生物轉(zhuǎn)化常見反應(yīng)類型

1、第三章第三章 介紹生物轉(zhuǎn)化的常見反應(yīng)類型介紹生物轉(zhuǎn)化的常見反應(yīng)類型以甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化為例進(jìn)行闡述以甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化為例進(jìn)行闡述 甾體化合物和甾體藥物簡介 甾體化合物結(jié)構(gòu) 甾類化合物常見種類甾體化合物和甾體藥物簡介甾體化合物和甾體藥物簡介 1952年，美國普強(qiáng)藥廠的年，美國普強(qiáng)藥廠的Morray和和Pereroon首次利用黑根霉將黃體同轉(zhuǎn)化為首次利用黑根霉將黃體同轉(zhuǎn)化為11 黃體酮，人們開始認(rèn)識到甾體微生物轉(zhuǎn)黃體酮，人們開始認(rèn)識到甾體微生物轉(zhuǎn)化在甾體藥物生產(chǎn)中的重要性。化在甾體藥物生產(chǎn)中的重要性。 微生物幾乎對甾體的每個位置都能進(jìn)行轉(zhuǎn)微生物幾乎對甾體的每個位置都能進(jìn)行轉(zhuǎn)化?；?。 幾種重要

2、的甾體微生物轉(zhuǎn)化發(fā)應(yīng)如羥化，幾種重要的甾體微生物轉(zhuǎn)化發(fā)應(yīng)如羥化，脫氫成為工業(yè)上生產(chǎn)甾體激素及其類似物脫氫成為工業(yè)上生產(chǎn)甾體激素及其類似物的重要手段的重要手段甾體化合物甾體化合物 一類含有環(huán)戊烷多菲核的化合物 在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羥基、酮基；A，B環(huán)有部分雙鍵；17位有不同的測鏈。目前甾體微生物轉(zhuǎn)化中受到人們廣泛關(guān)注的領(lǐng)域目前甾體微生物轉(zhuǎn)化中受到人們廣泛關(guān)注的領(lǐng)域?qū)⑽⑸锘蚬こ痰男录夹g(shù)應(yīng)用于甾體微將微生物基因工程的新技術(shù)應(yīng)用于甾體微生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化提高水不容性底物的溶解度提高水不容性底物的溶解度細(xì)胞和酶的固定化以利于酶的重復(fù)經(jīng)濟(jì)利細(xì)胞和酶的固定化以利

3、于酶的重復(fù)經(jīng)濟(jì)利用用發(fā)展經(jīng)濟(jì)有效的產(chǎn)物連續(xù)回收方式發(fā)展經(jīng)濟(jì)有效的產(chǎn)物連續(xù)回收方式將環(huán)糊精等應(yīng)用于培養(yǎng)基以提高產(chǎn)量將環(huán)糊精等應(yīng)用于培養(yǎng)基以提高產(chǎn)量甾體化合物結(jié)構(gòu)甾體化合物結(jié)構(gòu)菲環(huán)戊烷多氫菲甾體化合物編號甾體化合物編號2345167891413121115環(huán)戊烷多氫菲101617甾類化合物常見種類甾類化合物常見種類 動物組織中動物組織中：膽固醇、膽酸、皮脂素、膽固醇、膽酸、皮脂素、皮脂醇（氫化可的松）、皮脂酮等皮脂醇（氫化可的松）、皮脂酮等 睪酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激睪酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。素。 植物中植物中：薯芋皂豆甾醇薯芋皂豆甾醇 酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞：麥角固醇麥角固醇甾體化

4、合物編號甾體化合物編號2345167891413121115環(huán)戊烷多氫菲101617甾類化合物常見種類甾類化合物常見種類 動物組織中動物組織中：膽固醇、膽酸、皮脂素、膽固醇、膽酸、皮脂素、皮脂醇（氫化可的松）、皮脂酮等皮脂醇（氫化可的松）、皮脂酮等 睪酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激睪酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。素。 植物中植物中：薯芋皂豆甾醇薯芋皂豆甾醇 酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞：麥角固醇麥角固醇甾體類激素藥甾體類激素藥 腎上腺皮脂激素類腎上腺皮脂激素類 可的松、強(qiáng)的松、氫化可的松可的松、強(qiáng)的松、氫化可的松 功能：功能：抗炎、抗毒、抗過敏抗炎、抗毒、抗過敏 對風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等

5、有治療對風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等有治療作用。作用。 生殖腺激素生殖腺激素 孕酮、雌酮孕酮、雌酮 功能：功能：調(diào)節(jié)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)內(nèi)分泌 人工合成避孕藥人工合成避孕藥 長效孕酮等長效孕酮等微生物在甾體藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用微生物在甾體藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用 主要分為兩大類主要分為兩大類 將天然原料轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)甾體化合物的普通中間體。將天然原料轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)甾體化合物的普通中間體。 如植物皂角苷羥化生成皂角苷配基如植物皂角苷羥化生成皂角苷配基 降解甾醇邊鏈生成有用的甾體化合物中間體，降解甾醇邊鏈生成有用的甾體化合物中間體， 雄甾雄甾4烯烯3，17二酮；二酮； 雄甾雄甾1，4二烯二烯3，17二酮。二酮。 轉(zhuǎn)化成特殊

6、的甾體化合物的中間體，以生產(chǎn)我們所轉(zhuǎn)化成特殊的甾體化合物的中間體，以生產(chǎn)我們所需要的產(chǎn)物。需要的產(chǎn)物。 如：甾體如：甾體11 ，11 及及16 羥化，羥化， 1 脫氫脫氫 甾體邊鏈降解甾體邊鏈降解微生物對甾體化合物的轉(zhuǎn)化微生物對甾體化合物的轉(zhuǎn)化 微生物對甾體化合物的轉(zhuǎn)化多種多樣微生物對甾體化合物的轉(zhuǎn)化多種多樣 它們對甾體的每一位置上的原子或基團(tuán)都有可能它們對甾體的每一位置上的原子或基團(tuán)都有可能進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。 其反應(yīng)類型主要有氧化、還原、水解、酯化等等。其反應(yīng)類型主要有氧化、還原、水解、酯化等等。 包括甾體母核上和測鏈上的某個位置的羥基化、包括甾體母核上和測鏈上的某個位置的羥基化、

7、酮基化、環(huán)氧化、脫氫形成雙鏈、芳香化、開環(huán)、酮基化、環(huán)氧化、脫氫形成雙鏈、芳香化、開環(huán)、形成內(nèi)酯、側(cè)鏈斷裂、降解。形成內(nèi)酯、側(cè)鏈斷裂、降解。羥基化反應(yīng)羥基化反應(yīng)是甾體微生物轉(zhuǎn)化中最重要的反應(yīng)?；瘜W(xué)法除了較容易在C17引入羥基外，在其他位置都很難引入羥基。 微生物對甾體的羥基化作用微生物對甾體的羥基化作用 微生物能在甾體的任何位置進(jìn)行羥基化發(fā)應(yīng)，微生物能在甾體的任何位置進(jìn)行羥基化發(fā)應(yīng)，也可在非甾類有機(jī)分子上羥基化。也可在非甾類有機(jī)分子上羥基化。 簡單的羥基化作用是在甾體的某個位置上引入簡單的羥基化作用是在甾體的某個位置上引入O原子。原子。 在甾核上至少有在甾核上至少有21個位置可以發(fā)生。個位置可

8、以發(fā)生。 11位羥基化作用最重要，位羥基化作用最重要，11位位C的氧化對可的的氧化對可的松藥物療效是不可缺少的，松藥物療效是不可缺少的，11 ，11 。 除除11位位C進(jìn)行羥基化反應(yīng)外，進(jìn)行羥基化反應(yīng)外，9 ，14 ，16 的羥基化，在制備甾體藥物時，生產(chǎn)皮質(zhì)甾類的羥基化，在制備甾體藥物時，生產(chǎn)皮質(zhì)甾類化合物及其類似物?；衔锛捌漕愃莆?。進(jìn)行甾體羥基化作用的微生物進(jìn)行甾體羥基化作用的微生物轉(zhuǎn)化物質(zhì)轉(zhuǎn)化物質(zhì)作用位置作用位置微生物代表微生物代表孕酮孕酮11 11 黑根霉、黑曲霉、臘狀桿菌等黑根霉、黑曲霉、臘狀桿菌等彎曲孢霉彎曲孢霉化合物化合物S11 11 黑根霉、黑曲霉、焦曲霉構(gòu)巢曲黑根霉、黑曲霉

9、、焦曲霉構(gòu)巢曲霉霉假單孢桿菌、弗氏鏈霉菌、梨頭假單孢桿菌、弗氏鏈霉菌、梨頭霉霉11脫氧皮脂酮脫氧皮脂酮11 彎月彎孢霉彎月彎孢霉雌二醇雌二醇16 巨大芽孢桿菌巨大芽孢桿菌羥基化反應(yīng)機(jī)理羥基化反應(yīng)機(jī)理羥基化反應(yīng)羥基化反應(yīng)由于這些酶能將一摩爾分子氧引入底物，因由于這些酶能將一摩爾分子氧引入底物，因此被定義位單氧化酶。此被定義位單氧化酶。這種細(xì)胞色素這種細(xì)胞色素p450依賴的單氧化酶存在于幾依賴的單氧化酶存在于幾乎所有形式的生命體中，以游離或膜結(jié)合的乎所有形式的生命體中，以游離或膜結(jié)合的形式存在。形式存在。同位素實驗證明同位素實驗證明甾體羥基化中存在的問題甾體羥基化中存在的問題環(huán)糊精的生理作用環(huán)糊精

10、的生理作用 Hesselink等研究：等研究： 應(yīng)用環(huán)糊于分枝桿菌應(yīng)用環(huán)糊于分枝桿菌甾體邊鏈的降解。甾體邊鏈的降解。 環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡聚糖，一般由環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡聚糖，一般由68個個葡萄糖分子通過葡萄糖分子通過 1，4糖苷鍵連接而成。糖苷鍵連接而成。 易溶于水。易溶于水。 含有疏水性空腔，可與疏水性分子結(jié)合。含有疏水性空腔，可與疏水性分子結(jié)合。 可作為幾種甾體類藥物的穩(wěn)定劑和增溶劑可作為幾種甾體類藥物的穩(wěn)定劑和增溶劑。環(huán)糊精的應(yīng)用實例環(huán)糊精的應(yīng)用實例1 Chincholkar 等研究了在等研究了在 環(huán)糊精存在時，環(huán)糊精存在時，Currularia VKMF-644對對11脫氫皮甾醇脫氫皮甾

11、醇（Reichstein S化合物，簡稱化合物化合物，簡稱化合物S）的的11 羥基化。羥基化。在底物濃度為在底物濃度為4g/L時：時： 化合物化合物S： CD1.0:0.6 氫化可的松氫化可的松的產(chǎn)率為的產(chǎn)率為7075 無無 CD： 氫化可的松的產(chǎn)率氫化可的松的產(chǎn)率為為4050環(huán)糊精的應(yīng)用實例環(huán)糊精的應(yīng)用實例2 GD：19去甲基去甲基13乙基雄甾乙基雄甾4烯烯3，17雙酮雙酮 經(jīng)經(jīng)Penicillium raistrickii進(jìn)行進(jìn)行15 羥羥基化基化口服避孕藥口服避孕藥5D十十八甲基炔諾酮（八甲基炔諾酮（gestodene）的重要）的重要中間體。中間體。 Schlosser等研究表明：在等研

12、究表明：在 環(huán)糊精環(huán)糊精存在時，菌株或其固定化細(xì)胞對存在時，菌株或其固定化細(xì)胞對CD的的15 羥基化作用，與以甲醇做溶劑比較，羥基化作用，與以甲醇做溶劑比較，其轉(zhuǎn)化率都能明顯提高其轉(zhuǎn)化率都能明顯提高。環(huán)糊精作用環(huán)糊精作用 環(huán)糊精有利于提高甾體底物溶解度環(huán)糊精有利于提高甾體底物溶解度 真菌能以真菌能以 環(huán)糊精作為環(huán)糊精作為C源源其他重要的羥基化反應(yīng)其他重要的羥基化反應(yīng) 地索高諾酮（地索高諾酮（destogestrel） 新型避孕藥（荷蘭新型避孕藥（荷蘭Organon公司推出）公司推出） 作用：月經(jīng)周期控制好，副作用少，避孕可靠作用：月經(jīng)周期控制好，副作用少，避孕可靠 我國研究：上海醫(yī)科大學(xué)史紀(jì)平

13、我國研究：上海醫(yī)科大學(xué)史紀(jì)平 19去甲基去甲基13乙基雄甾乙基雄甾4烯烯3，17雙雙酮酮11 羥基化羥基化（金龜子綠僵菌）形成關(guān)鍵（金龜子綠僵菌）形成關(guān)鍵中間體中間體 簡化合成路線，降低副反應(yīng)。簡化合成路線，降低副反應(yīng)。 底物：底物：0.2% 轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率：36甾體的邊鏈降解甾體的邊鏈降解側(cè)鏈降解側(cè)鏈降解 微生物對甾體側(cè)鏈的降解，解決了天然甾體微生物對甾體側(cè)鏈的降解，解決了天然甾體化合物作原料合成甾體激素的問題，為利用化合物作原料合成甾體激素的問題，為利用原價的原料開辟了新的途徑。原價的原料開辟了新的途徑。 常見微生物有：常見微生物有： 簡單節(jié)桿菌簡單節(jié)桿菌 球形芽孢桿菌球形芽孢桿菌 玫瑰芽

14、孢桿菌玫瑰芽孢桿菌 淡紫青霉淡紫青霉 藤黃諾卡氏菌藤黃諾卡氏菌 甾體邊鏈降解甾體邊鏈降解 甾體母核降解甾體母核降解3 羥基羥基5甾醇甾醇 9 羥基化，羥基化，1，2脫氫脫氫3酮酮4化合物化合物 微生物種類不同微生物種類不同1，2脫氫，脫氫，9 羥基化羥基化氧 化 甾體邊鏈降解甾體邊鏈降解 采用類似脂肪酸采用類似脂肪酸 氧化的氧化過程，最后形氧化的氧化過程，最后形成成C17酮甾體。酮甾體。選擇性邊鏈降解問題選擇性邊鏈降解問題 選擇性邊鏈降解策略（選擇性邊鏈降解策略（3） 輔助基因工程輔助基因工程 提高邊鏈降解的產(chǎn)率策略提高邊鏈降解的產(chǎn)率策略選擇性甾體邊鏈降解措施選擇性甾體邊鏈降解措施1 對甾醇進(jìn)

15、行結(jié)構(gòu)改造，從而阻止酶對母核的降對甾醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，從而阻止酶對母核的降解解 例如：例如：1965 Sih等等 將膽固醇先行改造為將膽固醇先行改造為19羥基羥基衍生物衍生物 再經(jīng)一步微生物轉(zhuǎn)化為再經(jīng)一步微生物轉(zhuǎn)化為A環(huán)芳香化的雌酚酮。環(huán)芳香化的雌酚酮。 選擇性甾體邊鏈降解措施選擇性甾體邊鏈降解措施2 加入酶抑制劑，抑制母核降解關(guān)鍵酶如：加入酶抑制劑，抑制母核降解關(guān)鍵酶如：C 1，2脫脫氫酶和氫酶和9 羥化酶。羥化酶。 如：如： Ni Co Pb Se 8羥基喹啉應(yīng)用于多種分枝桿菌對膽固醇的選羥基喹啉應(yīng)用于多種分枝桿菌對膽固醇的選性邊鏈降解性邊鏈降解 金屬鰲合劑金屬鰲合劑 2，2雙聯(lián)吡啶雙聯(lián)吡啶

16、 抑制母核降解抑制母核降解選擇性甾體邊鏈降解措施選擇性甾體邊鏈降解措施3 對菌株進(jìn)行誘變，產(chǎn)生僅降解甾醇側(cè)鏈的突變株對菌株進(jìn)行誘變，產(chǎn)生僅降解甾醇側(cè)鏈的突變株例如：例如： 原始菌株經(jīng)誘變?yōu)樵季杲?jīng)誘變?yōu)?誘變菌株誘變菌株Mycobacterium sp，NRRL-B3683 不加抑制劑，便產(chǎn)生雄甾不加抑制劑，便產(chǎn)生雄甾1，4二烯二烯3，17二酮（二酮（ADD） 再誘變得再誘變得Mycobacterium sp，NRRL-B3805， 無無C 1，2脫氫酶脫氫酶 能產(chǎn)生雄甾能產(chǎn)生雄甾4烯烯3，17二酮（二酮（AD）基因工程新技術(shù)的應(yīng)用基因工程新技術(shù)的應(yīng)用專利：專利： Pseudomonas 菌

17、株無降解甾體的能力菌株無降解甾體的能力 將將Mycobacterium sp NRRL-3683 的的DNA導(dǎo)入導(dǎo)入Pseudomonas 菌株中獲得重組菌。菌株中獲得重組菌。 重組菌可在水相，一種或幾種有機(jī)相中進(jìn)重組菌可在水相，一種或幾種有機(jī)相中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 Pseudomonas 菌株比菌株比Mycobacterium sp NRRL-3683的生長輸率快的生長輸率快 結(jié)果加快轉(zhuǎn)化進(jìn)程，降低成本結(jié)果加快轉(zhuǎn)化進(jìn)程，降低成本。方法方法 分離純化分離純化Mycobacterium sp NRRL-3683 的的DNA 整合到特定質(zhì)粒載體中整合到特定質(zhì)粒載體中 導(dǎo)入導(dǎo)入 噬菌體中噬菌

18、體中 用入用入 噬菌體感染噬菌體感染E.coli HB101，得，得E.coli重組子重組子 三親雜交實現(xiàn)三親雜交實現(xiàn)Mycobacterium sp NRRL-3683 的的DNA到到Pseudomonas 菌株得轉(zhuǎn)移。菌株得轉(zhuǎn)移。如何提高甾體邊鏈降解的產(chǎn)率如何提高甾體邊鏈降解的產(chǎn)率接觸接觸提高甾體邊鏈降解速率提高甾體邊鏈降解速率 Hesselink等研究表明：環(huán)糊精能明顯增強(qiáng)等研究表明：環(huán)糊精能明顯增強(qiáng)Mycobacterium sp NRRL-3683 降解膽固降解膽固醇、谷甾醇等邊鏈生成醇、谷甾醇等邊鏈生成AD的產(chǎn)率，不影響的產(chǎn)率，不影響細(xì)胞生長速度和細(xì)胞密度。細(xì)胞生長速度和細(xì)胞密度。

19、 當(dāng)環(huán)糊精：底物濃度當(dāng)環(huán)糊精：底物濃度=2:1時，微生物降解時，微生物降解邊鏈的活性可增加邊鏈的活性可增加1.7-3.0倍。倍。 環(huán)糊精能阻止母核的降解及產(chǎn)物的反饋抑環(huán)糊精能阻止母核的降解及產(chǎn)物的反饋抑制。制。環(huán)糊精在甾體邊鏈降解中的環(huán)糊精在甾體邊鏈降解中的作用總結(jié)作用總結(jié) 在甾體邊鏈降解過程中，環(huán)糊精充當(dāng)：在甾體邊鏈降解過程中，環(huán)糊精充當(dāng)： 惰性甾體增溶劑惰性甾體增溶劑 反應(yīng)載體反應(yīng)載體 保護(hù)劑保護(hù)劑甾體邊鏈降的成功應(yīng)用甾體邊鏈降的成功應(yīng)用 Arhna 和和Sih等研究報道以膽甾醇和等研究報道以膽甾醇和 谷甾醇為原料微谷甾醇為原料微生物轉(zhuǎn)化法合成甾體藥物中間體的方法。生物轉(zhuǎn)化法合成甾體藥物中

20、間體的方法。 采用酶抑制劑采用酶抑制劑 生化阻斷變株生化阻斷變株 改變細(xì)胞膜通透性等生物技術(shù)改造甾醇的結(jié)構(gòu)，從而改變細(xì)胞膜通透性等生物技術(shù)改造甾醇的結(jié)構(gòu)，從而選擇性控制甾醇的邊鏈降解選擇性控制甾醇的邊鏈降解成功合成中間體成功合成中間體 雄甾雄甾4烯烯3，17二酮（二酮（4 AD） 雄甾雄甾1，4二烯二烯3，17二酮（二酮（ADD） 9 羥基羥基4AD目的：工業(yè)生產(chǎn)性激素，利尿劑等甾體藥物目的：工業(yè)生產(chǎn)性激素，利尿劑等甾體藥物其他的甾體生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型其他的甾體生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型 脫氫作用脫氫作用 A環(huán)芳香環(huán)芳香脫氫作用使甾體核形成雙鍵脫氫作用使甾體核形成雙鍵強(qiáng)的松（去氫可的松）強(qiáng)的松（去氫可的松

21、） 是可的松經(jīng)脫氫而形成的。是可的松經(jīng)脫氫而形成的。 其抗炎功效比可的松高幾倍。一般制備其抗炎功效比可的松高幾倍。一般制備該種藥物時，常常是將可的松或氫化可該種藥物時，常常是將可的松或氫化可的松脫氫變?yōu)槿淇傻乃苫蛉錃浠傻乃擅摎渥優(yōu)槿淇傻乃苫蛉錃浠傻乃?。的松。脫氫反?yīng)的常見微生物為脫氫反應(yīng)的常見微生物為 簡單節(jié)桿菌簡單節(jié)桿菌 各種芽孢桿菌（蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢各種芽孢桿菌（蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌）桿菌） 鐮刀霉鐮刀霉 長蠕孢菌屬。長蠕孢菌屬。A環(huán)芳香化環(huán)芳香化 所謂所謂A環(huán)芳香化環(huán)芳香化 是指甾體是指甾體A環(huán)核上的每個環(huán)核上的每個C原子都脫氫形原子都脫氫形成雙鍵，而變?yōu)榉枷慊Y(jié)

22、構(gòu)。成雙鍵，而變?yōu)榉枷慊Y(jié)構(gòu)。 雌性激素的生產(chǎn)（雌二醇），可通過此雌性激素的生產(chǎn)（雌二醇），可通過此方法獲得方法獲得研究生物轉(zhuǎn)化的幾種常用方法研究生物轉(zhuǎn)化的幾種常用方法第四章第四章 研究生物轉(zhuǎn)化的幾種常用方法研究生物轉(zhuǎn)化的幾種常用方法 間歇培養(yǎng)法間歇培養(yǎng)法 整體細(xì)胞轉(zhuǎn)化法整體細(xì)胞轉(zhuǎn)化法 洗滌均絲懸浮法（靜息細(xì)胞法）洗滌均絲懸浮法（靜息細(xì)胞法） 孢子轉(zhuǎn)化法孢子轉(zhuǎn)化法 原生質(zhì)體實驗法原生質(zhì)體實驗法 遺傳特性誘變法遺傳特性誘變法 同位素示蹤法同位素示蹤法間歇培養(yǎng)法（間歇培養(yǎng)法（Batch culture)這種方法能夠比較直接而簡單地篩選能否具這種方法能夠比較直接而簡單地篩選能否具有轉(zhuǎn)化某種化合物的活

23、性菌株。有轉(zhuǎn)化某種化合物的活性菌株。游離的整體細(xì)胞游離的整體細(xì)胞 游離的整體細(xì)胞直接作為催化劑來制造產(chǎn)游離的整體細(xì)胞直接作為催化劑來制造產(chǎn)品的報道已經(jīng)不少品的報道已經(jīng)不少 在某種程度優(yōu)于固定化細(xì)胞在某種程度優(yōu)于固定化細(xì)胞 在生物轉(zhuǎn)化酶工程中越來越受到重視在生物轉(zhuǎn)化酶工程中越來越受到重視 游離整體細(xì)胞的基礎(chǔ)研究更為重要游離整體細(xì)胞的基礎(chǔ)研究更為重要游離整體細(xì)胞的基礎(chǔ)研究內(nèi)容游離整體細(xì)胞的基礎(chǔ)研究內(nèi)容 細(xì)胞的滲透化細(xì)胞的滲透化 酶的胞內(nèi)固定化酶的胞內(nèi)固定化 酶細(xì)胞在反應(yīng)前后的形態(tài)變化和結(jié)構(gòu)變化酶細(xì)胞在反應(yīng)前后的形態(tài)變化和結(jié)構(gòu)變化整體細(xì)胞轉(zhuǎn)化應(yīng)用舉例整體細(xì)胞轉(zhuǎn)化應(yīng)用舉例 底物：富馬酸底物：富馬酸 產(chǎn)

24、物產(chǎn)物L(fēng)天冬氨酸天冬氨酸 生物轉(zhuǎn)化酶：天冬氨酸酶（生物轉(zhuǎn)化酶：天冬氨酸酶（EC4.3.1.1） 轉(zhuǎn)化菌株：轉(zhuǎn)化菌株：E.coli整體細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究整體細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究底物濃度細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)催化反應(yīng)速度細(xì)胞的滲透性關(guān)系培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法不同底物濃度的反應(yīng)速率不同底物濃度的反應(yīng)速率 底物質(zhì)量濃度較高時，在某一時間（底物質(zhì)量濃度較高時，在某一時間（8h）前，轉(zhuǎn)化速率較低，而后，反應(yīng)速度加快。前，轉(zhuǎn)化速率較低，而后，反應(yīng)速度加快。 對底物富馬酸鹽的轉(zhuǎn)化徹底。（對底物富馬酸鹽的轉(zhuǎn)化徹底。（99.2） 底物濃度較低時，反應(yīng)速度始終較慢底物濃度較低時，反應(yīng)速度始終較慢 對底物富馬酸鹽的轉(zhuǎn)化不徹底。（對底

25、物富馬酸鹽的轉(zhuǎn)化不徹底。（63）特點(diǎn)：特點(diǎn)： 高質(zhì)量底物濃度有較高的反應(yīng)速率高質(zhì)量底物濃度有較高的反應(yīng)速率 高質(zhì)量濃度底物有較高的轉(zhuǎn)化率高質(zhì)量濃度底物有較高的轉(zhuǎn)化率 催化反應(yīng)一般有個遲滯期催化反應(yīng)一般有個遲滯期酶細(xì)胞在生物轉(zhuǎn)化中的形態(tài)變化酶細(xì)胞在生物轉(zhuǎn)化中的形態(tài)變化低底物濃度掃描觀察低底物濃度掃描觀察酶細(xì)胞在生物轉(zhuǎn)化中的形態(tài)變化酶細(xì)胞在生物轉(zhuǎn)化中的形態(tài)變化高底物濃度掃描觀察高底物濃度掃描觀察形態(tài)學(xué)變化形態(tài)學(xué)變化 高質(zhì)量底物濃度下細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)高質(zhì)量底物濃度下細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化變化 細(xì)胞表面發(fā)上皺褶，有明顯的凹陷細(xì)胞表面發(fā)上皺褶，有明顯的凹陷 細(xì)胞膜變薄，松弛、不明顯，內(nèi)部結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜

26、變薄，松弛、不明顯，內(nèi)部結(jié)構(gòu)變松，不致密。變松，不致密。高質(zhì)量濃度底物對含酶細(xì)胞的滲透化作用高質(zhì)量濃度底物對含酶細(xì)胞的滲透化作用靜息細(xì)胞法靜息細(xì)胞法 為了排除原培養(yǎng)基中自身的代謝產(chǎn)物對不同生長為了排除原培養(yǎng)基中自身的代謝產(chǎn)物對不同生長階段轉(zhuǎn)化的影響，常常用洗滌的靜息細(xì)胞來代替階段轉(zhuǎn)化的影響，常常用洗滌的靜息細(xì)胞來代替發(fā)酵液中的生長的細(xì)胞，即將不同生長階段的細(xì)發(fā)酵液中的生長的細(xì)胞，即將不同生長階段的細(xì)胞取出，洗去沾染的原培養(yǎng)液及其代謝產(chǎn)物，然胞取出，洗去沾染的原培養(yǎng)液及其代謝產(chǎn)物，然后把細(xì)胞懸浮在人工轉(zhuǎn)化系統(tǒng)內(nèi)，在一定條件后把細(xì)胞懸浮在人工轉(zhuǎn)化系統(tǒng)內(nèi)，在一定條件 下下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。

27、孢子轉(zhuǎn)化法孢子轉(zhuǎn)化法 真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶活力高，且常常用于生物轉(zhuǎn)化?；盍Ω?，且常常用于生物轉(zhuǎn)化。 細(xì)菌的內(nèi)生孢子（芽孢），一般無轉(zhuǎn)化活性。細(xì)菌的內(nèi)生孢子（芽孢），一般無轉(zhuǎn)化活性。轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化方法相似于靜息細(xì)胞法。相似于靜息細(xì)胞法。 不采用完全培養(yǎng)基，只選用緩沖液或含有不采用完全培養(yǎng)基，只選用緩沖液或含有葡萄糖一類能源的物質(zhì)即可。葡萄糖一類能源的物質(zhì)即可。 通常轉(zhuǎn)化時使用的孢子濃度為通常轉(zhuǎn)化時使用的孢子濃度為108109個個/ml. 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化pH一般為一般為5-6原生質(zhì)體試驗法原生質(zhì)體試驗法方法方法 通過溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等脫去通過

28、溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等脫去細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體。細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體。 將原生質(zhì)體懸浮于高滲穩(wěn)定液中，添加前將原生質(zhì)體懸浮于高滲穩(wěn)定液中，添加前體物質(zhì)，進(jìn)行喂養(yǎng)試驗，觀察結(jié)果。體物質(zhì)，進(jìn)行喂養(yǎng)試驗，觀察結(jié)果。原生質(zhì)體試驗法特點(diǎn)原生質(zhì)體試驗法特點(diǎn)排除了細(xì)胞壁通透性障礙。排除了細(xì)胞壁通透性障礙。保全了整體細(xì)胞的內(nèi)酶系統(tǒng)。保全了整體細(xì)胞的內(nèi)酶系統(tǒng)。避免了無細(xì)胞抽提法中，用破碎細(xì)胞而損壞避免了無細(xì)胞抽提法中，用破碎細(xì)胞而損壞了酶體系，從而使某些需要偶聯(lián)的酶反應(yīng)了酶體系，從而使某些需要偶聯(lián)的酶反應(yīng)（氧化還原反應(yīng)）不能進(jìn)行的缺點(diǎn)。（氧化還原反應(yīng)）不能進(jìn)行的缺點(diǎn)。遺傳特性誘變法遺傳特性誘變法菌種誘變不僅是提高產(chǎn)量的重要手段，而且也是研菌種誘變不僅是提高產(chǎn)量的重要手段，而且也是研究生物轉(zhuǎn)化過程中，產(chǎn)物形成的遺傳機(jī)制的一種究生物轉(zhuǎn)化過程中，產(chǎn)物形成的遺傳機(jī)制的一種有效方法。有效方法。將轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行誘變，使其失去轉(zhuǎn)化底物或形成某個將轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行誘變，使其失去轉(zhuǎn)化底物或形成某個中間體的能力，從而就可