分子與基因工程-生物技術(shù)-復(fù)習(xí)題

1、1、簡(jiǎn)述rRNA在肽鏈合成中的作用？功能是作為mRNA的支架，使mRNA分子在其上展開(kāi)，形成肽鏈2、分別說(shuō)出5種以上RNA的功能？mRNA：信使RNA是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可翻譯成多肽鏈。tRNA：轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，是用來(lái)翻譯過(guò)程中運(yùn)輸氨基酸。rRNA:核糖體RNA，構(gòu)建核糖體的成分。hRNA：小發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA，是生成mRNA的前體RNA，也是在DNA干擾中起作用。micRNA:反義RNA,對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。3、基因工程載體的必備條件是什么，列舉三種以上的常用載體。必備條件：a具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性b具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)c具有較高的外源DNA的裝載能力d具有多種單一的核酸內(nèi)切酶

2、識(shí)別切割位點(diǎn)e具有合適的篩選標(biāo)記常用載體：噬菌體，質(zhì)粒，病毒DNA，噬菌粒4、什么是報(bào)告基因，舉例說(shuō)明報(bào)告基因在分子生物學(xué)研究中的二種以上的用途？報(bào)告基因: 是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。 應(yīng)用： -D-葡萄糖苷酶基因，該酶催化底物形成-D-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無(wú)背景，組織化學(xué)檢測(cè)很穩(wěn)定，可用分光光譜、熒光等進(jìn)行檢測(cè)。cat基因作為報(bào)告基因，檢測(cè)時(shí)可通過(guò)放射自顯影觀察。

3、熒光酶基因作為報(bào)告基因，具有檢測(cè)速度快、靈敏度比cat基因高301000倍、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)。5、請(qǐng)列舉三種以上檢測(cè)基因表達(dá)的方法? 抗藥性篩選、營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選、顯色篩選6、以色氨酸操縱元為例說(shuō)明衰減子如何控制基因轉(zhuǎn)錄？在trpmRNA5端trpE基因的起始密碼前有一個(gè)長(zhǎng)162bp的mRNA片段被稱為前導(dǎo)區(qū),研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)mRNA合成起始以后,除非培養(yǎng)基中完全沒(méi)有色氨酸,轉(zhuǎn)錄總是在這個(gè)區(qū)域終止,產(chǎn)生一個(gè)僅有140個(gè)核苷酸的RNA分子,終止trp基因轉(zhuǎn)錄.因?yàn)檗D(zhuǎn)錄終止發(fā)生在這一區(qū)域,并且這種終止是被調(diào)節(jié)的,這個(gè)區(qū)域就被稱為弱化子.Trp操縱子轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控是通過(guò)弱化作用實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)

4、培養(yǎng)基中色氨酸的濃度很低時(shí),負(fù)載有色氨酸的tRNATrp也就少,這樣翻譯通過(guò)兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度就會(huì)很慢,當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí),核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或停留在兩個(gè)相鄰的trp密碼子處）,這時(shí)的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3配對(duì),不形成3-4配對(duì)的終止結(jié)構(gòu),所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行,直到將trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄7、Southern blotting 和Northern blotting 的實(shí)驗(yàn)原理、目的及主要實(shí)驗(yàn)步驟。S：目的：是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。原理：根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然

5、后通過(guò)同標(biāo)記的單練DNA或RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。步驟：待測(cè)核酸樣品的制備待測(cè)DNA樣品的電泳分離凝膠中核酸的（堿）變性southern印跡southern雜交雜交結(jié)果檢測(cè)N：目的：主要用于分析檢測(cè)特異性RNA。原理：Northern雜交是利用DNA可以與RNA進(jìn)行分子雜交來(lái)檢測(cè)特異性RNA的技術(shù)，首先將RNA混合物按它們的大小和分子量通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，分離出來(lái)的RNA轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再與放射性標(biāo)記的探針雜交，通過(guò)雜交結(jié)果可以對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定性或定量。步驟：RNA混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離得到的RNA轉(zhuǎn)膜與放射性標(biāo)記的探針雜交 結(jié)果分析。8、 “生

6、物進(jìn)化過(guò)程中，最早出現(xiàn)的生物大分子是RNA，而不是DNA和蛋白質(zhì)，即在進(jìn)化某個(gè)階段有一個(gè)RNA世界”這一觀點(diǎn)已被普遍接受，談?wù)剬?duì)這一觀點(diǎn)的認(rèn)識(shí)。最早出現(xiàn)的簡(jiǎn)單生命體中的生物大分子，應(yīng)是既具有信息載體功能又具有酶的催化功能，因此，最早的生物大分子。進(jìn)化之初是RNA的世界，RNA可以一身二任，既能保存信息，又能提供酶活性，因此僅有RNA也足以把早期的進(jìn)化引向新的階段。9、為實(shí)現(xiàn)外源基因在原核生物中高效表達(dá)，應(yīng)考慮哪些因素？啟動(dòng)子（啟動(dòng)子要有可控性，用啟動(dòng)能力強(qiáng)的啟動(dòng)子）終止子（用終止作用強(qiáng)的終止子）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（用含有與啟動(dòng)子來(lái)源相同的核糖體序列結(jié)合位點(diǎn)）密碼子（解決密碼子的偏愛(ài)性）質(zhì)?？截悢?shù)（

7、重組質(zhì)粒的擴(kuò)增要可控）10. 描述DNA滾環(huán)復(fù)制過(guò)程及其特征。環(huán)狀DNA可以采取上述典型的DNA復(fù)制方式進(jìn)行復(fù)制，即從復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始，雙向同時(shí)進(jìn)行，形成樣中間物，故又稱型復(fù)制，最后兩個(gè)復(fù)制方向相遇而終止復(fù)制。但有些環(huán)狀DNA采用另個(gè)一種方式，即滾環(huán)復(fù)制。例如許多病毒DNA的復(fù)制、F因子在接合(conufgation)轉(zhuǎn)移時(shí)其DNA的復(fù)制，以及許多基因擴(kuò)增時(shí)都采用這種方式。在以這種機(jī)制進(jìn)行的復(fù)制中，親代雙鏈DNA的一條鏈在DNA復(fù)制起點(diǎn)處被切開(kāi)，其5端游離出來(lái)。這樣，DNA聚合酶便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在3-OH端。當(dāng)復(fù)制向前進(jìn)行時(shí)，親代DNA上被切斷的5端繼續(xù)游離下來(lái)，并且很快被單鏈結(jié)合蛋白所

8、結(jié)合。因?yàn)?端從環(huán)上向下解鏈的同時(shí)伴有環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)繞其軸不斷的旋轉(zhuǎn)，而且以3-OH端為引物的DNA生長(zhǎng)鏈則不斷地以另一條環(huán)狀DNA鏈為模板向前延伸，因而稱為滾環(huán)復(fù)制。由于只有一條DNA鏈?zhǔn)峭暾?，因而在DNA解鏈時(shí)不會(huì)產(chǎn)生拓?fù)鋵W(xué)上的問(wèn)題，即未解鏈的雙螺旋區(qū)不會(huì)產(chǎn)生超螺旋。當(dāng)5-端從環(huán)上解下來(lái)后不久，即與單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，以后可移動(dòng)的引發(fā)體便在其上形成，以引發(fā)RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶催化合成岡崎片段。這個(gè)過(guò)程與前述的DNA滯后鏈的合成一樣。最后由DNA聚合酶切除RNA引物，并填充間隙構(gòu)成完整的DNA鏈。5端所以能從環(huán)上不斷解鏈，主要是由于DNA聚合酶及引發(fā)體構(gòu)成的復(fù)制體中的螺旋酶

9、不停的向前移動(dòng)所致。在這種復(fù)制方式中，DNA的延伸可以一直進(jìn)行下去，產(chǎn)生的DNA鏈可以是親代DNA單位長(zhǎng)度的許多倍。這么長(zhǎng)的DNA鏈?zhǔn)侨绾无D(zhuǎn)變?yōu)閱挝婚L(zhǎng)度的DNA分子的，目前尚不清楚?？赡苁怯商禺惖膬?nèi)切酶切開(kāi)產(chǎn)生單位長(zhǎng)度的子代DNA。這些DNA可自身環(huán)繞，或保持線性分子狀態(tài)特點(diǎn)(1)以親本鏈（+鏈）為模板合成互補(bǔ)的環(huán)狀負(fù)鏈，形成閉合環(huán)狀的復(fù)制形RF1；(2)以成環(huán)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生多個(gè)子代RF；(3)以RF的負(fù)鏈為模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生多拷貝正鏈單環(huán)。11一個(gè)基因如何產(chǎn)生兩種不同類型的mRNA分子？ 一個(gè)基因可以有兩種方式產(chǎn)生一種以上的mRNA.第一種是：一個(gè)轉(zhuǎn)錄初級(jí)產(chǎn)物含有一個(gè)以上的多聚腺苷化位點(diǎn)，就

10、能產(chǎn)生一種以上的具有不同3末端mRNA。第二種是：如果一個(gè)初級(jí)產(chǎn)物含有幾個(gè)外顯子，發(fā)生不同的剪接就會(huì)產(chǎn)生多種mRNA.。12在一個(gè)克隆基因的分析中發(fā)現(xiàn)：一個(gè)含有轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游3.8kbDNA的克隆，其mRNA直接轉(zhuǎn)錄活性比僅含有3.1kb上游DNA克隆的轉(zhuǎn)錄活性大50倍。這表明了什么？ 在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游3.83.1kb之間有一個(gè)增強(qiáng)子。13.列舉原核生物同真核生物轉(zhuǎn)錄的差異。真核生物中編碼蛋白質(zhì)的基因通常是間斷的、不連續(xù)的,由于轉(zhuǎn)錄時(shí)內(nèi)含子和外顯子是一起轉(zhuǎn)錄的,因而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA必須經(jīng)過(guò)加工,將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄部分剪切掉,將外顯子轉(zhuǎn)錄部分拼接起來(lái),才能成為有功能的成熟的信使RNA.而原核生物的基因

11、由于不含有外顯子和內(nèi)含子,因此,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA不需要剪切、拼接等加工過(guò)程.原核生物基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯通常是在同一時(shí)間同一地點(diǎn)進(jìn)行的,即在轉(zhuǎn)錄未完成之前翻譯便開(kāi)始進(jìn)行.如大腸桿菌乳糖分解代謝過(guò)程中,三個(gè)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯就是同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的.真核生物由于有細(xì)胞核,核膜將核質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)分隔開(kāi)來(lái),因此,轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核中進(jìn)行的,翻譯則是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的.可見(jiàn),真核生物基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯具有時(shí)間和空間上的分隔.上述真核生物基因轉(zhuǎn)錄后的剪切、拼接和轉(zhuǎn)移等過(guò)程,都需要有調(diào)控序列的調(diào)控,這種調(diào)控作用是原核生物所沒(méi)有的.14簡(jiǎn)述乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能。乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個(gè)結(jié)

12、構(gòu)基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶,此外還有一個(gè)操縱序列O,一個(gè)啟動(dòng)子P和一個(gè)調(diào)節(jié)基因I.阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：沒(méi)有乳糖存在時(shí),I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處,乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài),不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時(shí),乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu),不能結(jié)合于操縱序列,乳糖操縱子被誘導(dǎo)開(kāi)放合成分解乳糖的三種酶.所以,乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控.CAP的正性調(diào)節(jié)：在啟動(dòng)子上游有CAP結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí),cAMP濃度升高,與CAP結(jié)合,使CAP發(fā)生變構(gòu),CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動(dòng)序列附近的CAP結(jié)合位點(diǎn),

13、激活RNA聚合酶活性,促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄,對(duì)乳糖操縱子實(shí)行正調(diào)控,加速合成分解乳糖的三種酶.協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機(jī)制,互相協(xié)調(diào)、互相制約.15. 簡(jiǎn)述遺傳密碼的兼并性和擺動(dòng)假設(shè)。遺傳密碼普遍存在與生物界中，由一種以上的密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為遺傳密碼的兼并性。遺傳密碼的擺動(dòng)性，密碼子與反密碼子配對(duì)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不遵從堿基配對(duì)規(guī)律的情況，稱為遺傳密碼的擺動(dòng)現(xiàn)象。這一現(xiàn)象更常見(jiàn)于密碼子的第三位堿基對(duì)反密碼子的第一位堿基，二者雖不嚴(yán)格互補(bǔ)，也能相互辨認(rèn)。tRNA分子組成的特點(diǎn)是有較多稀有堿基，其中次黃嘌

14、呤(inosine, I)常出現(xiàn)于反密碼子第一位，也是最常見(jiàn)的擺動(dòng)現(xiàn)象。16. 何謂真核生物斷裂基因？說(shuō)明其結(jié)構(gòu)并論述其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的過(guò)程及調(diào)控。真核生物的斷裂基因由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開(kāi)但又連續(xù)鑲嵌而成。能編碼蛋白質(zhì)的基因稱為外顯子，不能編碼蛋白質(zhì)的基因稱為內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄表達(dá)的過(guò)程：第一步合成原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)、延伸和終止）；第二步轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工，使無(wú)生物活性的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成有生物功能的成熟RNA。第三布核糖體結(jié)合到mRNA上，由tRNA攜帶氨基酸合成多肽鏈調(diào)控：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：順式作用元件與反式作用因子相結(jié)合進(jìn)行調(diào)控轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：5端加帽子，3端加PolyA尾。mRNA

15、的選擇剪接。RNA干擾現(xiàn)象翻譯水平調(diào)控：5端帽子結(jié)構(gòu)的甲基化，翻譯起始因子的調(diào)控17. 試述DNA克隆的基本流程，并列舉兩種陽(yáng)性克隆篩選的方法。過(guò)程：一個(gè)完整的DNA克隆過(guò)程應(yīng)包括：目的基因的獲取，基因載體的選擇與構(gòu)建，目的基因與載體的拼接，重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選并無(wú)性繁殖含重組分子的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）。篩選方法：1藍(lán)白斑篩選野生型大腸桿菌（E.Coli）產(chǎn)生的-半乳糖苷酶可以將無(wú)色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。重組后的大腸桿菌不能產(chǎn)生-半乳糖苷酶，因此不會(huì)產(chǎn)生5-溴-4-靛藍(lán)，菌落成白色。2抗藥

16、性篩選:將抗藥性基因與目的基因一同接入到載體中，然后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的藥性物質(zhì)，能生長(zhǎng)的菌株就是含有目的基因的菌落，不含目的基因的菌株不能生長(zhǎng)。18. 簡(jiǎn)述位點(diǎn)特異性重組的機(jī)理位點(diǎn)特異性重組（site-specific recombination）是遺傳重組的一類。這類重組依賴于小范圍同源序列的聯(lián)會(huì)，重組也只發(fā)生在同源的短序列的范圍之內(nèi)，需要位點(diǎn)特異性的蛋白質(zhì)分子參與催化，重組的蛋白不是rec 系統(tǒng)而是int 等，如噬菌體l 的定點(diǎn)插入。重組時(shí)發(fā)生精確的切割、連接反應(yīng)，DNA不失去、不合成。兩個(gè)DNA分子并不進(jìn)行對(duì)等的交換，有時(shí)是一個(gè)DNA分子整合到另一個(gè)DNA分子上（插入重組

17、）。19. 簡(jiǎn)述乳糖操縱子中各種結(jié)構(gòu)元件及其所起的作用。調(diào)節(jié)基因，產(chǎn)生阻遏蛋白啟動(dòng)子，使RNA聚合酶結(jié)合到DNA鏈上并且完成起始反應(yīng)操縱基因，控制一個(gè)鄰近基因或基因群的表達(dá)結(jié)構(gòu)基因y，z，a。分別編碼產(chǎn)生-半乳糖苷酶，半乳糖苷透過(guò)酶，半乳糖甘轉(zhuǎn)乙酰酶20. 簡(jiǎn)述鳥(niǎo)槍法測(cè)序的基本原理和過(guò)程。原理：將目的DNA隨機(jī)地處理成大小不同的片段，再將這些片段的序列連接起來(lái)。過(guò)程：(1).使用限制性內(nèi)切酶將帶有目的基因的DNA鏈切成若干小段。(2).再使用DNA連接酶將其整合到載體的基因中,并使其表達(dá)。(3).如果在某個(gè)細(xì)胞中得到了目的產(chǎn)物,就說(shuō)明整合到該細(xì)胞中的DNA片段就是所需要的DNA片段。21. 作

18、為載體應(yīng)該具備哪些基本條件？作為運(yùn)載體必須具有三個(gè)條件：在宿主細(xì)胞中能保存下來(lái)并能大量復(fù)制；有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)最好只有一個(gè)，如大腸桿菌pBR322就有多種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，可適于多種限制酶切割的DNA插入；有一定的標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。22. 簡(jiǎn)述哺乳動(dòng)物外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法。磷酸鈣共沉淀法，電擊轉(zhuǎn)化法，脂質(zhì)體介導(dǎo)法，顯微注射法，血影細(xì)胞介導(dǎo)法23. 試論述現(xiàn)階段生產(chǎn)人胰島素的方法答：基因工程法制人的胰島素1 A鏈和B鏈分別表達(dá)法2 A連和B鏈同時(shí)表達(dá)法3 人胰島素原表達(dá)法4 分泌型重組人胰島素表達(dá)法5 以酵母為受體分泌表達(dá)人胰島素，胰島素基因前端可加一個(gè)信號(hào)肽編碼

19、序列，這個(gè)信號(hào)肽引導(dǎo)合成的胰島素分泌到周圍的培養(yǎng)基中，簡(jiǎn)化了純化過(guò)程，最后通過(guò)酶學(xué)反應(yīng)使之變成人胰島素。（P375 基因工程+講義）24. 試述細(xì)菌適應(yīng)于外界營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的分子調(diào)控機(jī)制？答：1 如乳糖操縱子的C的正調(diào)節(jié)，當(dāng)環(huán)境中葡萄糖存在時(shí)，細(xì)菌直接利用葡萄糖，細(xì)菌的水平低，且CAP以二聚體形式存在；當(dāng)環(huán)境中葡萄糖缺乏時(shí)，CAMP升高結(jié)合CAP，其CAPCAMP復(fù)合物乳糖啟動(dòng)子上游，誘導(dǎo)DNA90度彎曲，增強(qiáng)RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子的能力，使轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)倍從而分泌酶加速乳糖分解為葡萄糖，供細(xì)胞進(jìn)行利用。2 如色氨酸操縱子的阻遏系統(tǒng)，若外界色氨酸量充足，則它與游離的輔阻遏蛋白相結(jié)合，并使之與操縱區(qū)的DNA

20、緊密結(jié)合，使色氨酸表達(dá)受阻；若外界的色氨酸供應(yīng)不足時(shí)，則輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區(qū)解離，色氨酸操縱子去阻遏，開(kāi)始表達(dá)色氨酸。（P264）25. 試說(shuō)明基因組DNA產(chǎn)生重復(fù)序列的可能機(jī)制。答：1 復(fù)制滑動(dòng)擴(kuò)增2 滾環(huán)擴(kuò)增3 不等交換 4 堿基置換突變等26. 簡(jiǎn)述原核生物的RNA聚合酶各亞基的功能。答：亞基與RNA聚合酶的四聚體核心(2)的形成有關(guān);亞基含有核苷三磷酸的結(jié)合位點(diǎn);亞基含有與DNA模板的結(jié)合位點(diǎn);而Sigma因子只與RNA轉(zhuǎn)錄的起始有關(guān)，與鏈的延伸沒(méi)有關(guān)系，一旦轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，因子就被釋放，而鏈的延伸則由四聚體核心酶(core enzyme)催化。27. 簡(jiǎn)述色氨酸衰減子結(jié)構(gòu)及其調(diào)控方

21、式。答：阻遏作用trp操縱子轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是通過(guò)阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)的。產(chǎn)生阻遏蛋白結(jié)合于trp操縱基因特異序列，阻止轉(zhuǎn)錄起始，但阻遏蛋白的DNA結(jié)合活性受trp調(diào)控，再有高濃度trp存在時(shí)，阻遏蛋白色氨酸復(fù)合物與色氨酸操縱子緊密結(jié)合，可以阻止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)trp水平低時(shí)，阻遏蛋白以一種非活性形式存在，不能結(jié)合DNA。在這樣的條件下，trp操縱子被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。trp生物合成途徑被激活。弱化作用：trp操縱子轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控是通過(guò)弱化作用實(shí)現(xiàn)的，大腸桿菌trp操縱子前導(dǎo)區(qū)的堿基序列包括4個(gè)片段，能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對(duì)，當(dāng)trp濃度很低時(shí)，翻譯通過(guò)兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度很慢，這時(shí)的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2

22、-3配對(duì)，不行成3-4配對(duì)的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行。當(dāng)trp濃度很高時(shí)，核糖體可順利通過(guò)兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子再4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體就到達(dá)2區(qū)，這樣使2-3不能配對(duì)，3-4區(qū)可以配對(duì)，行成終止結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止28. 簡(jiǎn)述影響翻譯水平高低的因素有哪些？答：1、SD序列（核糖體結(jié)合位點(diǎn)）被封閉2、小RNA作用于目標(biāo)mRNA,使其降解或不能翻譯3、缺少某種氨基酸時(shí),tRNA空載4、密碼子偏愛(ài)性29. 簡(jiǎn)述原核生物反式作用因子的結(jié)構(gòu)域特征。第六章ppt反式作用因子含有兩種不同的結(jié)構(gòu)域a.dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域1螺旋-反轉(zhuǎn)-螺旋2鋅指3基域（通常以二聚體結(jié)合于dna上0、）b.轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（功能域）1

23、酸性激活域2谷酰胺豐富域3脯氨酸豐富域阻遏域：專一性的直接阻遏的結(jié)構(gòu)域30. 簡(jiǎn)述型限制性內(nèi)切酶的命名方式及特征。ppt11章屬名+種名+株名型限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)是： 一般能識(shí)別和切割 48 個(gè)堿基對(duì)的核苷酸序列； 大多數(shù)識(shí)別序列具有回文結(jié)構(gòu)； 沒(méi)有甲基化修飾酶功能。型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式有三種： 切割產(chǎn)生 5 突出的粘性末端； 切割產(chǎn)生 3 突出的粘性末端； 切割產(chǎn)生平頭末端31.試述利用原核表達(dá)載體進(jìn)行外源基因表達(dá)的基本思路及方法步驟。(百度百科)獲得目的基因，（1）通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），P

24、CR循環(huán)獲得所需基因片段。（2）通過(guò)RT-PCR方法：提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。構(gòu)建重組表達(dá)載體（1）載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。（2）PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種（1） 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。（2）測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩

25、選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。（3） 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。32. 試述真核生物基因表達(dá)調(diào)控的多層次性。ppt第七章染色體水平的調(diào)控 組蛋白對(duì)基因活性的影響，組蛋白的乙?；?去乙?；?，非組蛋白的調(diào)節(jié)，核基質(zhì)的調(diào)控作用，基因丟失，基因擴(kuò)增，基因重排dna水平 dna甲基化轉(zhuǎn)錄水平 rna聚合酶的活性，順式作用元件，反式作用因子轉(zhuǎn)錄后水平 5短加帽和polyA尾的調(diào)控意義，mrna的選擇剪接，mrna運(yùn)輸?shù)目刂?，rna干涉翻譯水平 5端UTR結(jié)構(gòu)與翻譯起始的調(diào)節(jié)，5帽子結(jié)構(gòu)的甲基化，翻譯起始因子的調(diào)控蛋白質(zhì)加工和降解水平 新生肽鏈的水解，肽鏈中氨基酸的共價(jià)修

26、飾，通過(guò)信號(hào)肽分揀、運(yùn)輸、定位33.說(shuō)明啟動(dòng)子突變會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生變化的可能情況？啟動(dòng)子突變可能會(huì)提高、降低或不影響基因的表達(dá)量。1啟動(dòng)子突變提高基因的表達(dá)量。例子就是TERT promoter突變與人類癌癥的關(guān)系。TERT啟動(dòng)子的突變?cè)诙喾N癌癥中都廣泛存在，超過(guò)一半的膀胱癌患者都攜帶這種突變。在對(duì)黑色素瘤的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子的突變可以使TERT基因的轉(zhuǎn)錄水平提高2-4倍。2啟動(dòng)子突變降低基因的表達(dá)量。例子就是在一項(xiàng)對(duì)HD（亨廷頓氏病 Huntingtons Disease）基因的啟動(dòng)子研究中,當(dāng)把HD基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游126到141這一段DNA刪除后，HD基因的表達(dá)量顯著下降。

27、3.啟動(dòng)子突變不影響基因的表達(dá)量。啟動(dòng)子里的突變是很多的，而且不同個(gè)體間的差異是很大的，從沒(méi)有突變到3000+突變都有。但是大部分個(gè)體間的基因表達(dá)譜差異卻不是很大，所以應(yīng)該說(shuō)大部分啟動(dòng)子內(nèi)部的突變對(duì)基因表達(dá)的影響是微乎其微的。34.簡(jiǎn)述基因工程的應(yīng)用。1生物反應(yīng)器 通過(guò)基因工程可以大量生產(chǎn)所需要的生活活性物質(zhì)，這個(gè)反應(yīng)器的工廠可以是微生物，可以是動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，也可以是轉(zhuǎn)基因植物。2、遺傳改良 植物方面可以培育出抗蟲(chóng)、抗病、增進(jìn)品質(zhì)的作物新品種；動(dòng)物方面可以提高其生長(zhǎng)、生殖或抗逆性等性能；微生物方面可以獲得增強(qiáng)性能的生物殺蟲(chóng)劑、抗病劑、新型抗生素、土壤改良劑和環(huán)境凈化劑等。3、基因治療

28、將健康基因移植到相關(guān)組織或細(xì)胞可使遺傳患者的癥狀減緩甚至消失。35.簡(jiǎn)述DNA損傷后的修復(fù)類型有哪些？1、錯(cuò)配修復(fù) 一旦在DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)配，細(xì)胞能通過(guò)準(zhǔn)確的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別新合成鏈中的錯(cuò)配并加以校正，DNA分子鏈中的錯(cuò)配幾乎完全能被修復(fù)。2、切除修復(fù) 切除修復(fù)分為堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)兩類，切除修復(fù)功能廣泛存在于原核生物和真核生物中，也是人類的主要修復(fù)方式,嚙齒動(dòng)物 (如倉(cāng)鼠、小鼠)先天缺乏切除修復(fù)的功能。3、重組修復(fù) 機(jī)體細(xì)胞對(duì)在復(fù)制起始時(shí)尚未修復(fù)的DNA損傷部位可以先復(fù)制在修復(fù)，即先跳過(guò)該損傷部位，在新合成的鏈中留下一個(gè)對(duì)應(yīng)于損傷序列的缺口，該缺口由DNA重組來(lái)修復(fù)：先從同源

29、DNA母鏈上將相應(yīng)核苷酸序列片段移至鏈缺口處，然后再用新合成的序列補(bǔ)上母鏈空缺。4、DNA的直接修復(fù) 是把損傷的堿基回復(fù)到原來(lái)狀態(tài)的一種修復(fù)，不需要切除堿基或核苷酸。5、SOS反應(yīng) 細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，細(xì)胞為求生存而產(chǎn)生的一種應(yīng)急措施。SOS反應(yīng)包括誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制及溶原性細(xì)菌釋放噬菌體等，細(xì)胞癌變也與SOS反應(yīng)有關(guān)。36.闡述藍(lán)白斑篩選的原理及其應(yīng)用?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框

30、，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)-互補(bǔ)能力的氨基酸端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。應(yīng)用于基因工程中重組子的篩選。37.列舉基因工程中常用的工具酶有哪些？ 限制性核酸內(nèi)

31、切酶：識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵細(xì)菌的限制與修飾作用；DNA連接酶：修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵；修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵；連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子；DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶38. 簡(jiǎn)述用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的方法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法：利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列，這對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。（磷酸鈣共沉淀法；電擊轉(zhuǎn)化法；脂質(zhì)體介導(dǎo)法；顯微注射法；血影細(xì)胞介導(dǎo)法）哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法:以病毒DNA為載體可以

32、將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。39. 論述原核生物基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。 遺傳信息有序地傳遞到蛋白質(zhì)或功能RNA分子的過(guò)程就稱為基因表達(dá)。對(duì)該過(guò)程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控。操縱子調(diào)控：（1）乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶，透酶，半乳糖甘轉(zhuǎn)乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱子0、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因I，在P序列上游還有一個(gè)-CAP結(jié)合位點(diǎn)，由P序列，0序列，CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)編碼基因由同一個(gè)調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)。乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制可分為三個(gè)方面：(a)阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，阻遏蛋白與0序列結(jié)合，阻遏RNA聚合

33、酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，異乳糖作為一種誘導(dǎo)劑結(jié)合阻遏蛋白，改變了它的構(gòu)象，使它序列解離，RNA聚合酶與P序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始。（b）CAP的正性調(diào)節(jié)：分解代謝物基因激活蛋白CRP分子內(nèi)有DNA結(jié)合區(qū)及CAP結(jié)合位點(diǎn)。沒(méi)有葡萄糖時(shí)，cAMP濃度較高，結(jié)合cAMP的CRP結(jié)合在乳糖啟動(dòng)序列附近的CA位點(diǎn)結(jié)合，激活RNA轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，cAMP濃度降低，cAMP與CA結(jié)合受阻，因此乳糖操縱子表達(dá)下降。（c）協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)控調(diào)控與CRP的正調(diào)控兩種機(jī)制，相互協(xié)調(diào)，相互制約。色氨酸操縱子：（a）阻遏作用trp操縱子轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是通過(guò)阻遏蛋

34、白實(shí)現(xiàn)的。產(chǎn)生阻遏蛋白結(jié)合于trp操縱基因特異序列，組織轉(zhuǎn)錄起始。但阻遏蛋白的DNA結(jié)合活性受Trp調(diào)控，在有高濃度Trp存在時(shí)，阻遏蛋白-色氨酸復(fù)合物與色氨酸操縱子緊密結(jié)合，可以阻止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Trp水平低時(shí)，阻遏蛋白以一種非活性形式存在，不能結(jié)合DNA。在這樣條件下，trp操縱子被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，Trp生物合成途徑被激活。（b）弱化作用trp操縱子轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控是通過(guò)弱化作用實(shí)現(xiàn)的。大腸桿菌trp操縱子前導(dǎo)區(qū)的堿基序列包括4個(gè)片段，能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對(duì)，當(dāng)Trp濃度很低時(shí)，翻譯通過(guò)兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度很慢，這時(shí)的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3配對(duì)，不形成3-4配對(duì)的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼

35、續(xù)進(jìn)行。當(dāng)Trp濃度很高時(shí)，核糖體可順利通過(guò)兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體久到達(dá)2區(qū)，這樣使2-3不能配對(duì)，3-4區(qū)可以配對(duì)形成終止結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄終止。40. 論述PCR反應(yīng)的原理、過(guò)程及應(yīng)用。PCR為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其基本原理就是在高溫下使雙鏈DNA變性，然后經(jīng)低溫退火使引物變性后的DNA單鏈結(jié)合，經(jīng)中溫延伸，形成位于兩引物之間的目的DNA，經(jīng)過(guò)若干次循環(huán)可產(chǎn)生許多倍的目的DNA片段。過(guò)程：1.94 預(yù)變性，3min2.94變性 30s退火 55 30s72延伸 60s3.72延伸 10min4 .保溫 10應(yīng)用 ： 1.目的基因的克隆2. 基因的體外突變3 .DNA和RNA的

36、微量分析4. DNA的序列測(cè)定5. 基因突變分析41. 轉(zhuǎn)錄涉及模板鏈和編碼鏈的分離，解釋在轉(zhuǎn)錄中單鏈DNA是怎樣被保護(hù)的。 SSB單鏈結(jié)合蛋白，其功能在于被解鏈酶解開(kāi)的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，以四聚體的形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制完成后才離開(kāi)，重新進(jìn)入循環(huán)被解鏈酶分離的兩條單鏈迅速與單鏈結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合，以保持單鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，避免雙鏈結(jié)構(gòu)重新形成，同時(shí)保持單鏈的完整性防止單鏈DNA被細(xì)胞內(nèi)的極酸酶水解。42. 簡(jiǎn)述真核、原核生物基因組的差異。1原核生物基因組很小，一般只有一條染色體，真核生物基因組龐大2原核生物DNA分子的絕大部分一般是用來(lái)編碼蛋白質(zhì)的，只有非常小的一部分不能

37、轉(zhuǎn)錄，這與真核DNA的冗余現(xiàn)象不同 3原核生物DNA序列中功能相關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)基因，往往以集中在在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位，形成功能單位或轉(zhuǎn)錄單位，它們可被一起轉(zhuǎn)錄為含有多個(gè)mRNA的分子，叫多順?lè)醋印６婧松镏袥](méi)有這種結(jié)構(gòu)只有單順?lè)醋印?原核生物基因組中含有重疊基因，真核生物基因組中含有大量重疊基因5真核生物基因組不連續(xù)，又內(nèi)含子，外顯子，二原核生物沒(méi)有。43. 為什么需要RNA引物來(lái)引發(fā)DNA的復(fù)制DNA的復(fù)制需要RNA引物，這是由DNA聚合酶和RNA聚合酶的特性決定的。DNA聚合酶不能從頭合成DNA，既不能催化2個(gè)游離核苷酸之間的磷酸二之鍵的形成，而只能通過(guò)3-oH末端添加新的

38、核苷酸來(lái)延長(zhǎng)已存在的多核苷酸鏈，而引物酶，從頭合成新鏈的能力，能在單鏈模板上合成與之互補(bǔ)的RNA引物（510個(gè)核苷酸再由DNA聚合酶從引物的3-OH末端形成DNA鏈的合成）44、簡(jiǎn)述遺傳密碼的特點(diǎn)。1、密碼子的連續(xù)性。翻譯始于RNA的5端起始密碼子，一個(gè)密碼子接一個(gè)密碼子連續(xù)閱讀直到3端終止密碼子，密碼子間無(wú)間斷也無(wú)交叉，即起始密碼子決定了所有后續(xù)密碼子的位置2、密碼子的兼并性。遺傳密碼子最突出的特征之一是64種密碼子中的61種分別編碼20種氨基酸，這意味著很多氨基酸是由超過(guò)1種以上的密碼子編碼的，這種現(xiàn)象被稱為密碼子的兼并性。3、密碼子的通用性。密碼子的通用性指蛋白質(zhì)合成的整套密碼，從原核生

39、物到人類都通用。4、密碼子的擺動(dòng)性。TRNA的反密碼需要通過(guò)堿基互補(bǔ)與RNA上的遺傳密碼反向配對(duì)結(jié)合，擺動(dòng)性指出反密碼子與密碼子之間不嚴(yán)格遵守常見(jiàn)的堿基配對(duì)現(xiàn)象。45、真核生物基因表達(dá)調(diào)控有哪些方面?按性質(zhì)可分為1第一類，瞬時(shí)調(diào)控或可逆調(diào)控，是細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化（如底物濃度，激素濃度）的應(yīng)答2第二類，發(fā)育調(diào)控或不可逆調(diào)控，細(xì)胞的分裂，生長(zhǎng)，分化，發(fā)育，形態(tài)構(gòu)成。按時(shí)間可分為染色體水平，DNA水平，轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄后水平，翻譯水平，翻譯后水平（1）染色體水平：組蛋白的乙?；?去乙?；?、非組蛋白的調(diào)節(jié)、核基質(zhì)的調(diào)控作用、基因的丟失（不可逆）、基因擴(kuò)增（增加基因的拷貝數(shù)）、基因重排。（2）DNA水平：DN

40、A甲基化（甲基化程度高，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控能力越強(qiáng)）、去甲基化（基因轉(zhuǎn)錄激活）（3）轉(zhuǎn)錄水平：RNA聚合酶（啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)序列和調(diào)節(jié)蛋白通過(guò)DNA-蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性。）、特異DNA序列（順式作用元件：?jiǎn)?dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、絕緣子）、調(diào)節(jié)蛋白（反式作用因子：基本轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、共調(diào)節(jié)因子）（4）轉(zhuǎn)錄后水平：5端加帽和3端多聚腺苷酸化的調(diào)控、mRNA的選擇剪接、mRNA運(yùn)輸?shù)目刂?、RNAi現(xiàn)象。（5）翻譯水平：5端UTR（非翻譯區(qū)）結(jié)構(gòu)與翻譯起始的調(diào)節(jié)、翻譯起始因子的調(diào)控。（6）翻譯后水平：新生肽鏈的水解（酶解）、肽鏈中氨基酸的共價(jià)修飾（磷酸化、

41、甲基化、?；?、通過(guò)信號(hào)肽分揀，運(yùn)輸，定位。46.有哪些檢測(cè)基因表達(dá)的方法? 可直接檢測(cè)目的蛋白 western blot 綠色熒光蛋白可間接檢測(cè)目的mRNA是否存在，northern blot RT-PCR轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) RT-PCR real-time PCR, northern blot直接檢測(cè) 報(bào)告基因 融合熒光蛋白47.述為實(shí)現(xiàn)外源基因在原核生物中高效表達(dá)應(yīng)考慮的因素。（1）外源基因的拷貝數(shù) 外源基因的表達(dá)效率：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)弱 核糖體接合位點(diǎn)的有效性 SD序列和起始密碼ATG的間距 密碼子組成 表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 細(xì)胞代謝負(fù)荷 工程菌的培養(yǎng)條件48.簡(jiǎn)述真核細(xì)胞中翻譯終止的過(guò)程。(P14

42、3)真核生物字只需要一個(gè)終止因子eRF需要GTP,它識(shí)別所有的終止密碼。終止密碼UAG UAA UGA可引起蛋白質(zhì)合成終止。在終止因子的參與下，核糖體上的轉(zhuǎn)肽酶將合成完畢的肽鏈水解釋出肽鏈延伸過(guò)程中當(dāng)終止密碼子UAA UGA UAG出現(xiàn)在核糖體的A位時(shí)，沒(méi)有相應(yīng)的AA-tRNA能與之結(jié)合，而釋放因子能識(shí)別這些密碼子并與之結(jié)合水解P位上多肽鏈與tRNA之間的二酯鍵。接著新生的肽鏈和tRNA從核糖體釋放，核糖體大小亞基解開(kāi)，蛋白質(zhì)合成結(jié)束翻譯終止。49.簡(jiǎn)述大腸桿菌乳糖操縱子的主要結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控機(jī)制(P255-P256)乳糖操控子是大腸桿菌中控制半乳糖苷酶誘導(dǎo)合成的操縱子。包括調(diào)控元件P(啟動(dòng)子)

43、和O(操縱基因)，以及結(jié)構(gòu)基因lacZ(編碼半乳糖苷酶)、lacY(編碼通透酶)和lacA(編碼硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；?。1、無(wú)乳糖時(shí)，調(diào)節(jié)基因lacI 編碼阻遏蛋白，與操縱基因O 結(jié)合后抑制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄,不產(chǎn)生代謝乳糖的酶。2、只有乳糖存在時(shí),乳糖可與lac阻遏蛋白結(jié)合，而使阻遏蛋白不與操縱基因結(jié)合，誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，代謝乳糖的酶產(chǎn)生以代謝乳糖。3、葡萄糖和乳糖同時(shí)存在時(shí)，葡萄糖的降解產(chǎn)物能降低cAMP含量，影響CAP與啟動(dòng)基因結(jié)合，抑制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，抑制代謝乳糖的酶產(chǎn)生。補(bǔ)充：CAP：降解物基因活性蛋白，又稱cAMP受體蛋白，這個(gè)蛋白先與cAMP結(jié)合，再與啟動(dòng)基因結(jié)合。它與啟動(dòng)基因結(jié)合時(shí)能

44、促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)基因結(jié)合，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄50.試述cDNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程及應(yīng)用。過(guò)程：1 cDNA克?。哼x用目的基因含量豐富的組織細(xì)胞，提取總RNA根據(jù)3末端polyA尾長(zhǎng)度不一，用親和層析法獲取較純的mRNA2、第一股cDNA合成：以分離純化的mRNA為模板，以O(shè)ligo(dT) 為引物在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，沿模板的35方向合成。對(duì)于較長(zhǎng)的mRNA分子很難得到全長(zhǎng)cDNA，也可用隨機(jī)引物法，以68個(gè)核苷酸為隨機(jī)引物，從mRNA的不同結(jié)合點(diǎn)合成全長(zhǎng)cDNA第一鏈（RNA-DNA）3、第二股cDNA的合成：自身引導(dǎo)法置換合成法外加引物合成法4、cDNA與載體連接和導(dǎo)入宿主細(xì)胞：cDNA加頭

45、或銜接尾，使產(chǎn)生的黏性末端與載體相應(yīng)的黏性末端互補(bǔ)，形成重組DNA。應(yīng)用：1.以成熟mRNA 為模板合成的cDNA無(wú)內(nèi)含子，大大減小其長(zhǎng)度，便于操作2.真核生物細(xì)胞表達(dá)mRNA 的量比人類基因組少很多，因此減少了篩選目的基因的工作量3.某一特定功能基因在mRNA 中拷貝量大于基因組，利于獲得較多模板。4.可從全長(zhǎng)cDNA序列中直接找到編碼區(qū)，推測(cè)氨基酸順序，分析性質(zhì)和功能。5.基因克隆后可在原核細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的蛋白51.原核生物基因組的特點(diǎn)（P33）（1）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練（2）存在轉(zhuǎn)錄單元（3）有重疊基因52. 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與反轉(zhuǎn)錄病毒區(qū)別。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是指通過(guò)RNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座的遺傳元件。反轉(zhuǎn)錄病

46、毒是由一列反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子構(gòu)成含RNA基因組的侵染顆粒。53.原核生物轉(zhuǎn)錄與真核生物轉(zhuǎn)錄區(qū)別比較點(diǎn)原核生物真核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯幾乎同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄在胞核，翻譯在胞漿RNA聚合酶一種RNA聚合酶1，2，3起始點(diǎn)識(shí)別-35區(qū)，-10區(qū)TATA盒等順勢(shì)作用元件轉(zhuǎn)錄終止依賴或不依賴于p因子AATAAAA修飾點(diǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多順?lè)醋訂雾樂(lè)醋愚D(zhuǎn)錄后修飾無(wú)或很少?gòu)?fù)雜54. 簡(jiǎn)述增強(qiáng)子特點(diǎn)。P89A.遠(yuǎn)距離效用 一般位于上游-200bp處，但可增強(qiáng)遠(yuǎn)處啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，即使相距十多個(gè)千堿基對(duì)也能發(fā)揮作用。B.無(wú)方向性 無(wú)論位于靶基因的上游，下游或內(nèi)部都可發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。C.順勢(shì)調(diào)節(jié) 只調(diào)節(jié)位于同一染色體上的靶基因，而對(duì)其他染

47、色體上的基因沒(méi)有作用。D.無(wú)物種和基因的特異性 可以連接到異元蛋白基因上發(fā)揮作用。E.具有組織特異性 SV40增強(qiáng)子在3T3細(xì)胞中比多瘤病毒的增強(qiáng)子要弱，但在HeLa細(xì)胞中SV40的增強(qiáng)子比多瘤病毒的要強(qiáng)5倍。增強(qiáng)子的效應(yīng)需特定的蛋白質(zhì)因子參與。F有相位性 其作用與DNA的構(gòu)想有關(guān)。G有的增強(qiáng)子可以對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng) 如如熱休克基因在高溫下才表達(dá)，金屬硫蛋白基因在鎘和鋅的存在下才表達(dá)。某些增強(qiáng)子可以被固醇類激素所激活。55. 簡(jiǎn)述DNA復(fù)制的幾種類型及各自特征。P47.48共性：DNA雙鏈的復(fù)制大都半保留方式，絕大多數(shù)復(fù)制是以復(fù)制叉的形式進(jìn)行的。A.線性DNA雙鏈的復(fù)制DNA復(fù)制需RNA引物提

48、供3-OH才能起始。從一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始進(jìn)行雙向（少數(shù)為單向，如腺病毒）復(fù)制產(chǎn)生復(fù)制叉，每個(gè)復(fù)制起始完成的復(fù)制片段稱為復(fù)制子。線性DNA復(fù)制子末端的復(fù)制需特殊機(jī)制：a將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變成環(huán)狀或多聚分子b在DNA末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使該分子沒(méi)有游離的末端。B.環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制a.型 在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種DNA復(fù)制機(jī)制。復(fù)制是在環(huán)形DNA分子某一點(diǎn)(復(fù)制起始點(diǎn))上開(kāi)始的。當(dāng)復(fù)制圍繞著染色體的兩個(gè)方向進(jìn)行時(shí)，所形成的復(fù)制泡狀物延續(xù)生長(zhǎng)。這種復(fù)制是把一個(gè)環(huán)形染色體轉(zhuǎn)化成兩個(gè)子代染色體的方法。b.滾環(huán)形 噬菌體中常見(jiàn)。以親本鏈(+鏈)為模板合成互補(bǔ)的環(huán)狀負(fù)鏈，形成閉合環(huán)狀的復(fù)制形RF1;以成環(huán)滾環(huán)復(fù)制

49、產(chǎn)生多個(gè)子代RF;以RF的負(fù)鏈為模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生多拷貝正鏈單環(huán)。c.環(huán)（D-loop）型 單向復(fù)制的特殊方式。雙螺旋的兩條鏈并不同時(shí)進(jìn)行復(fù)制，重鏈先開(kāi)始復(fù)制，稍后輕鏈再開(kāi)始復(fù)制，當(dāng)復(fù)制沿輕鏈開(kāi)始時(shí)，重鏈上產(chǎn)生了D環(huán)，隨環(huán)形輕鏈復(fù)制的進(jìn)行，D環(huán)增大，輕鏈后亦開(kāi)始復(fù)制，最后兩條鏈完成復(fù)制形成兩條新的DNA雙螺旋。56. 葡萄糖是如何影響涉及糖代謝的操縱子（葡萄糖敏感型操縱子）的表達(dá)？在缺乏葡萄糖時(shí)，cAMP的水平升高，CAP蛋白同每一個(gè)葡萄糖敏感操縱子中啟動(dòng)子內(nèi)的CAP位點(diǎn)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄作用協(xié)同起始。如果有葡萄糖，cAMP的水平下降，CAP蛋白不再結(jié)合，轉(zhuǎn)錄的速率協(xié)同下降。57. 構(gòu)建基因表達(dá)載體

50、常用的組件有哪些？啟動(dòng)子（RNA聚合酶的識(shí)別部位和結(jié)合部位），終止子（終止基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程），以及遺傳標(biāo)記基因（檢測(cè)受體細(xì)胞中是否含有目的基因）、結(jié)構(gòu)基因（負(fù)責(zé)編碼目標(biāo)蛋白）、復(fù)制原點(diǎn)（保證目的基因在受體細(xì)胞中自我復(fù)制遺傳及表達(dá)）58. 簡(jiǎn)述原核生物中反式作用因子的結(jié)構(gòu)域特征。反式作用因子含有兩種不同的結(jié)構(gòu)域：1.DNA結(jié)合域：a.螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋b.鋅指結(jié)構(gòu)c.亮氨酸拉鏈d.螺旋-突環(huán)-螺旋2.轉(zhuǎn)錄激活域：a、酸性激活域b、谷酰胺豐富域c、脯氨酸豐富域59. 哺乳動(dòng)物中，從母親與父親遺傳而來(lái)的基因是差異表達(dá)的，這種現(xiàn)象的理論基礎(chǔ)是什么？答：在精子或卵子發(fā)生過(guò)程中一些基因被關(guān)閉或者甲基化。IGF-

51、II在卵母細(xì)胞中被甲基化，因此遺傳于母本的等位基因在后代中不表達(dá)。來(lái)源于父本的等位基因沒(méi)有甲基化，客觀存在能夠表達(dá)。其他一些基因只在精母細(xì)胞中被甲基化，對(duì)這種基因而言，來(lái)源于母本的等位基因能表達(dá)。60. 簡(jiǎn)述基因工程中獲取目的基因的方法。答：1、從基因文庫(kù)中獲??；2、PCR擴(kuò)增；3、化學(xué)方法人工合成。1、從基因文庫(kù)中獲取需要構(gòu)建基因文庫(kù)，構(gòu)建的方法有：（1）構(gòu)建基因組文庫(kù)：直接分離法（2）構(gòu)建部分基因文庫(kù)如cDNA文庫(kù)：逆轉(zhuǎn)錄法2、PCR擴(kuò)增是針對(duì)目的基因序列未知的情況，可采用PCR擴(kuò)增。3、人工合成有兩種：（1）逆轉(zhuǎn)錄法；（2）化學(xué)方法人工合成；針對(duì)目的基因序列已知且較小的情況。61. 試述

52、如何將將所獲得的目的基因插入到表達(dá)載體中，并闡述確定獲得陽(yáng)性重組DNA的方法。答：1（1）先用限制性核酸內(nèi)切酶切割載體，將載體環(huán)切開(kāi)，然后再用DNA連接酶把所截取的目的基因連接。（2）直接選擇法:抗藥性標(biāo)記選擇，標(biāo)志補(bǔ)救，分子雜交法。免疫學(xué)方法：化學(xué)分析法，酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析62. 試述人類基因組計(jì)劃的科學(xué)意義。答：1 確定了人類基因組中約25萬(wàn)個(gè)編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，以及研究基因的產(chǎn)物及其功能。2 了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。3 從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”的大小和組成，了解各種不

53、同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控中的影響與作用。4 研究空間結(jié)構(gòu)對(duì)基因調(diào)節(jié)的作用。有些基因的表達(dá)調(diào)控序列與被調(diào)節(jié)基因從直線距離上看，似乎相距甚遠(yuǎn)，但若從整個(gè)染色體的空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最佳的調(diào)節(jié)位置，因此，有必要從三維空間的角度來(lái)研究真核基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。5 發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、重組等有關(guān)的序列。DNA的忠實(shí)復(fù)制保障了遺傳的穩(wěn)定性，正常的重組提供了變異與進(jìn)化的分子基礎(chǔ)。局部DNA的推遲復(fù)制、異常重組等現(xiàn)象則導(dǎo)致疾病或者胚胎不能正常發(fā)育，因此，了解與人類DNA正常復(fù)制和重組有關(guān)的序列及其變化，將對(duì)研究人類基因組的遺傳與進(jìn)化提供重要的結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。6 研究DNA突變、重排和

54、染色體斷裂等，了解疾病的分子機(jī)制，包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)的分子病理學(xué)改變及其進(jìn)程，為這些疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。7 確定人類基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質(zhì)。了解有關(guān)病毒基因組侵染人類基因組后的影響，可指導(dǎo)人類有效地利用病毒載體進(jìn)行基因治療。8 研究染色體和個(gè)體之間的多態(tài)性。這些知識(shí)可被廣泛用于基因診斷、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類學(xué)的研究。此外，這些遺傳信息還有助于研究人類歷史進(jìn)程、人類在地球上的分布與遷移以及人類與其他物種之間的比較。63. 簡(jiǎn)述原核生物DNA復(fù)制的基本過(guò)程。DNA的復(fù)

55、制分為三個(gè)階段，即復(fù)制的起始，延伸和終止。DNA復(fù)制時(shí)需要在特定的位點(diǎn)起始，即復(fù)制的起始位點(diǎn)，在原核生物中，復(fù)制的起始位點(diǎn)通常只有一個(gè)。DNA復(fù)制的起始包括預(yù)引發(fā)和引發(fā)兩個(gè)階段。在預(yù)引發(fā)階段，DNA解旋解鏈，形成復(fù)制叉，引發(fā)體組裝，引發(fā)階段，在引發(fā)酶的催化下以DNA鏈為模板合成一段短的RNA引物。復(fù)制時(shí)DNA鏈的延伸由DNA聚合酶催化，以親代DNA鏈為模板，引發(fā)體移動(dòng)，從53方向聚合子代DNA鏈。當(dāng)子鏈延伸達(dá)到終止位點(diǎn)時(shí)，DNA復(fù)制就終止了，切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，在DNA連接酶的催化下將相鄰的岡崎片段連接起來(lái)形成完整的DNA長(zhǎng)鏈。64. 列出真核生物m RNA與原核生物m RNA的區(qū)別。1

56、真核生物的mRNA前體在細(xì)胞核內(nèi)合成，合成后需經(jīng)加工后才成熟為mRNA，從細(xì)胞核輸入胞漿，起始蛋白質(zhì)合成；原核生物的mRNA常在合成尚未結(jié)束時(shí)已開(kāi)始翻譯。2真核生物mRNA含有m7Gppp形式的“帽子”，有由poly(A)形成的“尾巴”，為單順?lè)醋?，只含一條多肽鏈的遺傳信息，合成蛋白質(zhì)時(shí)只有一個(gè)合成的啟動(dòng)點(diǎn)，一個(gè)合成的終點(diǎn)，而原核生物的mRNA為多順?lè)醋?，含有蛋白質(zhì)合成多個(gè)啟動(dòng)點(diǎn)和終止點(diǎn)，且不帶有類似“帽子”和“尾巴”的結(jié)構(gòu)，3在5端方向啟動(dòng)信號(hào)的上游存在富含嘌呤的SD區(qū)段。真核生物的mRNA則無(wú)此區(qū)段。4真核生物的mRNA代謝較慢，哺乳類動(dòng)物的mRNA的半衰期為46h,而細(xì)菌的mRNA半衰期僅在13min此外，真核生物的mRNA前體常含有插入序列，即內(nèi)含子，需要在加工時(shí)切除。65. 簡(jiǎn)述真核生物DNA水平上的基因表達(dá)調(diào)控DNA水平的調(diào)控是真核生物發(fā)育調(diào)控的一種形式，它包括基因的丟失、擴(kuò)增、重排和易位等形式，通過(guò)這些方式可以消除或變換某些基因并改變他們的活性。通過(guò)形成開(kāi)放型活性染色質(zhì)，DNA容易與RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。兩棲類動(dòng)物卵母細(xì)胞中的燈刷型染色質(zhì)是染色體充分伸展，活躍轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)?；驍U(kuò)增是某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象，是基因活性調(diào)控的一種方式，基因重排是指將一個(gè)基因 從遠(yuǎn)離啟