天然藥物化學第四章

1、第四章第四章柱色譜分離技術柱色譜分離技術教學目標教學目標1、理解吸附色譜和分配色譜的基本原理,掌握常用吸附劑的特點及適用范圍.2、掌握聚酰胺色譜，凝膠過濾色譜的原理、特點及應用。3、掌握中藥有效成分結構鑒定的一般方法。4、掌握大孔樹脂法的原理及應用。20世紀初由俄國的植物學家世紀初由俄國的植物學家Tswett創(chuàng)立。創(chuàng)立。讓從綠葉中提取出來的色素石油醚溶液，讓從綠葉中提取出來的色素石油醚溶液，通過一根填滿通過一根填滿CaCO3的細長玻璃柱，然的細長玻璃柱，然后用純凈的石油醚加以沖洗，結果在玻后用純凈的石油醚加以沖洗，結果在玻璃柱內的植物綠葉色素就被分離成幾個璃柱內的植物綠葉色素就被分離成幾個具有

2、不同顏色的譜帶，然后按譜帶顏色具有不同顏色的譜帶，然后按譜帶顏色對混合物進行鑒定分析，稱之為色譜。對混合物進行鑒定分析，稱之為色譜。色譜法是目前被廣泛應用的分離純化和鑒色譜法是目前被廣泛應用的分離純化和鑒定化合物的一種有效方法。定化合物的一種有效方法。優(yōu)點：試料用量少，分離效率高。用一般優(yōu)點：試料用量少，分離效率高。用一般分離方法無法分離的化合物，如天然產物分離方法無法分離的化合物，如天然產物中結構相似，性質相似的成分，色譜分離中結構相似，性質相似的成分，色譜分離能獲得很好的分離效果。已成為化學領域能獲得很好的分離效果。已成為化學領域中一個重要的分離、分析工具。中一個重要的分離、分析工具。色譜

3、法的分類：1、按固定相或支持劑的種類可分為氧化鋁色譜；硅膠色譜；聚酰胺色譜；凝膠色譜等。2、按移動相種類可分為氣相色譜；液相色譜。3、按操作方式可分為柱色譜；紙色譜；薄層色譜。4、按分離原理可分為吸附色譜；分配色譜；離子交換色譜、凝膠色譜。第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析一、基本概念：一、基本概念： 利用作為固定相的吸附劑對混合物中各利用作為固定相的吸附劑對混合物中各種成分吸附力的大小不同，使各成分得種成分吸附力的大小不同，使各成分得到相互分離的方法。適用于分離中等分到相互分離的方法。適用于分離中等分子量的脂溶性物質。子量的脂溶性物質。二、基本原理二、基本原理 化學吸附化學吸附(不可逆不可逆

4、) 半化學吸附半化學吸附(氫鍵氫鍵,可逆可逆) 物理吸附物理吸附(可逆可逆)（1）有較大表面積和足夠的吸附力）有較大表面積和足夠的吸附力（2）對不同化學組分有不同的吸附量，）對不同化學組分有不同的吸附量，能較好的分離能較好的分離（3）化學惰性，不與溶劑及樣品中各組）化學惰性，不與溶劑及樣品中各組分起反應分起反應（4）不溶于溶劑和洗脫劑）不溶于溶劑和洗脫劑（5）顆粒均勻，有一定機械強度和細度）顆粒均勻，有一定機械強度和細度物理吸附物理吸附:三、吸附劑三、吸附劑 硅膠：硅膠： 聚硅酸分子經過不同程度的脫水而聚硅酸分子經過不同程度的脫水而形成的干燥多孔性物質，微呈酸性的。形成的干燥多孔性物質，微呈酸

5、性的。 SiO2XH2O為硅氧烷交鏈結構：為硅氧烷交鏈結構：有硅醇基，吸附力強弱，取決于硅醇基有硅醇基，吸附力強弱，取決于硅醇基 的多少的多少。通過氫鍵吸水，吸附性下降，通過氫鍵吸水，吸附性下降，105120可除去絕大部分水?？沙ソ^大部分水。200時，時，水失殆盡。表面活性最大，吸附力最強。水失殆盡。表面活性最大，吸附力最強。O O S Si iO OO OO O S Si iO OO OO OH H分離范圍廣：分離范圍廣：柱層析：柱層析：120160目目薄層用薄層用180目目氧化鋁氧化鋁 180烘烘6個小時，含水個小時，含水3 （1）酸性：適用于有機酸）酸性：適用于有機酸,不能分離堿性物質

6、不能分離堿性物質. （2）堿性：分離碳氫化合物、生物堿、甾族類化合物。不）堿性：分離碳氫化合物、生物堿、甾族類化合物。不適合醛、酮、酯及有機酸的分離，可發(fā)生化學反應。適合醛、酮、酯及有機酸的分離，可發(fā)生化學反應。 （3）中性：中性的、堿性、脂溶性化合物的分離。）中性：中性的、堿性、脂溶性化合物的分離。 聚酰胺：聚酰胺： 由酰胺聚合而成的一類高分子化合物。由酰胺聚合而成的一類高分子化合物。尼龍，錦綸尼龍，錦綸H H2 2C CN NH HC CC CH H2 2H H2 2C CC CH H2 2H H2 2C CO OO OC CC CH H2 2N NH H2 2C CC CH H2 2H

7、H2 2C CH HC CH H2 2H H2 2C CC CO OH HO OO OH H3 3C CC CH H3 3H H3 3C CC CH H3 3O O固定相固定相移動相移動相形成氫鍵的能力受以下因素影響形成氫鍵的能力受以下因素影響 溶劑的種類溶劑的種類（聚酰胺在水中形成氫鍵的能力最強，在（聚酰胺在水中形成氫鍵的能力最強，在有機溶劑中較弱，在堿性溶液中最弱。有機溶劑中較弱，在堿性溶液中最弱。化合物分子結構化合物分子結構 A：化合物分子中能形成氫鍵的基團數目越多，被聚酰：化合物分子中能形成氫鍵的基團數目越多，被聚酰胺吸附越強。胺吸附越強。 B：成鍵基團的位置不同，被聚酰胺吸附的強度也

8、不同。：成鍵基團的位置不同，被聚酰胺吸附的強度也不同。 C：分子中芳香核、共軛雙鍵多者被吸附強度小。：分子中芳香核、共軛雙鍵多者被吸附強度小。 D：能形成分子內氫鍵者被吸附強度?。耗苄纬煞肿觾葰滏I者被吸附強度小.活性炭：活性炭：屬于非極性吸附劑屬于非極性吸附劑,對極性物質的吸附力弱對極性物質的吸附力弱,對非極性物質的吸附力強對非極性物質的吸附力強. 粉末狀粉末狀(吸附力強,適合于極性大的化合物的分離) 顆粒狀顆粒狀(吸附力居中,適合于極性不太大的化合物的分離)錦綸活性碳錦綸活性碳(以錦綸錦綸為粘合劑,吸附力弱,適合極性小的化合物的分離)活性炭的吸附規(guī)律活性炭的吸附規(guī)律1、極性基團多時，在活性碳

9、上的吸附力弱，反之則強。、極性基團多時，在活性碳上的吸附力弱，反之則強。2、在一定條件下，化合物母體結構較大時，吸附力強，、在一定條件下，化合物母體結構較大時，吸附力強，反之則弱。反之則弱。例如：對多糖的吸附力大于單糖；對多肽的吸附力大于氨基例如：對多糖的吸附力大于單糖；對多肽的吸附力大于氨基酸。酸。3、對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。、對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。4、對生物堿的吸附力，一般在堿性溶液中強，而在酸性溶、對生物堿的吸附力，一般在堿性溶液中強，而在酸性溶液中弱（呈鹽增大了極性）；相反，對于有機酸、酚類化合液中弱（呈鹽增大了極性）；相反，對于有機酸、酚類化合物的吸

10、附力，則在酸性溶液中吸附力強，而在堿性中弱。物的吸附力，則在酸性溶液中吸附力強，而在堿性中弱?；钚蕴嫉念A處理：該物質對空氣有一定程度的吸附力，氣體活性碳的預處理：該物質對空氣有一定程度的吸附力，氣體分子被活性碳吸附后占據了其吸附表面，使活性碳吸附活性分子被活性碳吸附后占據了其吸附表面，使活性碳吸附活性下降，即中毒。下降，即中毒。所以使用前需活化處理：在所以使用前需活化處理：在120150的烘箱中烘的烘箱中烘26小時。小時。四：溶劑選擇何種溶劑為移動相對分離效果有極大的影響。所用溶劑應具備純度高、不含水份；與試樣、吸附劑不起化學反應；對被分離成分有適當的溶解度；黏度??；易揮散。對于極性吸附劑，若

11、選擇的流動相溶劑極性越大，則其展開或洗脫能力就越強；反之，則剛好相反；在選擇時要考慮被分離的物質的性質。五：被分離的物質五：被分離的物質被分離物質、吸附劑、溶劑三者為組成吸附色譜必不可少的被分離物質、吸附劑、溶劑三者為組成吸附色譜必不可少的要素。要素。對于極性吸附劑，被分離物質的極性越大，被吸附越強，溶對于極性吸附劑，被分離物質的極性越大，被吸附越強，溶劑進行洗脫就越困難。劑進行洗脫就越困難。一般來說：一般來說：若被分離的物質極性大，可選用活度較低的吸附劑，而移動若被分離的物質極性大，可選用活度較低的吸附劑，而移動相的極性大；相的極性大；若被分離的物質極性小，可選用活度較高的吸附劑，而移動若被

12、分離的物質極性小，可選用活度較高的吸附劑，而移動相的極性?。幌嗟臉O性??；六、操作方式六、操作方式裝柱裝柱：所需的玻璃柱內徑與柱長之比是所需的玻璃柱內徑與柱長之比是1：151：20之間。之間。粒度在粒度在100目左右。分離試樣與吸附劑用量比為目左右。分離試樣與吸附劑用量比為1：301：60注意上樣體積不能太大。注意上樣體積不能太大。上樣上樣分為干法和濕法上樣兩種。分為干法和濕法上樣兩種。洗脫洗脫適當控制流速適當控制流速收集檢查收集檢查第二節(jié)第二節(jié) 分配柱層析分配柱層析一、基本概念：一、基本概念： 利用混合物中各成分在互不相容的兩相利用混合物中各成分在互不相容的兩相溶劑中分配系數的不同，來達到分離

13、的溶劑中分配系數的不同，來達到分離的色譜分離方法。色譜分離方法。msCC 分配系數（分配系數（K） 組分在流動相中的濃度組分在固定相中的濃度二、基本原理：二、基本原理： 相當于一種連續(xù)性的溶劑提取方法。兩相溶劑中的相當于一種連續(xù)性的溶劑提取方法。兩相溶劑中的一相為固定相，常以某種惰性固體吸住該相溶劑，一相為固定相，常以某種惰性固體吸住該相溶劑，使之固定，這種惰性固體稱之為支持劑或載體或單使之固定，這種惰性固體稱之為支持劑或載體或單體。另一相為移動相。體。另一相為移動相。進行分離時，將被分離的組分加到固定相上，通過移動相進行分離時，將被分離的組分加到固定相上，通過移動相的流動，使試樣中各成分在兩

14、相之間的分配不同而的流動，使試樣中各成分在兩相之間的分配不同而獲得分離。獲得分離。分配色譜根據固定相與移動相的極性不同可分為以下兩種：1、正相色譜：以極性大的溶劑（如水、親水性的溶劑）為固定相，極性小的溶劑為移動相的分配色譜。常用于分離極性大的組分，例如生物堿、糖類、苷類、有機酸等，固定相常用水或緩沖液，移動相則是氯仿、乙酸乙酯、丁醇。極性小的組分先出來，極性大的組分后出來。2、反相色譜：以極性小的溶劑（如氯仿、石油醚等親脂性溶劑）為固定相，極性大的溶劑為移動相的分配色譜。常用于分離極性小的脂溶性的化合物，例如油脂、高級脂肪酸、游離甾體等，固定相常用石蠟油，移動相則是水或甲醇。極性大的組分先出

15、來，極性小的組分后出來。三、支持劑三、支持劑 纖維粉、硅膠、硅藻土纖維粉、硅膠、硅藻土 （1）中性多孔性粉末，無吸附作用或吸）中性多孔性粉末，無吸附作用或吸附作用很弱附作用很弱（2）不溶于層析所用的溶劑系統(tǒng)）不溶于層析所用的溶劑系統(tǒng)（3）能吸附相當量的固定相，且流動相）能吸附相當量的固定相，且流動相能自由通過能自由通過反相色譜多采用碳十八烷基（反相色譜多采用碳十八烷基（-C18H37）鍵合硅膠作為固定）鍵合硅膠作為固定相。相。原理是通過化學反應，使形成具有親油性表面的穩(wěn)定固定相。原理是通過化學反應，使形成具有親油性表面的穩(wěn)定固定相。若硅膠表面鍵合的基團為氨基時，則用于正相分配色譜。若硅膠表面鍵

16、合的基團為氨基時，則用于正相分配色譜。四、溶劑系統(tǒng)（可用混合溶劑）四、溶劑系統(tǒng)（可用混合溶劑）五、被分離物質（誰先出）五、被分離物質（誰先出）六、操作方式六、操作方式裝柱：固定相：支持劑（裝柱：固定相：支持劑（0.5:11:1),二者要充分攪拌二者要充分攪拌,濾除多濾除多余的固定相余的固定相,然后倒入所用的移動相中然后倒入所用的移動相中,劇烈攪拌使二者相劇烈攪拌使二者相互飽和平衡互飽和平衡.裝柱時先將固定腥飽和的移動相加入到色譜裝柱時先將固定腥飽和的移動相加入到色譜柱內柱內,再按濕法裝柱操作裝入吸著固定相的支持劑再按濕法裝柱操作裝入吸著固定相的支持劑. 加樣加樣:一般支持劑的為上樣量的一般支持

17、劑的為上樣量的1001000倍倍.1、對于易溶于固定相的，將試樣溶于少量的固定相后，加、對于易溶于固定相的，將試樣溶于少量的固定相后，加入少量支持劑拌勻，裝入柱頂。入少量支持劑拌勻，裝入柱頂。2、對于可溶于移動相者，則直接溶于移動相中后加入柱頂。、對于可溶于移動相者，則直接溶于移動相中后加入柱頂。3、對于在兩相中均難溶者，則以使用的低沸點溶劑溶解后，、對于在兩相中均難溶者，則以使用的低沸點溶劑溶解后，加入干燥的支持劑拌勻，揮去溶劑，再用一定量的固定相拌加入干燥的支持劑拌勻，揮去溶劑，再用一定量的固定相拌勻，裝入柱頂。勻，裝入柱頂。洗脫：洗脫：所用的移動相均需先與固定相飽和。所用的移動相均需先與

18、固定相飽和。第三節(jié)第三節(jié) 離子交換樹脂柱層析離子交換樹脂柱層析一、基本概念一、基本概念利用離子交換樹脂上的功能基能在水溶液中與溶液的其他離子利用離子交換樹脂上的功能基能在水溶液中與溶液的其他離子進行可逆性交換的性質進行可逆性交換的性質,以離子交換樹脂為固定相以離子交換樹脂為固定相,使混合使混合成分中離子型與非離子型物質、或具有不同解離度的離成分中離子型與非離子型物質、或具有不同解離度的離子化合物得到分離的一種色譜分離法。子化合物得到分離的一種色譜分離法。常用于分離具有解離能力的酸性、堿性及兩性的化合物，例如常用于分離具有解離能力的酸性、堿性及兩性的化合物，例如生物堿、氨基酸、有機酸、酚類、肽類

19、等。生物堿、氨基酸、有機酸、酚類、肽類等。二、基本原理二、基本原理主要由苯乙烯經二乙烯苯鉸鏈主要由苯乙烯經二乙烯苯鉸鏈形成的網狀結構。形成的網狀結構。C HC H2C HC H2S O3HC H2S O3HC HC H2H2CC H 2S O3HH CS O3H分類：陽離子交換樹脂強酸性（-SO3H）弱酸性（-COOH）陰離子交換樹脂強堿性-N（CH3）3.X弱堿性(-NHR)或(NH2)陽離子交換樹脂 R-SO3-H+M+OH- R-SO3-M+H2O陰離子交換樹脂 R-N+OH-+M-OH+ R-N+M- +H2O是可逆的。三、離子交換樹脂的選擇三、離子交換樹脂的選擇1、若被分離的物質帶正

20、電荷，選擇陽離子交換樹脂。、若被分離的物質帶正電荷，選擇陽離子交換樹脂。反之，選擇陰離子交換樹脂。反之，選擇陰離子交換樹脂。2、若被分離的組分酸堿性強，易與離子交換樹脂進、若被分離的組分酸堿性強，易與離子交換樹脂進行可逆性，易被吸附，則用弱酸性的或弱堿性的離行可逆性，易被吸附，則用弱酸性的或弱堿性的離子交換樹脂，以免洗脫和再生困難。反之用強酸性子交換樹脂，以免洗脫和再生困難。反之用強酸性的或強堿性的離子交換樹脂。的或強堿性的離子交換樹脂。3、若被分離物質的分子量大，選擇低鉸鏈度的樹脂，、若被分離物質的分子量大，選擇低鉸鏈度的樹脂，若分子量小的用高鉸鏈度樹脂，以便于離子易于擴散若分子量小的用高鉸

21、鏈度樹脂，以便于離子易于擴散和交換。和交換。4、還要注意交換容量（單位重量或單位體積的樹脂所、還要注意交換容量（單位重量或單位體積的樹脂所能交換的離子的毫克當量數，單位是毫克當量能交換的離子的毫克當量數，單位是毫克當量/克表示。克表示。四、影響離子交換的因素四、影響離子交換的因素溶液的酸堿度溶液的酸堿度有重要影響：有重要影響：1、對于陽離子交換樹脂來說，交換溶液中氫離子、對于陽離子交換樹脂來說，交換溶液中氫離子濃度過高時，由于同離子效應，抑制了陽離子交換濃度過高時，由于同離子效應，抑制了陽離子交換樹脂中酸性基團的解離，離子間的交換就很少進行樹脂中酸性基團的解離，離子間的交換就很少進行或難以進行

22、?；螂y以進行。2、反之陰離子交換樹脂也是如此。、反之陰離子交換樹脂也是如此。所以強酸性樹脂交換液的所以強酸性樹脂交換液的PH值應大于值應大于3；弱酸性樹脂；弱酸性樹脂交換液的交換液的PH值應大于值應大于6；強堿性樹脂交換液的；強堿性樹脂交換液的PH值應值應小于小于10；弱堿性樹脂交換液的；弱堿性樹脂交換液的PH值應小于值應小于7。欲交換的化合物性質欲交換的化合物性質1、解離常數大，酸堿性強時，容易交換，但洗脫困難。、解離常數大，酸堿性強時，容易交換，但洗脫困難。2、解離離子的價數愈高，則吸附性愈強，愈易交換吸附；、解離離子的價數愈高，則吸附性愈強，愈易交換吸附；反之，難以交換吸附。反之，難以交

23、換吸附。欲交換的化合物的濃度欲交換的化合物的濃度通常在水或稀醇溶液中進行。通常在水或稀醇溶液中進行。1、濃度低，易于交換。、濃度低，易于交換。2、濃度高時，由于濃度差的影響，樹脂網孔會失水而造、濃度高時，由于濃度差的影響，樹脂網孔會失水而造成網孔收縮，影響交換。成網孔收縮，影響交換。交換液溫度的影響交換液溫度的影響（溫度高有利于交換，但熱不穩(wěn)定成分不（溫度高有利于交換，但熱不穩(wěn)定成分不適用）適用）交換溶劑的影響交換溶劑的影響（在極性小的溶劑里難以進行，主要是因為難（在極性小的溶劑里難以進行，主要是因為難解離）解離）交換流速的影響交換流速的影響（控制流速，否則交換不完全）（控制流速，否則交換不完

24、全）五五 操作方式操作方式樹脂的預處理樹脂的預處理（先用水浸泡（先用水浸泡2-3天再用天再用酸堿處理。陽離子交換樹脂鈉型用酸酸堿處理。陽離子交換樹脂鈉型用酸-堿堿-酸處理；酸處理；陰陽離子交換樹脂氯型用堿陰陽離子交換樹脂氯型用堿-酸酸-堿處理，以除去堿處理，以除去小分子有機物和鐵鈣等雜質）。小分子有機物和鐵鈣等雜質）。裝柱裝柱交換交換洗脫（先用自來水洗至無色，在用洗脫劑洗。酸性化洗脫（先用自來水洗至無色，在用洗脫劑洗。酸性化合物用一定濃度的酸來洗，合物用一定濃度的酸來洗，0.1-1N鹽酸鹽酸;堿性化合物用堿性化合物用一定濃度的堿來洗，一定濃度的堿來洗，0.1-1N氨水氨水;被吸附的化合物按酸被

25、吸附的化合物按酸堿性由小到大的順序先后被洗下堿性由小到大的順序先后被洗下)樹脂的再生樹脂的再生還是用酸堿處理還是用酸堿處理,加水保存加水保存.為了防止長時間不用而發(fā)霉為了防止長時間不用而發(fā)霉,可在可在水中加一層甲苯水中加一層甲苯)第四節(jié)第四節(jié) 大孔吸附樹脂柱層析大孔吸附樹脂柱層析一、基本原理一、基本原理主要為白色球形顆粒，粒度通常為主要為白色球形顆粒，粒度通常為2060目，為苯乙烯和二乙烯苯或目，為苯乙烯和二乙烯苯或2-甲基甲基丙稀酸樹脂等聚合而成的高分子網狀孔穴結構。理化性質穩(wěn)定，不溶于酸丙稀酸樹脂等聚合而成的高分子網狀孔穴結構。理化性質穩(wěn)定，不溶于酸堿及有機溶劑，對有機物有較好的選擇性，不

26、受無機鹽類及強離子低分堿及有機溶劑，對有機物有較好的選擇性，不受無機鹽類及強離子低分子化合物存在的影響。子化合物存在的影響。1、大孔吸附樹脂通過范德華力或形成氫鍵等分子間力吸附有機化合物。、大孔吸附樹脂通過范德華力或形成氫鍵等分子間力吸附有機化合物。2、其本身的多孔性網狀結構決定了具有篩選性分離的特點。、其本身的多孔性網狀結構決定了具有篩選性分離的特點。二、影響分離因素二、影響分離因素1、樹脂本身化學結構、樹脂本身化學結構極性樹脂用于吸附極性化合物，非極性樹脂用于吸附非極性化極性樹脂用于吸附極性化合物，非極性樹脂用于吸附非極性化合物。合物。2、被分離成分的性質、被分離成分的性質一般而言，極性較

27、大的成分適宜在中極性的樹脂上一般而言，極性較大的成分適宜在中極性的樹脂上進行分離，而極性較小的成分適宜在非極性的樹脂進行分離，而極性較小的成分適宜在非極性的樹脂上進行分離；化合物分子體積較大者，宜選用較大上進行分離；化合物分子體積較大者，宜選用較大孔徑者，以利于分離?？讖秸?，以利于分離。3、溶劑的影響、溶劑的影響（1）PH值的影響值的影響一般而言，酸性化合物宜在酸性溶液中被吸附；一般而言，酸性化合物宜在酸性溶液中被吸附；堿性化合物宜在堿性溶液中被吸附；堿性化合物宜在堿性溶液中被吸附；中性化合物宜在中性溶液中被吸附；中性化合物宜在中性溶液中被吸附；（2）洗脫劑的種類及濃度。）洗脫劑的種類及濃度。

28、對于非極性的樹脂，洗脫劑的極性越小，洗脫能力越強；對于非極性的樹脂，洗脫劑的極性越小，洗脫能力越強；對于中極性和極性樹脂，則宜選用極性較大的洗脫劑。對于中極性和極性樹脂，則宜選用極性較大的洗脫劑。三、操作方式三、操作方式 1、預處理（含有一定量的致孔劑、分散劑、未聚合的單體化預處理（含有一定量的致孔劑、分散劑、未聚合的單體化合物，以乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇在柱上流動清洗，不時合物，以乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇在柱上流動清洗，不時檢查流出的乙醇，當流出的乙醇液與水混合不呈現白色乳濁檢查流出的乙醇，當流出的乙醇液與水混合不呈現白色乳濁現象即可用大量的蒸餾水洗去乙醇）。現象即可用大量的蒸餾水洗去乙醇）

29、。2、裝柱和上樣、裝柱和上樣3、洗脫（水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等）、洗脫（水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等）4、樹脂柱的清洗（使用后其表面或內部會有許多非吸、樹脂柱的清洗（使用后其表面或內部會有許多非吸附性成分或吸附性雜質殘留，必須經清洗而除去）。附性成分或吸附性雜質殘留，必須經清洗而除去）。5、再生（若選用了非水溶性的有機溶劑作為洗脫劑，、再生（若選用了非水溶性的有機溶劑作為洗脫劑，用甲醇反復沖洗樹脂柱即可；若選用了水溶性的有機溶用甲醇反復沖洗樹脂柱即可；若選用了水溶性的有機溶劑作為洗脫劑，用蒸餾水反復沖洗樹脂柱即可）。劑作為洗脫劑，用蒸餾水反復沖洗樹脂柱即可）。第五節(jié)第五節(jié) 凝膠和柱

30、層析凝膠和柱層析一、基本概念一、基本概念又稱為凝膠濾過色譜、凝膠滲透色譜、分子篩濾過色譜及排阻又稱為凝膠濾過色譜、凝膠滲透色譜、分子篩濾過色譜及排阻色譜，是以凝膠作為固定相，選擇適當的溶劑進行洗脫，使色譜，是以凝膠作為固定相，選擇適當的溶劑進行洗脫，使混合物中分子量大小不同的化合物得到分離的方法。主要用混合物中分子量大小不同的化合物得到分離的方法。主要用于天然藥物中大小分子化合物的分離，如蛋白質、酶、多肽、于天然藥物中大小分子化合物的分離，如蛋白質、酶、多肽、氨基酸、多糖、甾體、苷類等。氨基酸、多糖、甾體、苷類等。二、基本原理二、基本原理凝膠是具有多孔性網狀結構的高分子化合物。由于受凝膠顆粒中

31、網孔半徑的限制，被分離試樣中比網孔小的化合物可自由進入凝膠顆粒內部；而比網孔大的化合物不能進入凝膠顆粒內部被排阻。三、凝膠的種類及性能三、凝膠的種類及性能1葡聚糖凝膠：又稱為交聯葡聚糖（Sephadex） ，是由葡聚糖和甘油通過醚橋(-OCH2CHOHCH2O-)相交鏈而成的多孔性網狀結構物質，其部分結構如圖所示。具有親水性，但不溶于水，稀酸堿和鹽溶液，能在水中溶脹成膠粒，在PH310穩(wěn)定，適用于分離水溶性成份如蛋白質，肽，氨基酸，糖及苷類等，應用最為廣泛。葡聚糖凝膠顆粒的網孔大小取決于制備時所添加交聯劑的比例。若交聯劑量多，則交聯度大，網孔緊密，孔徑小，吸水少；反之 交聯劑量少，網孔稀疏，孔

32、徑大，吸水多。商品型號按交聯度大小分類，并以每克干凝膠吸水量10倍的數值來表示，如凝膠G-25型表示吸水量為2.5ml/g的葡聚糖凝膠。不同規(guī)格的葡聚糖凝膠適合用于分離不同分子量的化合物。交聯葡聚糖的化學結構OC H2OO HO HOC H2C H2C H O HHHHHHC H2OHOHO HO HHHC H2OHOC H2OHO HO HHO HHOHOC H2OHO HO HHHO HHOC H3C H O HC H3OOO HHHO HHOC H2HOOHHO HHO HHC H2OOC H2C H3O HC H2O2葡聚糖凝膠LH-20（ Sephadex LH-20） ：葡聚糖凝膠LH-20分子中引入了親脂性