生物分離工程02

1、生物分離工程生物分離工程細(xì)胞分離與破碎細(xì)胞分離與破碎總體學(xué)習(xí)目的和要求總體學(xué)習(xí)目的和要求 通過(guò)本章學(xué)習(xí)，要求掌握解通過(guò)本章學(xué)習(xí)，要求掌握解細(xì)胞分離細(xì)胞分離和和目標(biāo)產(chǎn)物目標(biāo)產(chǎn)物的釋放的的釋放的原理原理和方法，熟和方法，熟知各種方法的知各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍。和應(yīng)用范圍。 目錄目錄n重力沉降重力沉降n離心沉降離心沉降n細(xì)胞破碎與胞內(nèi)物釋放細(xì)胞破碎與胞內(nèi)物釋放細(xì)胞分離學(xué)習(xí)要點(diǎn)細(xì)胞分離學(xué)習(xí)要點(diǎn)n識(shí)記：識(shí)記：重力沉降、離心沉降和過(guò)濾的概念。重力沉降、離心沉降和過(guò)濾的概念。n理解：理解：重力沉降、離心分離與過(guò)濾原理、理重力沉降、離心分離與過(guò)濾原理、理論；掌握論；掌握StokesStokes沉降公

2、式沉降公式 。n應(yīng)用：應(yīng)用：常用離心方法及優(yōu)缺點(diǎn)；利用掌握的常用離心方法及優(yōu)缺點(diǎn)；利用掌握的提高分離效率的方法分析決實(shí)際問(wèn)題提高分離效率的方法分析決實(shí)際問(wèn)題 細(xì)胞分離重力沉降定義細(xì)胞分離重力沉降定義 重力沉降是傳統(tǒng)化工過(guò)程中常用的從含有重力沉降是傳統(tǒng)化工過(guò)程中常用的從含有固體顆粒的流體中將顆粒分離出來(lái)的操作。固體顆粒的流體中將顆粒分離出來(lái)的操作。 重力沉降重力沉降是利用流體與顆粒間的密度差，是利用流體與顆粒間的密度差，在重力的作用下使顆粒與流體之間產(chǎn)生在重力的作用下使顆粒與流體之間產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)兩者的分離。相對(duì)運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)兩者的分離。 在生物分離過(guò)程中，定義中顆粒為細(xì)胞、在生物分離過(guò)

3、程中，定義中顆粒為細(xì)胞、細(xì)胞碎片等有形物細(xì)胞碎片等有形物千姿百態(tài)的微生物世界千姿百態(tài)的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture細(xì)胞分離重力沉降理論細(xì)胞分離重力沉降理論n理論假設(shè)理論假設(shè)n細(xì)胞或細(xì)胞碎片按照球形顆粒處理；細(xì)胞或細(xì)胞碎片按照球形顆粒處理；n顆粒在無(wú)限稀釋的溶液中進(jìn)行沉降，顆粒顆粒在無(wú)限稀釋的溶液中進(jìn)行沉降，顆粒之間無(wú)相互干擾之間無(wú)相互干擾 n受力分析受力分析 球形顆粒重力球形顆粒重力fg 液體的浮力液體的浮力fb 顆粒運(yùn)動(dòng)方向相反的阻力顆粒運(yùn)動(dòng)方向相反的阻力 fs細(xì)胞分離重力沉降理論細(xì)胞分離重力沉降理論gd

4、fspg361gdfLpb3614222pgLSdvf重力：重力：浮力：浮力：阻力：阻力：細(xì)胞分離重力沉降理論細(xì)胞分離重力沉降理論當(dāng)球形顆粒自身的重力與其所受到浮力和阻力當(dāng)球形顆粒自身的重力與其所受到浮力和阻力達(dá)到平衡時(shí)，達(dá)到平衡時(shí)， bSgfffgdvpLLSg342則則細(xì)胞分離重力沉降理論細(xì)胞分離重力沉降理論1Re103當(dāng)球形顆粒處于滯流區(qū)（當(dāng)球形顆粒處于滯流區(qū)（ ）時(shí)）時(shí) Re24gdvLLSpg182Stokes公式公式當(dāng)球形顆粒處于過(guò)渡區(qū)（當(dāng)球形顆粒處于過(guò)渡區(qū)（ ）時(shí)）時(shí) 310Re15 . 0Re105 . 06 . 0Re27. 0LLSpggdvAllen公式公式當(dāng)球形顆粒處于

5、湍流區(qū)（當(dāng)球形顆粒處于湍流區(qū)（ ）時(shí)）時(shí)53102Re1044. 05 . 074. 1LLSpggdvNewton公式公式千姿百態(tài)的微生物世界千姿百態(tài)的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture球形顆粒？無(wú)限稀釋溶液？無(wú)限稀釋溶液？細(xì)胞分離重力沉降理論細(xì)胞分離重力沉降理論n模型校正模型校正n形態(tài)校正：顆粒的形狀系數(shù)顆粒的形狀系數(shù)n速度校正：空隙率函數(shù)空隙率函數(shù) n提高重力沉降的途徑提高重力沉降的途徑n加入中性鹽：雙電層排斥電位降低雙電層排斥電位降低n加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大絮凝圖架橋作用形成大絮凝圖n引入外力引

6、入外力PSAA)(F細(xì)胞分離重力沉降理論細(xì)胞分離重力沉降理論n模型校正模型校正 形態(tài)校正形態(tài)校正 速度校正速度校正n提高重力沉降的途徑提高重力沉降的途徑 加入中性鹽；加入中性鹽； 加入高分子絮凝劑加入高分子絮凝劑 引入外力引入外力細(xì)胞分離離心沉降定義細(xì)胞分離離心沉降定義離心沉降離心沉降是利用沉降設(shè)備使流體和顆粒旋是利用沉降設(shè)備使流體和顆粒旋轉(zhuǎn)，在離心力的作用下，由于顆粒和流體轉(zhuǎn)，在離心力的作用下，由于顆粒和流體間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產(chǎn)間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，從而使顆粒和流體分離。生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，從而使顆粒和流體分離。 細(xì)胞分離離心沉降理論細(xì)胞分離離心沉降理論rd

7、vLLSPS2218)(離心沉降速度離心沉降速度 令：令：LLSPdS18)(2rSvS2gdvLLSpg182細(xì)胞分離離心分離方法細(xì)胞分離離心分離方法n差速離心分級(jí)差速離心分級(jí)n區(qū)帶離心區(qū)帶離心 差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心 平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心 差速離心分離差速離心分離 差速離心是以菌體細(xì)胞的收集或除去為目的的固液離心分離方法，應(yīng)用某一特定顆粒沉淀的離心力在預(yù)定的離心時(shí)間內(nèi)得到一部分顆粒沉淀及包含未沉淀顆粒的上清液。差速離心分離應(yīng)用實(shí)例差速離心分離應(yīng)用實(shí)例600g10 min15000g10 min100000g60 min300000g120 minnucleiMitochondrial

8、ysosomesPlasma membraneRiosomal subunitshomogenateFiltered homogenateSoluble part of cytoplasmSedimentation區(qū)帶離心分離前提區(qū)帶離心分離前提 在離心管內(nèi)的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同濃度（密度）的梯度介質(zhì)（蔗糖等），按照濃度從大到小的原則，依次層層加入。加入離心管中的梯度介質(zhì)經(jīng)高速離心或靜置后可形成連續(xù)的密度梯度。 操作過(guò)程操作過(guò)程區(qū)帶離心種類區(qū)帶離心種類n差速區(qū)帶離心(速度區(qū)帶離心）n平衡區(qū)帶離心（等密度離心）差差速速區(qū)區(qū)帶帶離離心心差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心n基于顆粒的大小、形狀

9、的分離n梯度液的最大密度不能超過(guò)所分離顆粒的最大密度n離心過(guò)程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等n動(dòng)態(tài)離心分離方法平平衡衡區(qū)區(qū)帶帶離離心心平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心n梯度液密度范圍含蓋全部待分離顆粒密度n離心過(guò)程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等n平衡離心分離方法梯度液的種類和應(yīng)用梯度液的種類和應(yīng)用細(xì)胞分離區(qū)帶離心異同細(xì)胞分離區(qū)帶離心異同區(qū)帶離心種類區(qū)帶離心種類差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心共同點(diǎn)共同點(diǎn)事先在離心管內(nèi)用低分子量溶質(zhì)調(diào)配好密度梯度事先在離心管內(nèi)用低分子量溶質(zhì)調(diào)配好密度梯度梯度介質(zhì)梯度介質(zhì)常用蔗糖常用蔗糖常用氯化銫常用氯化銫密度梯度密度梯度最大的

10、密度梯度低于最大密最大的密度梯度低于最大密度的沉降樣品度的沉降樣品最大的密度梯度大于最大密最大的密度梯度大于最大密度的沉降樣品度的沉降樣品區(qū)帶形成條件區(qū)帶形成條件根據(jù)各個(gè)組分沉降系數(shù)的差根據(jù)各個(gè)組分沉降系數(shù)的差別，形成各自的區(qū)帶別，形成各自的區(qū)帶根據(jù)各組分密度差形成區(qū)帶根據(jù)各組分密度差形成區(qū)帶離心條件離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度前停止，短時(shí)間，低速度使各組分沉降到其平衡的密使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間，高速度度區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間，高速度 細(xì)胞分離離心設(shè)備分類細(xì)胞分離離心設(shè)備分類分類方法分類方法名稱名稱處理量處理量實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)，工業(yè)用離心機(jī)實(shí)驗(yàn)

11、室用離心機(jī)，工業(yè)用離心機(jī)溫度溫度常溫離心機(jī)、冷凍離心機(jī)常溫離心機(jī)、冷凍離心機(jī)轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)管式、碟式管式、碟式細(xì)胞分離常用離心設(shè)備細(xì)胞分離常用離心設(shè)備Solids-ejecting disk bowl centrifuge of pilot size for sterilizable contained installation Nozzle machine with pressurized solids discharge for yeast and bacteria separation 細(xì)胞分離常用離心設(shè)備細(xì)胞

12、分離常用離心設(shè)備Decanter centrifuge Multichamber bowl, vertical cut 細(xì)胞分離管式離心設(shè)備細(xì)胞分離管式離心設(shè)備A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraper細(xì)胞分離碟片離心設(shè)備細(xì)胞分離碟片離心設(shè)備(a) Solids-retaining disk bowl, (b) Radial solids-ejecting disk bowl, top feed. (c) Radial solids-ejecting disk bowl, hermetic f

13、eed.(d) Axial solids-ejecting disk bowl. (e) Nozzle bowl with pressurized solids discharge. (f) Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles.細(xì)胞分離離心設(shè)備比較細(xì)胞分離離心設(shè)備比較管式離心機(jī)管式離心機(jī)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)速和離心力較大結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)速和離心力較大缺點(diǎn)缺點(diǎn)沉降面積小、處理能力低；沉降面積小、處理能力低；碟式離心機(jī)碟式離心機(jī)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)子中存在隔板以增大沉降面積，處理能力大轉(zhuǎn)子中存在隔板以增大沉降面積，處理能力大缺點(diǎn)缺點(diǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、轉(zhuǎn)速較低；結(jié)構(gòu)

14、復(fù)雜、轉(zhuǎn)速較低；細(xì)胞分離離心機(jī)處理能力細(xì)胞分離離心機(jī)處理能力粒子在徑向上的沉降速度粒子在徑向上的沉降速度 grvdtdrvgs2軸向移動(dòng)速度軸向移動(dòng)速度 2122rrQdtdzuz完全沉降的邊界條件完全沉降的邊界條件 0z1rr Lz 2rr 1222122lnrrgrrLvQg細(xì)胞分離離心機(jī)處理能力細(xì)胞分離離心機(jī)處理能力影響因素影響因素 處理樣品的特性，如密度、粒徑等處理樣品的特性，如密度、粒徑等 溶液的特性，如密度、粘度等溶液的特性，如密度、粘度等 離心機(jī)機(jī)械結(jié)構(gòu)，如離心機(jī)機(jī)械結(jié)構(gòu)，如r1和和r2 操作條件，操作條件， 細(xì)胞分離過(guò)濾定義細(xì)胞分離過(guò)濾定義過(guò)濾是利用多孔性介質(zhì)（如濾布）截留過(guò)濾

15、是利用多孔性介質(zhì)（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法。離的方法。 過(guò)濾本身是一種膜分離技術(shù)。在分離細(xì)胞、菌體或過(guò)濾本身是一種膜分離技術(shù)。在分離細(xì)胞、菌體或它們的碎片過(guò)程中除了沉降分離方法外，過(guò)濾技術(shù)也是它們的碎片過(guò)程中除了沉降分離方法外，過(guò)濾技術(shù)也是一種常備的分離方法。一種常備的分離方法。細(xì)胞分離過(guò)濾過(guò)程受力分析細(xì)胞分離過(guò)濾過(guò)程受力分析推動(dòng)力：推動(dòng)力：過(guò)濾操作以壓力差為主要推動(dòng)力；過(guò)濾操作以壓力差為主要推動(dòng)力； 阻阻 力：力：過(guò)濾過(guò)程的阻力來(lái)自多孔性過(guò)濾介過(guò)濾過(guò)程的阻力來(lái)自多孔性過(guò)濾介 質(zhì)和介質(zhì)表面不斷堆積形成的濾餅質(zhì)和介質(zhì)表面不斷堆積形成

16、的濾餅 細(xì)胞分離過(guò)濾速率細(xì)胞分離過(guò)濾速率cmLRRpAdtdQRm表示介質(zhì)的阻力；表示介質(zhì)的阻力；Rc表示濾餅的阻力；表示濾餅的阻力；L為濾液的粘度為濾液的粘度 細(xì)胞分離恒壓過(guò)濾方程細(xì)胞分離恒壓過(guò)濾方程Ruth恒壓過(guò)濾方程恒壓過(guò)濾方程 020ttKQQ其中，其中，K為為Ruth恒壓過(guò)濾系數(shù)，表示為恒壓過(guò)濾系數(shù)，表示為SLLSccpAK122細(xì)胞分離細(xì)胞分離提高過(guò)濾速度的途徑提高過(guò)濾速度的途徑n采用絮凝或凝聚的方法預(yù)處理改變料液采用絮凝或凝聚的方法預(yù)處理改變料液的性質(zhì)，降低濾餅阻力的性質(zhì)，降低濾餅阻力n加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓縮性指數(shù)，加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓縮性指數(shù)，提高過(guò)濾速度提高過(guò)濾速度

17、胞內(nèi)產(chǎn)物釋放胞內(nèi)產(chǎn)物釋放學(xué)習(xí)要點(diǎn)學(xué)習(xí)要點(diǎn)n理解：理解：各種細(xì)胞破碎方法原理、優(yōu)缺點(diǎn)各種細(xì)胞破碎方法原理、優(yōu)缺點(diǎn)及其適用范圍。及其適用范圍。 n應(yīng)用：應(yīng)用：采用不同的細(xì)胞破碎方法對(duì)不同采用不同的細(xì)胞破碎方法對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行不同程度的破碎。細(xì)胞進(jìn)行不同程度的破碎。 胞內(nèi)產(chǎn)物釋放胞內(nèi)產(chǎn)物釋放細(xì)胞結(jié)構(gòu)（真核細(xì)胞與原核細(xì)胞）細(xì)胞結(jié)構(gòu)（真核細(xì)胞與原核細(xì)胞）動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，只有由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞膜沒(méi)有細(xì)胞壁，只有由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞膜植物細(xì)胞植物細(xì)胞細(xì)胞膜外有一層堅(jiān)固的細(xì)胞壁細(xì)胞膜外有一層堅(jiān)固的細(xì)胞壁酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞細(xì)胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，更加難以破碎細(xì)胞壁由葡聚糖、甘露聚

18、糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，更加難以破碎真核細(xì)胞真核細(xì)胞原核細(xì)胞原核細(xì)胞革蘭氏陽(yáng)性菌革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁由肽聚糖層組成，壁厚約細(xì)胞壁由肽聚糖層組成，壁厚約1550 nm，肽聚糖含量為肽聚糖含量為4090%，細(xì)胞壁較革蘭氏陰性菌堅(jiān)固。，細(xì)胞壁較革蘭氏陰性菌堅(jiān)固。革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁在肽聚糖的外側(cè)還有分別由（細(xì)胞壁在肽聚糖的外側(cè)還有分別由（1）脂蛋白和（）脂蛋白和（2）磷脂和脂多）磷脂和脂多糖構(gòu)成的兩層外壁層，外壁層厚度越糖構(gòu)成的兩層外壁層，外壁層厚度越810 nm。胞內(nèi)產(chǎn)物釋放胞內(nèi)產(chǎn)物釋放細(xì)胞膜組成細(xì)胞膜組成（A）（B）胞內(nèi)產(chǎn)物釋放胞內(nèi)產(chǎn)物釋放影響產(chǎn)物釋放的環(huán)境因素影響產(chǎn)物釋放的環(huán)境因素n在復(fù)雜在復(fù)

19、雜培養(yǎng)基培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞其破碎較單中生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞其破碎較單一培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞更難；一培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞更難；n對(duì)數(shù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)期的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)得更加脆弱。的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)得更加脆弱。n從連續(xù)從連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程培養(yǎng)過(guò)程中獲得的、具有較高比生長(zhǎng)速率中獲得的、具有較高比生長(zhǎng)速率的念珠菌的細(xì)胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠的念珠菌的細(xì)胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠菌體則有更加充裕的機(jī)會(huì)構(gòu)建更加堅(jiān)固的細(xì)胞壁。菌體則有更加充裕的機(jī)會(huì)構(gòu)建更加堅(jiān)固的細(xì)胞壁。n酵母細(xì)胞壁的厚度和破碎阻力隨酵母細(xì)胞壁的厚度和破碎阻力隨年齡年齡增長(zhǎng)而增加增長(zhǎng)而增加n經(jīng)常在幼酵母細(xì)胞中出現(xiàn)的經(jīng)常在幼酵母細(xì)胞中

20、出現(xiàn)的芽痕芽痕（Bud scars）可引起酵母細(xì)胞局部細(xì)胞壁強(qiáng)度的降低可引起酵母細(xì)胞局部細(xì)胞壁強(qiáng)度的降低 胞內(nèi)產(chǎn)物釋放胞內(nèi)產(chǎn)物釋放細(xì)胞破碎原理細(xì)胞破碎原理細(xì)胞細(xì)胞破碎破碎機(jī)械破碎機(jī)械破碎高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波破碎破碎非機(jī)械破碎非機(jī)械破碎物理法物理法滲透壓沖擊、凍結(jié)滲透壓沖擊、凍結(jié)-融化、融化、（超聲波）（超聲波）化學(xué)法化學(xué)法酸堿處理、化學(xué)試劑處理酸堿處理、化學(xué)試劑處理生物法生物法酶溶、自溶、噬菌體酶溶、自溶、噬菌體胞內(nèi)產(chǎn)物釋放胞內(nèi)產(chǎn)物釋放機(jī)械破碎之高壓勻漿機(jī)械破碎之高壓勻漿細(xì)胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速（可細(xì)胞懸浮液在高壓的

21、作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速（可達(dá)到達(dá)到450 m/s）噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。用下破碎。 胞內(nèi)產(chǎn)物釋放胞內(nèi)產(chǎn)物釋放機(jī)械破碎之珠磨機(jī)械破碎之珠磨珠磨機(jī)的破碎室內(nèi)填充有珠磨機(jī)的破碎室內(nèi)填充有8085（v/v）的玻璃（密度為的玻璃（密度為2.5 g/ml）或氧化鋯（密度為或氧化鋯（密度為6.0 g/ml）的微球（粒徑約的微球（粒徑約0.11.0 mm）。）。在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球與微球在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球與微球之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。 胞內(nèi)產(chǎn)物釋放胞內(nèi)產(chǎn)物釋放機(jī)械破碎之撞擊破碎機(jī)械破碎之撞擊破碎撞擊破