生物樣本樣品前處理

1、.生物樣品前處理生物樣品前處理范亞新.簡(jiǎn)介.前處理技術(shù)1 1、直接稀釋法：、直接稀釋法：簡(jiǎn)單、回收率高、成本低，但選擇性差，應(yīng)用有限簡(jiǎn)單、回收率高、成本低，但選擇性差，應(yīng)用有限2 2、超濾法：、超濾法：多用于測(cè)定游離藥物濃度多用于測(cè)定游離藥物濃度3 3、蛋白沉淀法：、蛋白沉淀法：幾乎適用于所有小分子化合物，簡(jiǎn)單快速，回收率高，幾乎適用于所有小分子化合物，簡(jiǎn)單快速，回收率高，但選擇性差，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重但選擇性差，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重4 4、液液提取法：、液液提取法：基質(zhì)效應(yīng)降低，低成本，重復(fù)性好；但難以自動(dòng)化，基質(zhì)效應(yīng)降低，低成本，重復(fù)性好；但難以自動(dòng)化，不適用于水溶性化合物的提取，極性相差較大的化合物同

2、時(shí)提取困難不適用于水溶性化合物的提取，極性相差較大的化合物同時(shí)提取困難5 5、固相萃取法：、固相萃取法：可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，基質(zhì)效應(yīng)降低，同時(shí)完成樣品的富集可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，基質(zhì)效應(yīng)降低，同時(shí)完成樣品的富集與凈化；但成本較高與凈化；但成本較高.液液提取法 利用目標(biāo)化合物在生物基質(zhì)和與水不互溶的有機(jī)溶劑中溶解度或分配利用目標(biāo)化合物在生物基質(zhì)和與水不互溶的有機(jī)溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使化合物從生物基質(zhì)中轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。系數(shù)的不同，使化合物從生物基質(zhì)中轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。兩相的分離需借助兩相的密度差來(lái)實(shí)現(xiàn)兩相的分離需借助兩相的密度差來(lái)實(shí)現(xiàn)原理：相似相溶原理：相似相溶分配系數(shù)：分配系數(shù)：k kA A=y=yA

3、 A/x/xA A y yA A和和x xA A分別表示在萃取相和萃余相中的質(zhì)量比率分別表示在萃取相和萃余相中的質(zhì)量比率選擇性系數(shù)（分離系數(shù)）：選擇性系數(shù)（分離系數(shù)）：=k=kA A/k/kB B= =萃取劑的選擇：萃取劑的選擇：1 1、選擇性好：表現(xiàn)為選擇性系數(shù)大。、選擇性好：表現(xiàn)為選擇性系數(shù)大。2 2、萃取容量大：表現(xiàn)為分配系數(shù)大。、萃取容量大：表現(xiàn)為分配系數(shù)大。3 3、萃取劑與原溶劑的互溶度。萃取劑與原溶劑的互溶度。4 4、萃取劑和原溶劑有較大的密度差。、萃取劑和原溶劑有較大的密度差。5 5、化學(xué)穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性耐酸耐堿、抗氧化還原、耐熱、無(wú)腐蝕。耐酸耐堿、抗氧化還原、耐熱、無(wú)腐蝕。6

4、 6、安全性好。、安全性好。7 7、經(jīng)濟(jì)性好。、經(jīng)濟(jì)性好。Tips: PHTips: PH和溫度對(duì)萃取有一定影響。和溫度對(duì)萃取有一定影響。BABAx/xy/y.常用液液提取溶劑溶劑名稱(chēng)溶劑名稱(chēng)分子量分子量沸點(diǎn)（沸點(diǎn)（）密度（密度（g/mL)g/mL)偶極矩（偶極矩（D)D)二氯甲烷84.9401.331.60乙酸乙酯88.177.10.901.78氯代正丁烷92.6770.89乙醚74.134.50.711.15戊烷72.236.10.630 環(huán)己烷84.280.70.780正己烷86.2690.660.08甲苯92.2110.60.870.36異丙醇*60.182.40.791.66四氫呋喃

5、*72.1660.891.63乙腈*41.181.60.783.92正丁醇*74.11171.001.50水*18.01001.001.84注：注：“*”表示與水互溶表示與水互溶偶極矩越小，極性越小偶極矩越小，極性越小.固相提取法HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的優(yōu)點(diǎn)材料的優(yōu)點(diǎn)水可浸潤(rùn)水可浸潤(rùn)反相保留反相保留PH1-14PH1-14范圍內(nèi)穩(wěn)定范圍內(nèi)穩(wěn)定沒(méi)有裸露硅羥基沒(méi)有裸露硅羥基.固相提取法.固相提取法.固相提取法改變化合物改變化合物PHPH，酸性，酸性保留，堿性洗脫保留，堿性洗脫.固相提取法改變化合物改變化合物PHPH，堿性，堿性

6、保留，酸性洗脫保留，酸性洗脫.固相提取法改變吸附劑改變吸附劑PHPH，堿性，堿性保留，酸性洗脫保留，酸性洗脫.固相提取法改變吸附劑改變吸附劑PHPH，酸性，酸性保留，堿性洗脫保留，堿性洗脫.LC-MS-MS方法需考慮的問(wèn)題基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)樣品中除被檢測(cè)化合物外的成分，對(duì)化合物測(cè)定造成影響的效應(yīng)。樣品中除被檢測(cè)化合物外的成分，對(duì)化合物測(cè)定造成影響的效應(yīng)。兩種方式檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)：柱后灌流法（定性），樣品處理比較法（定量）。兩種方式檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)：柱后灌流法（定性），樣品處理比較法（定量）。解決方案：解決方案：1 1、改變樣品前處理方法。（液液提取和固相提取法可降低基質(zhì)效應(yīng)）、改變樣品前處理方法。（液液

7、提取和固相提取法可降低基質(zhì)效應(yīng)）2 2、優(yōu)化色譜條件。（將干擾物和待測(cè)物分離）、優(yōu)化色譜條件。（將干擾物和待測(cè)物分離）3 3、優(yōu)化質(zhì)譜條件。（更換離子源，、優(yōu)化質(zhì)譜條件。（更換離子源，APCIAPCI源優(yōu)于源優(yōu)于ESIESI源）源）4 4、同位素內(nèi)標(biāo)。（終極辦法，最有效）、同位素內(nèi)標(biāo)。（終極辦法，最有效）生物基質(zhì)中的磷脂化合物易導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，大多數(shù)表現(xiàn)為基質(zhì)抑制。生物基質(zhì)中的磷脂化合物易導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，大多數(shù)表現(xiàn)為基質(zhì)抑制。建議：建議：LC-MS-MSLC-MS-MS方法時(shí)監(jiān)測(cè)方法時(shí)監(jiān)測(cè) m/zm/z184 184 m/zm/z184184離子對(duì)。離子對(duì)。.LC-MS-MS方法需考慮的問(wèn)題非特異性吸附非特異性吸附在低蛋白含量的生物基質(zhì)（尿液，腦脊液，透析液等）中，化合物在存放在低蛋白含量的生物基質(zhì)（尿液，腦脊液，透析液等）中，化合物在存放/ /轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移過(guò)程中與容器材料發(fā)生特異性結(jié)合的現(xiàn)象。過(guò)程中與容器材料發(fā)生特異性結(jié)合的現(xiàn)象。在相應(yīng)的生物基質(zhì)中或水中測(cè)試，做轉(zhuǎn)管實(shí)驗(yàn)。在相應(yīng)的生物基質(zhì)中或水中測(cè)試，做轉(zhuǎn)管實(shí)驗(yàn)。通常更換儲(chǔ)存材料，或者在基質(zhì)中加入一定量表面活性劑可消除非特異性吸附現(xiàn)象。通常更換儲(chǔ)存材料，或者在基質(zhì)中加入一定量表面活性劑可消除非特異性吸附現(xiàn)象。 常見(jiàn)表面活性劑：常見(jiàn)表面活性劑：Trit