diǎn)8、有哪些制備感受態(tài)細(xì)胞的方法?CaCl2處理,增加大腸桿菌細(xì)胞膜通透性。電擊法,高壓脈沖使細(xì)胞膜形成暫時(shí)性微孔。9、 簡(jiǎn)述雙抗生素篩選法和藍(lán)白斑篩選法的原理。雙抗生素篩選法:某些質(zhì)粒載體如 pBR322質(zhì)粒中有Ampr和Tetr 抗性基因,在這兩 個(gè)基因中裝有幾個(gè)常用的MCS,如將外源DNA片段插入BamH識(shí)別序列時(shí),則此質(zhì)粒由Tetr變?yōu)閷?duì)四環(huán)素敏感(Tets )。這種重組子導(dǎo)入宿主菌后,宿主菌在含四環(huán)素瓊脂糖平皿上不能生長(zhǎng)而在含氨芐青霉素的平皿上能夠生長(zhǎng)。在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌只含有空載體,此篩選方法稱(chēng)為雙抗生素篩選法藍(lán)白斑篩選法
42、:某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因,該基因含一段編 碼-半乳糖苷酶氨基末端145個(gè)氨基酸-肽的DNA片段, IPTG可誘導(dǎo)此片段合成,此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)-互補(bǔ),形成完整的-半乳糖苷酶,催化指示劑底物X-gal 形成藍(lán)色產(chǎn)物,結(jié)果重組克隆呈藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ基因中MCS,lac-肽基因閱讀框架被破壞,細(xì)菌內(nèi)將無(wú)-半乳糖苷酶活性,結(jié)果重組克隆呈白色菌落,這是常用的藍(lán)白斑篩選法。10、 重組體的篩選和鑒定分別有哪些方法?重組體的篩選1、 根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)志篩選 2、 根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇3、 -半乳糖苷酶基因失活篩選(藍(lán)白
43、斑篩選法)4、 根據(jù)插入的外源性基因的性狀進(jìn)行篩選5、 核酸雜交技術(shù)篩選 重組體的鑒定 1、根據(jù)重組子大小鑒定 2、酶切鑒定 3,PCR鑒定 4.DNA序列分析鑒定第七章1基因表達(dá)(gene expression):DNA分子將其所承載的遺傳信息,通過(guò)密碼子-反密碼子系統(tǒng),指導(dǎo)合成功能RNA分子和蛋白質(zhì)分子的過(guò)程。2.基因表達(dá)調(diào)控(gene regulation or gene control):對(duì)基因表達(dá)過(guò)程的調(diào)節(jié)?;虮磉_(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義,適應(yīng)環(huán)境、維持生長(zhǎng)和增殖;維持個(gè)體發(fā)育與分化。3.正轉(zhuǎn)錄調(diào)控(positive):調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白(activator)。也可根據(jù)激活蛋白的作用
44、性質(zhì)分為:正控誘導(dǎo)系統(tǒng):效應(yīng)物使激活蛋白處于活性狀態(tài)。正控阻遏系統(tǒng):效應(yīng)物使活性蛋白處于非活性狀態(tài)4.負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控(negative):調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白(repressor)。根據(jù)其作用特征又可分為:負(fù)控誘導(dǎo):阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄;負(fù)控阻遏:阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄5.可誘導(dǎo)調(diào)節(jié):編碼糖和氨基酸分解代謝蛋白的基因6.弱化子:在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列,位于trpE基因的起始密碼前162bp的前導(dǎo)區(qū)中的123-150位堿基序列。該區(qū)的mRNA可形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu),有終止的作用。稱(chēng)為弱化子。7.細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng):細(xì)菌碰到緊急狀況(如氨基酸的全
45、面匱乏),會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng),包括生產(chǎn)各種RNA、糖、脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程均被停止,而打開(kāi)一些合成氨基酸的基因。應(yīng)急反應(yīng)的信號(hào)是鳥(niǎo)苷四磷酸(ppGpp)和鳥(niǎo)苷五磷酸(pppGpp),誘導(dǎo)物是空載tRNA。8. 前導(dǎo)肽:在色氨酸操縱子的前導(dǎo)序列中可能存在前導(dǎo)肽,14個(gè)氨基酸。在第10和11位上有相鄰的兩個(gè)色氨酸密碼子。前導(dǎo)區(qū)的序列分析:具有4個(gè)分別以1、2、3、4表示的片段,能以?xún)煞N不同的方式進(jìn)行堿基配對(duì):1-2、3-4,或2-3配對(duì)。9. 轉(zhuǎn)錄弱化作用:mRNA轉(zhuǎn)錄的終止是通過(guò)前導(dǎo)肽基因的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)的。前導(dǎo)肽基因中有兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子,這個(gè)前導(dǎo)肽的翻譯必定對(duì)tRNAT
46、rp的濃度敏感。 10. 信號(hào)傳導(dǎo)(signal transduction):細(xì)胞通過(guò)傳感器(sensor)接收外界信號(hào),然后傳到調(diào)節(jié)部位。11.二組分調(diào)控系統(tǒng)(two-component systems):由位于細(xì)胞質(zhì)膜上的傳感蛋白(sensor protein)和位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(response regulator protein)組成。12. 魔斑(magic spot):鳥(niǎo)苷四磷酸(ppGpp)和鳥(niǎo)苷五磷酸(pppGpp),可在層析譜上檢出。細(xì)菌缺乏氨基酸時(shí),會(huì)大量合成這兩種化合物。影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合。作為警報(bào)素,產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)。抑制核糖體和其他大分子的合成,抑制與
47、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)關(guān)的系統(tǒng)?;罨承┌被岵倏v子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),活化蛋白水解酶等。 空載tRNA激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶 GTP+ATP pppGpp+AMPppGpp 13.可阻遏調(diào)節(jié):合成代謝過(guò)程中所必需的小分子物質(zhì)(氨基酸、嘌呤、嘧啶等)的基因。14操縱子(operon):是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位,由啟動(dòng)子、操縱序列及其所控制的一組功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因所組成。操縱子是原核基因表達(dá)調(diào)控的一種重要形式。15斷裂基因:真核生物結(jié)構(gòu)基因,由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開(kāi)但又連續(xù)鑲嵌而成,去除非編碼區(qū)再連接后,可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì),這些基因稱(chēng)為斷裂基因(split gene)16順式作用元件:存在于
48、基因旁側(cè)序列中能影響基因表達(dá)的序列,包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列、和可誘導(dǎo)元件等,本身不編碼任何蛋白質(zhì),僅僅提供一個(gè)作用位點(diǎn),與反式作用因子相互作用參與基因表達(dá)調(diào)控。17.魔斑核苷酸:受?chē)?yán)緊控制的細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中一旦缺乏氨基酸供應(yīng),細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng),使蛋白質(zhì)和RNA的合成速率迅速降下來(lái)。魔斑核苷酸指的就是此過(guò)程中大量GTP合成的鳥(niǎo)苷四磷酸(ppGpp)和鳥(niǎo)苷五磷酸(pppGpp),它們的主要作用可能是影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合的專(zhuān)一性,誘發(fā)應(yīng)急反應(yīng),幫助細(xì)菌渡過(guò)難關(guān)。1. 乳糖(lac)操縱子的負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制? (1)結(jié)構(gòu):與乳糖分解的三個(gè)相關(guān)基因:lacZ、lacY和la
49、cA,結(jié)構(gòu)基因上游為操縱基因lacO、啟動(dòng)子P、調(diào)節(jié)基因lacI,CAP結(jié)合位點(diǎn),lacO為阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn),lacI編碼阻遏蛋白,能識(shí)別操縱基因,并與之相結(jié)合,阻遏lacZYA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。(2)調(diào)控機(jī)制:乳糖操縱子是大腸桿菌中調(diào)節(jié)乳糖代謝的自動(dòng)控制系統(tǒng)。CAP是正性調(diào)節(jié)因素,乳糖阻遏蛋白是負(fù)性調(diào)節(jié)因素有葡萄糖存在時(shí)細(xì)菌優(yōu)先選擇葡萄糖供應(yīng)能量,葡萄糖通過(guò)降低cAMP濃度,阻礙cAMP與CAP結(jié)合而抑制乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄,使細(xì)菌只能利用葡萄糖。沒(méi)有葡萄糖而只有乳糖存在的條件下,阻遏蛋白與lacO序列結(jié)聚,CAP結(jié)合cAMP后作用于乳糖操縱子的CAP結(jié)合位點(diǎn),激活轉(zhuǎn)錄,使得細(xì)菌利用乳糖,將乳糖
50、分解為半乳糖和葡糖糖,提供能量。2. 原核基因調(diào)控基本概念,分類(lèi):基因表達(dá)調(diào)控(gene regulation or gene control):對(duì)基因表達(dá)過(guò)程的調(diào)節(jié)?;虮磉_(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義:適應(yīng)環(huán)境、維持生長(zhǎng)和增殖,維持個(gè)體發(fā)育與分化正轉(zhuǎn)錄調(diào)控:調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白。正控誘導(dǎo):效應(yīng)物使激活蛋白處于活性狀態(tài)。正控阻遏:效應(yīng)物使激活蛋白處于非活性狀態(tài)負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控:調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白。負(fù)控誘導(dǎo):阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。負(fù)控阻遏:阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。3. 原核基因調(diào)控的主要特點(diǎn)誘導(dǎo)與阻遏(可誘導(dǎo)調(diào)節(jié):編碼糖和氨基酸分解代謝蛋白的基因,可阻遏調(diào)節(jié):合成代謝過(guò)程中
51、所必需的小分子物質(zhì)(氨基酸、嘌呤、嘧啶等)的基因。) 弱化子對(duì)基因活性的影響(起信號(hào)作用的是有特殊負(fù)載的氨基酰-tRNA的濃度,不同濃度的AA-tRNA決定了基因最終能否轉(zhuǎn)錄。當(dāng)操縱子被阻遏,RNA合成被終止時(shí),起終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)作用的那一段核苷酸稱(chēng)為弱化子。如色氨酸操縱子、 苯丙氨酸操縱子等。) 降解物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié) 葡萄糖效應(yīng)(降解物抑制作用) 葡萄糖代謝降解物降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度,不能與環(huán)腺苷酸受體蛋白CRP或稱(chēng)代謝降解物激活蛋白(CAP)形成足夠的cAMP-CAP活性復(fù)合物以促使RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合,葡萄糖敏感操縱子不能表達(dá)。 細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng) ( 應(yīng)急反應(yīng)的信號(hào)是鳥(niǎo)苷四磷酸(p
52、pGpp)和鳥(niǎo)苷五磷酸(pppGpp),誘導(dǎo)物是空載tRNA。)4.葡萄糖效應(yīng)及其機(jī)制 葡萄糖效應(yīng)(降解物抑制作用) 大腸桿菌生長(zhǎng)在既有葡萄糖又有其他糖類(lèi)(乳糖等)的介質(zhì)中,只能利用葡萄糖,當(dāng)葡萄糖耗盡后才能利用其他糖類(lèi),即葡萄糖阻斷多種操縱子(葡萄糖敏感操縱子)的表達(dá)。 葡萄糖效應(yīng)機(jī)理(乳糖操縱子負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制) 葡萄糖代謝降解物降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度,不能與環(huán)腺苷酸受體蛋白CRP或稱(chēng)代謝降解物激活蛋白(CAP)形成足夠的cAMP-CAP活性復(fù)合物以促使RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合,葡萄糖敏感操縱子不能表達(dá)5. 色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制? (1)結(jié)構(gòu):調(diào)節(jié)基因trpR、啟動(dòng)子P、
53、操縱基因trpO、前導(dǎo)序列trpL、衰減子trpa,結(jié)構(gòu)基因trpE、trpD、trpC、trpB、trpA(2)調(diào)控機(jī)制:trpR基因產(chǎn)物稱(chēng)為輔阻遏蛋白,與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物,與操縱區(qū)結(jié)合并關(guān)閉trpmRNA轉(zhuǎn)錄效應(yīng)物使色氨酸,是由trp所編碼的生物合成途徑的末端終產(chǎn)物當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸含量高時(shí),核糖體翻譯出前導(dǎo)肽,停止于終止密碼子出,色氨酸與輔阻遏蛋白結(jié)合,與操縱區(qū)結(jié)合,阻遏mRNA的轉(zhuǎn)錄;當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸不足時(shí),輔阻遏蛋白失去色氨酸并從操縱區(qū)上結(jié)離,trp操縱子去阻遏,mRNA轉(zhuǎn)錄。6. lac操縱子中的其他問(wèn)題A基因及其生理功能: 編碼-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶。能夠把乙酰基從供體上轉(zhuǎn)移到半乳糖苷分子上,抑制了-半乳糖苷酶產(chǎn)物的有害衍生物在細(xì)胞內(nèi)積累。 Lac 基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較:1:0.5:0.2。Lac mRNA可能與翻譯過(guò)程中的核糖體相脫離,從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。產(chǎn)生5-3蛋白合成梯度。在lac mRNA分子內(nèi)部,A基因比Z基因更易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解。操縱子的融合與基因工程7. 弱化機(jī)制A. 當(dāng)色氨酸濃度低時(shí),生成
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