免疫組化原理及流程介紹培訓(xùn)講學(xué)

1、免疫組化原理及流程介紹 主要內(nèi)容主要內(nèi)容免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹一一. .免疫組化的發(fā)展簡史免疫組化的發(fā)展簡史二二. .免疫組化的原理免疫組化的原理三三. .免疫組化的基本流程免疫組化的基本流程四四. .免疫組化的結(jié)果分析免疫組化的結(jié)果分析免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹 它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡( (包包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡括熒光顯微鏡、電子顯微鏡) )的顯像和放的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)原物

2、質(zhì)( (如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等原體以及受體等) )。 三三 免疫組化的基本流程免疫組化的基本流程免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹1.1.脫蠟與水化脫蠟與水化2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶 3.3.抗原修復(fù)、暴抗原修復(fù)、暴露抗原決定簇露抗原決定簇 4.4.封閉非特異性封閉非特異性蛋白蛋白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反應(yīng)反應(yīng) 8.8.顯色顯色 9.9.復(fù)染、脫水、復(fù)染、脫水、透明、封片透明、封片 2.2.細(xì)胞通透、封細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化閉內(nèi)源性過氧化物酶物酶 免疫組化原理及流程介紹免

3、疫組化原理及流程介紹1.1.脫蠟與水化脫蠟與水化 脫蠟與水化的脫蠟與水化的目的目的是確?？贵w等其是確?？贵w等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合發(fā)他試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶生反應(yīng)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。景著色。 60 20 minXylene：2 10 minutes； 100% absolute ethanol： 2 5 minutes； 95% ethanol 2 minutes； 80% ethanol 2 minutes； 70% ethanol 2 minutes；

4、 distilled water:5 min； PBS 洗 3 3 min。 具具體體操操作作免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹2.2.細(xì)胞通透與封閉內(nèi)源性過氧化酶細(xì)胞通透與封閉內(nèi)源性過氧化酶 目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100Triton X-100、蛋白酶蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)細(xì)胞通透細(xì)胞通透免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹(2)(2)封閉內(nèi)源性過氧化酶封閉內(nèi)源性過氧化酶 其主要目的是降低內(nèi)源性過氧其主要目的是降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。在傳統(tǒng)的化物酶的活性

5、。在傳統(tǒng)的ABCABC法和法和SPSP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，必須用內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，必須用過氧化氫等進(jìn)行滅活。過氧化氫等進(jìn)行滅活。 1)1)用封閉通透液浸潤切片用封閉通透液浸潤切片 30 min30 min（RT RT 避避光）。光）。 其配法是用預(yù)熱其配法是用預(yù)熱 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul 120ul TritonX-100 TritonX-100 加熱幾分鐘，在臨用前加加熱幾分鐘，在臨用前加 400 ul400 ul的的3030H H2 2O O2 2。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3

6、 3 次次3 min3 min。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹具體操作具體操作: :免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹3. 3. 抗原修復(fù)抗原修復(fù) 暴露抗原決定簇暴露抗原決定簇 由于組織中部分抗原在甲醛或多由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹 常用的修復(fù)方法從強到弱一般常用的

7、修復(fù)方法從強到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。胰酶修復(fù)。 抗原修復(fù)的主要方法抗原修復(fù)的主要方法: :酶消化方法酶消化方法一般用于細(xì)一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原胞內(nèi)抗原應(yīng)用高頻電磁波應(yīng)用高頻電磁波打開蛋白質(zhì)間的打開蛋白質(zhì)間的交聯(lián)鍵交聯(lián)鍵免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹將切片放入將切片放入 0.01 M 0.01 M 檸檬酸鈉緩沖檸檬酸鈉緩沖 溶液（溶液（pH6.0pH6.0）后，在微波爐里高火）后，在微波爐里高火 4 min 4 min 至沸騰后，取出，冷卻至室溫，至沸騰后，取出，冷卻至室溫，再加熱，約再加熱，約4 4次，每次間隔補足液體，次，每次間

8、隔補足液體，防止干片。防止干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。具體操作（微波修復(fù)）：具體操作（微波修復(fù)）：1)免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹4.4.封閉特異性蛋白封閉特異性蛋白組織切片上有些組織切片上有些剩余剩余的位點可以與一的位點可以與一抗抗非特異性結(jié)合非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的，造成后續(xù)結(jié)果的假假陽性陽性。封閉血清一般是和二抗同一來源的，血封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中有一些動物自身的抗體，預(yù)先能和清中有一些動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合。組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合。 免疫組化原理及流程介紹免疫組

9、化原理及流程介紹 將切片取出將切片取出, ,周圍水分用濾紙吸干周圍水分用濾紙吸干, ,用組化用組化筆在組織周圍畫上圈筆在組織周圍畫上圈, ,在圓圈內(nèi)組織滴入在圓圈內(nèi)組織滴入 5%5%羊羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中, ,室溫室溫 ( (約約30)30)下下101030min30min。 具體操作：具體操作：大一點免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗: :可以特異結(jié)合底物，就是識別出可以特異結(jié)合底物，就是識別出我們想要檢測的東西。一抗和底物結(jié)我們想要檢測的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來的。合與否用肉眼是看不

10、出來的。 一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。包括孵育時間和抗體濃度。 一抗孵育溫度有幾種：一抗孵育溫度有幾種：4 4度、室溫、度、室溫、3737度，度，其中其中4 4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般體濃度有關(guān)，一般3737度度1-2h1-2h，然后，然后4 4度過夜和度過夜和從冰箱拿出后從冰箱拿出后3737度復(fù)溫度復(fù)溫45min45min。具體條件還要。具體條件還要摸索。摸索。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹1.防止脫片；防止脫片；2.使抗原使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定?？贵w

11、結(jié)合更穩(wěn)定。 甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清, ,用濾紙擦干組織周用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入濕盒中室溫）后，放入濕盒中室溫 1 1 小時，然后小時，然后 4 4 度過夜，冰箱中取出后需度過夜，冰箱中取出后需37 37 復(fù)溫復(fù)溫 45 min45 min。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹具體做法：具體做法：免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗: :可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測出的標(biāo)記檢測

12、出的標(biāo)記( (如帶熒光、放射性、化如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），作用是檢測一抗。學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），作用是檢測一抗。 二抗孵育條件：二抗一般室溫或二抗孵育條件：二抗一般室溫或3737度度30min-1h30min-1h，具體時間需要摸索。，具體時間需要摸索。 但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛鹊诿庖呓M化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群秃头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。孵育時間。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹 1) 1)將一抗倒掉并用將一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5 min5 min5 5 次；次； 2) 2)用濾紙將

13、圓圈周圍的水吸去，加入已用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入稀釋的二抗后放入 3737恒溫烤箱中恒溫烤箱中 30 min。 3) 3)用用 PBS PBS 洗洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹具體操作：具體操作：7.SP7.SP反應(yīng)反應(yīng) SP SP染色法即鏈霉素抗生物素蛋白染色法即鏈霉素抗生物素蛋白 生物素過氧化酶連接法。生物素過氧化酶連接法。 該法是該法是ABCABC法基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改良，法基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結(jié)合，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結(jié)合，而后再結(jié)合而后再結(jié)合POPO基。基。 免疫組化原理及流

14、程介紹免疫組化原理及流程介紹1 1） 加入加入 SP SP 復(fù)合液后放入復(fù)合液后放入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。 2 2） 用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5 min。具體操作：具體操作：SPSP染色法的特點染色法的特點: : 靈敏特異性低，成本低。靈敏特異性低，成本低。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹8.8.顯色顯色 在免疫組化中，由于抗原抗體所在免疫組化中，由于抗原抗體所形成的復(fù)合物本身沒有顏色，不能形成的復(fù)合物本身沒有顏色，不能直接觀察，只能借助于其他某些化直接觀察，只能借助于其他某些化學(xué)基團(tuán)的顯色作用，是復(fù)合物顯色，學(xué)基團(tuán)的顯色作用，是復(fù)合物顯色，有利

15、于顯微鏡下觀察有利于顯微鏡下觀察。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹 通常在過氧化物酶（通常在過氧化物酶（HRPHRP）法中，顯）法中，顯色劑為色劑為DABDAB。DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色液二氨基聯(lián)苯胺顯色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹9 9、復(fù)染、脫水、透明、封片、復(fù)染、脫水、透明、封片 復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用的試劑好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用的試劑為蘇木素。為蘇木素。 片

16、子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動作要快）后拿出流水酒精中數(shù)秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返藍(lán)即可。振洗，在放入氨水中返藍(lán)即可。 1) 1) 用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用雙蒸水洗后，用雙蒸水洗 5 min5 min；加；加一大滴蘇木素染液，（胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜一大滴蘇木素染液，（胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染蛋白染 20 s 20 s ），自來水沖洗，雙蒸水洗），自來水沖洗，雙蒸水洗 5 min5 min，再，再用用 PBS PBS 返藍(lán)返藍(lán) 5 min5 min。 2) 2) 脫水脫水

17、：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 3) 3) 透明：透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min 4) 4) 封片：中性樹膠。封片：中性樹膠。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹四四 免疫組化結(jié)果分析免疫組化結(jié)果分析免疫組化結(jié)果的

18、判斷原則：免疫組化結(jié)果的判斷原則：1.必須設(shè)對照。必須設(shè)對照。2.抗原表達(dá)必須在特定部位。抗原表達(dá)必須在特定部位。3.陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹實驗分析的相關(guān)介紹實驗分析的相關(guān)介紹陰性對照：陰性對照：免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化染色實驗組與對照組結(jié)果分析表免疫組化染色實驗組與對照組結(jié)果分析表免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹陽性對陽性對照照陰性對陰性對照照替代對替代對照照實驗實驗 組組結(jié)論結(jié)論6受檢組織不含定位受檢組織不含定位Ag7受檢組織含定位受檢組織含定位Ag免疫組化原理及流程介紹免

19、疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹染色失敗的幾種原因：染色失敗的幾種原因：染染色色失失敗敗的的可可能能情情況況免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹(1) (1) 所有切片呈陰性所有切片呈陰性3 3） 4 4） 5 5）免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹 內(nèi)源性過氧化酶沒有完全阻斷內(nèi)源性過氧化酶沒有完全阻斷 切片或涂片過厚切片或涂片過厚 漂洗不夠漂洗不夠 底物呈色反應(yīng)過久底物呈色反應(yīng)過久 使用全血清抗體稀釋不夠使用全血清抗體稀釋不夠免疫組化原理及流程介紹免疫組化

20、原理及流程介紹 1.1.蘇木素復(fù)染時間需要摸索，尤其要考慮蘇木素復(fù)染時間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置。陽性染色的位置。 2.2.切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時要切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時要覆蓋組織充分；每次加覆蓋組織充分；每次加 液前甩干洗滌液，液前甩干洗滌液，但又防止干片但又防止干片 。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹注意事項：注意事項： 3.3.以下原因可能導(dǎo)致片子著色不均勻：以下原因可能導(dǎo)致片子著色不均勻： 脫蠟不充分?？梢悦撓灢怀浞??？梢?60 60 烤烤 20 min20 min，立即放入新鮮，立即放入新鮮的的 二甲苯中；二甲苯中； 水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇； 抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/