免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

1、人民衛(wèi)生出版社免疫學(xué)檢驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)人民衛(wèi)生出版社第二十二章第二十二章 免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)人民衛(wèi)生出版社 免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)檢免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)技術(shù) - -是利用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）與是利用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）與組織細(xì)胞內(nèi)抗原（或抗體）進(jìn)行的抗原抗體組織細(xì)胞內(nèi)抗原（或抗體）進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)組織和細(xì)胞反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)組織和細(xì)胞抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的免疫檢測(cè)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的免疫檢測(cè)方法。方法。 人民衛(wèi)生出版社免疫組化的檢測(cè)原理免疫組化的檢測(cè)原理人民衛(wèi)生出版社免疫

2、組化的檢測(cè)原理免疫組化的檢測(cè)原理人民衛(wèi)生出版社免疫組化的檢測(cè)原理免疫組化的檢測(cè)原理人民衛(wèi)生出版社第一節(jié)第一節(jié) 免疫組化檢驗(yàn)技術(shù)基本知識(shí)免疫組化檢驗(yàn)技術(shù)基本知識(shí)人民衛(wèi)生出版社免疫組化全過程免疫組化全過程人民衛(wèi)生出版社一、標(biāo)本制作一、標(biāo)本制作 標(biāo)本制作是獲得良好的免疫細(xì)胞組織化標(biāo)本制作是獲得良好的免疫細(xì)胞組織化學(xué)分析的保障，良好的細(xì)胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將學(xué)分析的保障，良好的細(xì)胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準(zhǔn)確顯示和定位。有助于抗原的準(zhǔn)確顯示和定位。 （一）標(biāo)本的主要來源（一）標(biāo)本的主要來源 主要有：主要有： 活體組織活體組織 各種體液及穿刺液各種體液及穿刺液 培養(yǎng)細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞等 人民衛(wèi)生出版社（二）標(biāo)本

3、的固定與保存（二）標(biāo)本的固定與保存 1組織材料的固定目的組織材料的固定目的 防止組織細(xì)胞的死后變化，以保持其固有形態(tài)防止組織細(xì)胞的死后變化，以保持其固有形態(tài) 使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu) 使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，以便染色后易于鑒別和觀察的折射率，以便染色后易于鑒別和觀察 固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，便于制片固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，便于制片 防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其

4、原有形態(tài)結(jié)構(gòu) 經(jīng)過固定的組織能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著經(jīng)過固定的組織能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認(rèn)。色清晰，便于辨認(rèn)。人民衛(wèi)生出版社 2固定劑的選擇固定劑的選擇 最佳固定劑的標(biāo)準(zhǔn)最佳固定劑的標(biāo)準(zhǔn) 最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu) 最大限度地保存抗原的免疫活性最大限度地保存抗原的免疫活性 3固定方法固定方法 固定方法常用固定方法常用 浸泡法浸泡法主要適用于活檢和手術(shù)標(biāo)本以及主要適用于活檢和手術(shù)標(biāo)本以及其它不能進(jìn)行灌注的組織固定。其它不能進(jìn)行灌注的組織固定。 灌注法灌注法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社（三）玻片的處理

5、（三）玻片的處理 玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟之一驟之一 一般用免疫組織化學(xué)的載玻片均需涂一定一般用免疫組織化學(xué)的載玻片均需涂一定的黏合劑，常用的切片黏合劑有樹脂膠、多的黏合劑，常用的切片黏合劑有樹脂膠、多聚賴氨酸和防脫片劑聚賴氨酸和防脫片劑（四）切片方法的選擇（四）切片方法的選擇人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社二、抗原處理二、抗原處理（一）進(jìn)行抗原的暴露和修復(fù)的原因（一）進(jìn)行抗原的暴露和修復(fù)的原因 1.固定液的影響固定液的影響 2.抗體制備的影響抗體制備的影響 （二）抗原的暴露（二）抗原的暴露 主要采用酶消化的方法主要采用酶消化的方法 在選擇酶消化時(shí)

6、，應(yīng)針對(duì)要顯示的不同在選擇酶消化時(shí)，應(yīng)針對(duì)要顯示的不同的抗原成分而選用不同的酶的抗原成分而選用不同的酶 在日常工作中用胰蛋白酶消化即可在日常工作中用胰蛋白酶消化即可 人民衛(wèi)生出版社（三）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)（三）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù) 抗原修復(fù)是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定石抗原修復(fù)是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)以提高抗原抗體的陽性蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)以提高抗原抗體的陽性檢出率檢出率 微波處理法微波處理法 水浴鍋法水浴鍋法 壓力鍋法壓力鍋法人民衛(wèi)生出版社三、抗體處理三、抗體處理 抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的首要試劑抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的首要試劑 （一）抗體的選擇（一）抗體的選擇 具有高度特異性和穩(wěn)定

7、性的優(yōu)質(zhì)抗體具有高度特異性和穩(wěn)定性的優(yōu)質(zhì)抗體 （二）抗體的稀釋（二）抗體的稀釋 抗原抗體反應(yīng)須有適當(dāng)?shù)谋壤^量或不抗原抗體反應(yīng)須有適當(dāng)?shù)谋壤?，過量或不足均不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果足均不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果 （三）抗體的合理保存（三）抗體的合理保存 要特別注意保持抗體的生物活性要特別注意保持抗體的生物活性 人民衛(wèi)生出版社四、常用標(biāo)記物四、常用標(biāo)記物（一）熒光素（一）熒光素 如：異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明等如：異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明等（二）酶（二）酶 如：辣根過氧化物酶如：辣根過氧化物酶(HRP) （三）生物素（三）生物素-親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng)（四）免疫金標(biāo)記技術(shù)（四）免疫金標(biāo)記技術(shù)（五）免疫鐵蛋白技

8、術(shù)（五）免疫鐵蛋白技術(shù)人民衛(wèi)生出版社五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷（一）對(duì)照染色設(shè)計(jì)（一）對(duì)照染色設(shè)計(jì) 為了保證免疫組織化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，證明和為了保證免疫組織化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除某些非特異性染色，肯定陽性結(jié)果的特異性，排除某些非特異性染色，通常需針對(duì)第一抗體設(shè)立對(duì)照。通常需針對(duì)第一抗體設(shè)立對(duì)照。 1.1.陽性對(duì)照陽性對(duì)照 用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。疫組織化學(xué)染色。 目的是證實(shí)所用免疫組化染色流程的有效性，目的是證實(shí)所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。排

9、除假陰性的可能。 2.2.陰性對(duì)照陰性對(duì)照 用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對(duì)照。結(jié)果，稱陰性對(duì)照。 目的是排除假陽性。目的是排除假陽性。 人民衛(wèi)生出版社3.3.陰性試劑對(duì)照陰性試劑對(duì)照 是指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試是指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試劑（尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠劑（尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性）而設(shè)立的同步免疫染色對(duì)照，包括有：性）而設(shè)立的同步免疫染色對(duì)照，包括有：空白對(duì)照、替代對(duì)照、吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)空白對(duì)照、替代對(duì)照、吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)等。等。4.4.自身對(duì)照自身對(duì)照 是指在同一標(biāo)記切片上的

10、自身組織成分是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對(duì)照。的陰性背景對(duì)照。 人民衛(wèi)生出版社（二）陽性結(jié)果（二）陽性結(jié)果 陽性細(xì)胞的顯色可位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)陽性細(xì)胞的顯色可位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核胞核 免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性、定量免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性、定量指標(biāo)指標(biāo) 陽性細(xì)胞的著色形態(tài)（如胞膜型、胞核型、陽性細(xì)胞的著色形態(tài)（如胞膜型、胞核型、胞質(zhì)胞質(zhì)( (漿漿) )型等）及組織分布特點(diǎn)（如局灶型、型等）及組織分布特點(diǎn)（如局灶型、彌漫型、片塊型等）主要是定位指標(biāo)彌漫型、片塊型等）主要是定位指標(biāo) 哪怕只有少數(shù)細(xì)胞陽性（只要是抗原所在部哪怕只有少數(shù)細(xì)胞陽性（只要是抗原所在

11、部位）也應(yīng)視為陽性表達(dá)位）也應(yīng)視為陽性表達(dá)人民衛(wèi)生出版社（三）陰性結(jié)果（三）陰性結(jié)果 陰性結(jié)果不能簡(jiǎn)單視為抗原不表達(dá)，由于陰性結(jié)果不能簡(jiǎn)單視為抗原不表達(dá)，由于染色方法靈敏度有高低之分，有時(shí)可因靈敏度染色方法靈敏度有高低之分，有時(shí)可因靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)。不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)。（四）特異性顯色和非特異性顯色的鑒別（四）特異性顯色和非特異性顯色的鑒別 1.1.分布位置分布位置 特異性反應(yīng)必須分布于特定抗原部位特異性反應(yīng)必須分布于特定抗原部位 非特異性反應(yīng)無一定的分布規(guī)律非特異性反應(yīng)無一定的分布規(guī)律 人民衛(wèi)生出版社2.2.顯色強(qiáng)度顯色強(qiáng)度 特異性反應(yīng)由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，特異性反應(yīng)由于細(xì)胞內(nèi)

12、抗原含量不同，顯色強(qiáng)度不一。陽性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)顯色強(qiáng)度不一。陽性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并與陰性細(xì)胞間有明顯間隔胞，并與陰性細(xì)胞間有明顯間隔 而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，常而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，常為成片的細(xì)胞為成片的細(xì)胞 3.3.其他其他 在過大的組織塊，中心固定不良也會(huì)導(dǎo)在過大的組織塊，中心固定不良也會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色致非特異性顯色 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社六、質(zhì)量控制六、質(zhì)量控制 質(zhì)量控制是免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)取得滿質(zhì)量控制是免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)取得滿意結(jié)果的必要條件。意結(jié)果的必要條件。（一）試劑質(zhì)量控制（一）試劑質(zhì)量控制 抗體的質(zhì)量是免疫組織化學(xué)染色成功的關(guān)鍵抗體

13、的質(zhì)量是免疫組織化學(xué)染色成功的關(guān)鍵 （二）操作過程質(zhì)量控制（二）操作過程質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 標(biāo)本的質(zhì)量控制標(biāo)本的質(zhì)量控制（三）儀器設(shè)備和器具的質(zhì)量控制（三）儀器設(shè)備和器具的質(zhì)量控制人民衛(wèi)生出版社第二節(jié)第二節(jié) 酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是在一定條件下，酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細(xì)胞標(biāo)本中應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，然后加入酶的底的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，然后加入酶的底物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可識(shí)別出標(biāo)本中抗原（抗體）的分布和性質(zhì)；識(shí)別

14、出標(biāo)本中抗原（抗體）的分布和性質(zhì)；也可通過圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。也可通過圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。人民衛(wèi)生出版社一、標(biāo)本制作一、標(biāo)本制作 常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片 酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可分為酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可分為 酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色法酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色法 非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色法非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色法人民衛(wèi)生出版社二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法（一）原理（一）原理 酶標(biāo)記抗體的免疫組織化學(xué)染色法是酶標(biāo)記抗體的免疫組織化學(xué)染色法是借助交聯(lián)劑的共價(jià)鍵作用將酶直接連接在借助

15、交聯(lián)劑的共價(jià)鍵作用將酶直接連接在抗體（或抗抗體）上，酶標(biāo)抗體（或抗抗抗體（或抗抗體）上，酶標(biāo)抗體（或抗抗體）與組織內(nèi)特異抗原或抗原抗體復(fù)合物體）與組織內(nèi)特異抗原或抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)后，通過酶對(duì)底物的催化作用，生成反應(yīng)后，通過酶對(duì)底物的催化作用，生成不溶性有色產(chǎn)物并沉淀在特定位置，達(dá)到不溶性有色產(chǎn)物并沉淀在特定位置，達(dá)到對(duì)抗原定性、定位、定量檢測(cè)的目的。對(duì)抗原定性、定位、定量檢測(cè)的目的。 人民衛(wèi)生出版社（二）技術(shù)類型（二）技術(shù)類型 1.1.直接法直接法 形成抗原一抗體一酶復(fù)合物形成抗原一抗體一酶復(fù)合物2.2.間接法間接法 形成形成Ag-Ab1-Ab2Ag-Ab1-Ab2E E復(fù)合物復(fù)合物3.3.

16、酶標(biāo)抗體三步染色法酶標(biāo)抗體三步染色法 為間接法的改良法為間接法的改良法 形成形成Ag-Ab1-Ab2Ag-Ab1-Ab2E-Ab3E-Ab3E E復(fù)合物復(fù)合物（三）方法評(píng)價(jià)（三）方法評(píng)價(jià)人民衛(wèi)生出版社三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法（一）原理（一）原理 該技術(shù)首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、該技術(shù)首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體（特異性強(qiáng)的抗酶抗體（Ab3Ab3），將酶與），將酶與Ab3Ab3結(jié)結(jié)合形成復(fù)合物，然后利用第二抗體（合形成復(fù)合物，然后利用第二抗體（Ab2Ab2）作）作橋，橋，Ab2Ab2既可與既可與 Ab3Ab3的的FcFc段結(jié)合，又可與結(jié)

17、合段結(jié)合，又可與結(jié)合在組織抗原上的第一抗體（在組織抗原上的第一抗體（Ab1Ab1）的）的FcFc段結(jié)合，段結(jié)合，經(jīng)酶催化底物的顯色反應(yīng)，達(dá)到對(duì)抗原的檢經(jīng)酶催化底物的顯色反應(yīng)，達(dá)到對(duì)抗原的檢測(cè)。測(cè)。 人民衛(wèi)生出版社（二）技術(shù)類型（二）技術(shù)類型1.1.酶橋法酶橋法 用辣根過氧化物酶（用辣根過氧化物酶（HRPHRP）免疫動(dòng)物（如）免疫動(dòng)物（如兔）制備抗兔）制備抗HRPHRP的抗體（的抗體（Ab3Ab3），經(jīng)），經(jīng)Ab2Ab2（如羊（如羊抗兔）作橋，將結(jié)合在組織抗原上的抗兔）作橋，將結(jié)合在組織抗原上的Ab1(Ab1(兔兔抗相應(yīng)組織抗原的抗體抗相應(yīng)組織抗原的抗體) )與與Ab3Ab3連接起來，最連接起來

18、，最后將后將HRPHRP與與Ab3Ab3結(jié)合形成結(jié)合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRPAg-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復(fù)合物，加底物顯色復(fù)合物，加底物顯色 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社2.PAP2.PAP法法 即過氧化物酶（即過氧化物酶（P P）- -抗過氧化物酶（抗過氧化物酶（APAP）法，）法，為酶橋法的改良，技術(shù)要點(diǎn)基本上與酶橋法為酶橋法的改良，技術(shù)要點(diǎn)基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（抗過氧化物酶相同，但該法將抗酶抗體（抗過氧化物酶（APAP）與酶（過氧化物酶（）與酶（過氧化物酶（P P）制成了可）制成了可溶性復(fù)合物（溶性復(fù)合物（PAPPAP）, ,該復(fù)合物由該復(fù)合物由2

19、 2個(gè)抗酶抗體個(gè)抗酶抗體和和3 3個(gè)過氧化物酶分子組成，呈五角形，非常個(gè)過氧化物酶分子組成，呈五角形，非常穩(wěn)定。穩(wěn)定。 通過橋抗體（通過橋抗體（Ab2Ab2）將特異性識(shí)別組織抗原的）將特異性識(shí)別組織抗原的抗體（抗體（Ab1Ab1）與）與PAPPAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起復(fù)合物的抗酶抗體連接起來來人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社3.3.雙橋雙橋PAPPAP法法 該法是該法是PAPPAP法的改良，通過兩次連接橋抗法的改良，通過兩次連接橋抗體和體和PAPPAP，形成，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAPAg-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP復(fù)合復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)

20、合了比物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比PAPPAP法更多法更多的酶分子，大大增強(qiáng)了方法的敏感性。的酶分子，大大增強(qiáng)了方法的敏感性。4.APAAP4.APAAP法法 APAAP APAAP法就是以堿性磷酸酶代替法就是以堿性磷酸酶代替HRPHRP建立建立的堿性磷酸酶（的堿性磷酸酶（APAP）- - 抗堿性磷酸酶（抗堿性磷酸酶（AAPAAP）法，簡(jiǎn)稱法，簡(jiǎn)稱APAAPAPAAP法。技術(shù)要點(diǎn)與法。技術(shù)要點(diǎn)與PAPPAP法相似。法相似。人民衛(wèi)生出版社（三）方法評(píng)價(jià)（三）方法評(píng)價(jià) 該技術(shù)既可檢測(cè)抗原，又可檢測(cè)抗體。該技術(shù)既可檢測(cè)抗原，又可檢測(cè)抗體。由于酶不是標(biāo)記在抗體上，而是經(jīng)抗原（酶）由于酶不是標(biāo)記在抗體

21、上，而是經(jīng)抗原（酶）抗體反應(yīng)與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標(biāo)抗體抗體反應(yīng)與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標(biāo)抗體的缺點(diǎn)，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋的缺點(diǎn)，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋PAPPAP法，是當(dāng)今免疫組化技術(shù)中敏感性較高的法，是當(dāng)今免疫組化技術(shù)中敏感性較高的方法。方法。人民衛(wèi)生出版社四、臨床應(yīng)用四、臨床應(yīng)用 酶免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)主要用于組織酶免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定性、定位、定量檢測(cè)。切片或其它抗原的定性、定位、定量檢測(cè)。組織切片中各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、組織切片中各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細(xì)胞、病毒、腫瘤抗原、漿細(xì)胞酶、激素、細(xì)胞、病毒、腫瘤抗原

22、、漿細(xì)胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細(xì)胞表面標(biāo)志中的免疫球蛋白、各種多肽、細(xì)胞表面標(biāo)志等均可檢測(cè)。等均可檢測(cè)。人民衛(wèi)生出版社第三節(jié)第三節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)熒光免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先用利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先用熒光素標(biāo)記已知抗體并以此作為探針，檢查熒光素標(biāo)記已知抗體并以此作為探針，檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后，即會(huì)發(fā)出一定波長的熒光，進(jìn)光的照射后，即會(huì)發(fā)出一定波長的熒光，進(jìn)而對(duì)組織中的某種抗原進(jìn)行定性、定位和定而對(duì)

23、組織中的某種抗原進(jìn)行定性、定位和定量分析量分析。人民衛(wèi)生出版社一、標(biāo)本制作一、標(biāo)本制作 常見的臨床標(biāo)本材料主要有組織、細(xì)胞常見的臨床標(biāo)本材料主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，按不同標(biāo)本性質(zhì)可制作涂片、和細(xì)菌三大類，按不同標(biāo)本性質(zhì)可制作涂片、印片或組織切片等。印片或組織切片等。（一）載玻片和蓋玻片的處理（一）載玻片和蓋玻片的處理 載玻片和蓋玻片要厚薄均勻、潔凈及載玻片和蓋玻片要厚薄均勻、潔凈及透光性好透光性好 人民衛(wèi)生出版社（二）制片（二）制片 1 1組織切片組織切片 組織材料可制備成冰凍切片或石蠟切片。組織材料可制備成冰凍切片或石蠟切片。 2 2印片印片 組織材料也可制成印片。組織材料也可制成印片

24、。 3 3涂片涂片 細(xì)胞或細(xì)菌要制成涂片，涂片應(yīng)細(xì)胞或細(xì)菌要制成涂片，涂片應(yīng)薄且均勻。薄且均勻。 人民衛(wèi)生出版社（三）標(biāo)本的固定（三）標(biāo)本的固定 主要目的是：主要目的是： 1.1.防止細(xì)胞或切片從玻片上脫落防止細(xì)胞或切片從玻片上脫落 2.2.去除妨礙抗原抗體結(jié)合的類脂去除妨礙抗原抗體結(jié)合的類脂 3.3.便于保存。除活細(xì)胞外，其他標(biāo)本應(yīng)便于保存。除活細(xì)胞外，其他標(biāo)本應(yīng)在染色前以適當(dāng)?shù)姆绞焦潭?。在染色前以適當(dāng)?shù)姆绞焦潭ā?（四）標(biāo)本片的保存（四）標(biāo)本片的保存 固定好的標(biāo)本片應(yīng)盡快熒光染色檢查，固定好的標(biāo)本片應(yīng)盡快熒光染色檢查，如需保存，置如需保存，置-20-20下低溫干燥保存。下低溫干燥保存。 人

25、民衛(wèi)生出版社二、熒光抗體標(biāo)記及染色二、熒光抗體標(biāo)記及染色 熒光抗體是熒光免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑，熒光抗體是熒光免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑，是將熒光素與特異性抗體通過共價(jià)鍵的方式是將熒光素與特異性抗體通過共價(jià)鍵的方式結(jié)合而成。其制備過程通常包括抗體的標(biāo)記、結(jié)合而成。其制備過程通常包括抗體的標(biāo)記、純化和鑒定三步。純化和鑒定三步。 在已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒在已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體，置于帶蓋的濕盒內(nèi)，光抗體，置于帶蓋的濕盒內(nèi)，3737溫育溫育30min30min。檢測(cè)不耐熱抗原以檢測(cè)不耐熱抗原以44過夜為宜。溫育后充分過夜為宜。溫育后充分洗滌、干燥、鏡檢。洗滌、干燥、鏡檢。 人民衛(wèi)生出版

26、社三、臨床應(yīng)用三、臨床應(yīng)用 1.在自身免疫性疾病中的應(yīng)用在自身免疫性疾病中的應(yīng)用 2.2.各種病原微生物的快速檢查和鑒定各種病原微生物的快速檢查和鑒定 3.3.寄生蟲感染的診斷寄生蟲感染的診斷 4.4.白細(xì)胞分化抗原的檢測(cè)白細(xì)胞分化抗原的檢測(cè) 此外還應(yīng)用于此外還應(yīng)用于HLAHLA、腫瘤組織中的腫瘤、腫瘤組織中的腫瘤抗原、組織中的免疫球蛋白和補(bǔ)體組分、抗原、組織中的免疫球蛋白和補(bǔ)體組分、激素和酶的定位等。激素和酶的定位等。人民衛(wèi)生出版社第四節(jié)第四節(jié) 親和組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)親和組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 親和組織化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高親和組織化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價(jià)

27、度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如生物素、葡萄球菌或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如生物素、葡萄球菌A A蛋蛋白、植物血凝素等，對(duì)某種組織成分具有高白、植物血凝素等，對(duì)某種組織成分具有高度親和力，可與蛋白質(zhì)、糖類、熒光素和酶度親和力，可與蛋白質(zhì)、糖類、熒光素和酶等多種類型的大小分子結(jié)合形成相應(yīng)復(fù)合物，等多種類型的大小分子結(jié)合形成相應(yīng)復(fù)合物，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)等技采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)等技術(shù)，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)術(shù)，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)的定位、定性或定量分析。的定位、定性或定量分析。 用于親和組織化學(xué)的物質(zhì)有生物素與親和用于親和組

28、織化學(xué)的物質(zhì)有生物素與親和素、植物凝集素與糖類、素、植物凝集素與糖類、SPASPA與與IgGIgG、鏈霉親、鏈霉親和素與生物素等。和素與生物素等。 人民衛(wèi)生出版社一、生物素一、生物素-親和素法親和素法 生物素可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類生物素可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。 親和素也稱抗生物素，每個(gè)親和素分子親和素也稱抗生物素，每個(gè)親和素分子有生物素結(jié)合的有生物素結(jié)合的4 4個(gè)位點(diǎn)，二者可牢固結(jié)合成個(gè)位點(diǎn)，二者可牢固結(jié)合成不可逆的復(fù)合物。不可逆的復(fù)合物。 人民衛(wèi)生出版社 常用的技術(shù)類型有：常用的技術(shù)類型有：1.1.標(biāo)記親和素標(biāo)記親和素

29、- -生物素法（生物素法（LABLAB法）法） 將親和素與標(biāo)記物（將親和素與標(biāo)記物（HRPHRP）結(jié)合，一個(gè)親）結(jié)合，一個(gè)親合素可結(jié)合多個(gè)合素可結(jié)合多個(gè)HRPHRP；將生物素與抗體（一抗；將生物素與抗體（一抗與二抗）結(jié)合，一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生與二抗）結(jié)合，一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生物素分子，抗體的活性不受影響。細(xì)胞的抗物素分子，抗體的活性不受影響。細(xì)胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將標(biāo)記親和素結(jié)合在抗體的生物素上，繼而將標(biāo)記親和素結(jié)合在抗體的生物素上，如此多層放大，提高了檢測(cè)抗原的敏感性。如此多層放大，提高了檢測(cè)抗原的敏感性。人民衛(wèi)生

30、出版社人民衛(wèi)生出版社2.2.橋連親和素橋連親和素- -生物素法（生物素法（BABBAB法）法） 先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親和素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素游離親和素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果。搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社3. 3. 親和素親和素- -生物素生物素- -辣根過氧化物酶復(fù)合物法辣根過氧化物酶復(fù)合物法（ABCABC法）法） 此法是前兩種方法的改進(jìn)，即先按一定此法是前兩種方法的改進(jìn)，即先按一定比例將親和素與酶（辣根過氧化物酶）標(biāo)生比例將親和素與酶（辣根過氧化物酶）標(biāo)生物素結(jié)合在

31、一起，形成親和素物素結(jié)合在一起，形成親和素- -生物素生物素- -辣根辣根過氧化物酶復(fù)合物（過氧化物酶復(fù)合物（ABCABC復(fù)合物），當(dāng)其與檢復(fù)合物），當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABCABC中中未飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生未飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，物素結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，加底物顯色，可大其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，加底物顯色，可大大提高檢測(cè)抗原的靈敏度。大提高檢測(cè)抗原的靈敏度。 人民

32、衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社二、二、SPA法法 SPA SPA具有和人及許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小具有和人及許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小鼠、猴等的鼠、猴等的IgG FcIgG Fc結(jié)合的能力，這種結(jié)合不結(jié)合的能力，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。每個(gè)會(huì)影響抗體的活性。每個(gè)SPASPA分子可同時(shí)結(jié)合分子可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)兩個(gè)IgGIgG分子，也可一方面同分子，也可一方面同IgGIgG相結(jié)合，一相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、膠體方面與標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。金和鐵蛋白等相結(jié)合。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社三、鏈霉親和素三、鏈霉親和素生物素技術(shù)生物素技術(shù) 鏈霉親和素與生物素的結(jié)

33、合是已知自然鏈霉親和素與生物素的結(jié)合是已知自然界中最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一，其功能類界中最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一，其功能類似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親和素蛋白就組成酶標(biāo)鏈霉親和素的鏈霉親和素蛋白就組成酶標(biāo)鏈霉親和素- -生生物素方法（物素方法（LSABLSAB）。）。 LSABLSAB法的特點(diǎn)法的特點(diǎn): :特異性強(qiáng)；分子量小，特異性強(qiáng)；分子量小，穿透力強(qiáng)，放大效應(yīng)遠(yuǎn)超穿透力強(qiáng)，放大效應(yīng)遠(yuǎn)超ABCABC法，故其敏感性法，故其敏感性更強(qiáng)；等電點(diǎn)中性更適合組織，可明顯減更強(qiáng)；等電點(diǎn)中性更適合組織，可明顯減少非特異性染色，低背景著色使特異性著色少

34、非特異性染色，低背景著色使特異性著色更清晰；操作時(shí)間縮短，更簡(jiǎn)便。更清晰；操作時(shí)間縮短，更簡(jiǎn)便。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社四、凝集素法四、凝集素法 一種凝集素具有專一性結(jié)合某種特異一種凝集素具有專一性結(jié)合某種特異性糖基的能力，同時(shí)所有生物膜都含有一性糖基的能力，同時(shí)所有生物膜都含有一定量的糖類，后者主要以糖蛋白和糖脂的定量的糖類，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作為一種探針形式存在。因此，凝集素可作為一種探針來研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另一方面，來研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白

35、等示蹤物結(jié)生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。位。 人民衛(wèi)生出版社 一般認(rèn)為細(xì)胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別一般認(rèn)為細(xì)胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細(xì)胞的類型并反映細(xì)胞在分化、成熟和細(xì)胞細(xì)胞的類型并反映細(xì)胞在分化、成熟和細(xì)胞病變中的變化。病變中的變化。 標(biāo)記了相應(yīng)示蹤物的凝集素可用來：標(biāo)記了相應(yīng)示蹤物的凝集素可用來： 作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記 作為細(xì)胞特殊類型的標(biāo)記作為細(xì)胞特殊類型的標(biāo)記 腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上的糖基也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，也可用凝集素的糖基也會(huì)

36、產(chǎn)生相應(yīng)的變化，也可用凝集素檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞。檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞。 人民衛(wèi)生出版社 常用下列染色法：常用下列染色法： 直接法直接法標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合 間接法間接法將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素抗體上基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素抗體上 糖糖凝集素凝集素糖法糖法 本法是利用過量的本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合，經(jīng)凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合，經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，未結(jié)合部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異位，未結(jié)合部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)“三明治樣三明治樣”的的糖糖凝集素凝集素糖的結(jié)合物。糖的結(jié)合物。人民衛(wèi)生出版社第五節(jié)第五節(jié) 其他免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)其他免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)一、金免疫組織化學(xué)技術(shù)一、金免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為標(biāo)記物。免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為