T-SPOT.TB實驗技術2015

1、上海復星長征醫(yī)學科學有限公司2015.7 結核感染基本知識 T-SPOT.TB 技術原理 T-SPOT.TB 實驗條件 T-SPOT.TB 標準化實驗操作 T-SPOT.TB 結果分析討論 T-SPOT.TB 非血標本采集要求及操作 T-SPOT.TB 實驗常見問題解答目錄3結核病 結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病。結核菌能侵入全身各個器官，但80%發(fā)生在肺部，常稱肺結核。常見肺外結核： 淋巴結核（最常見）、結核性腦膜炎（最嚴重）、結核性腹膜炎、腸結核、腎結核、附睪結核、女性生殖結核（引起不孕不育）、骨關節(jié)結核等。4結核病分枝桿菌細菌學分類1. 結核分枝桿菌復合群（MTC）2. 非結核分

2、枝桿菌（NTM）3. 麻風分枝桿菌（M.leprae）掃描電子顯微鏡下的結核桿菌掃描電子顯微鏡下的結核桿菌結核分枝桿菌復合群（MTC）對人類致病5結核病與結核感染結核病與結核感染接觸活動性結核病患者接觸活動性結核病患者暴露程度不足，結核桿菌被機體免疫力清除暴露程度不足，結核桿菌被機體免疫力清除- 沒有癥狀沒有癥狀, ,結核桿菌仍舊結核桿菌仍舊存在而不能被偵測存在而不能被偵測 - X- X-光光/ CT / CT 掃描顯示正常掃描顯示正常- 沒有抗體應答沒有抗體應答- 診斷困難診斷困難- 傳統(tǒng)的結核感染檢測只有傳統(tǒng)的結核感染檢測只有 TSTTST（PPDPPD）機體被感染機體被感染受機體免疫力抑

3、制受機體免疫力抑制沒有臨床癥狀沒有臨床癥狀終身處于感染狀態(tài)終身處于感染狀態(tài)潛伏感染潛伏感染有臨床癥狀有臨床癥狀具有傳染性具有傳染性- 結核桿菌可以通過涂片、結核桿菌可以通過涂片、培養(yǎng)檢測出培養(yǎng)檢測出- 胸部的胸部的 X- X-光或光或 CT CT 掃掃描顯示異常描顯示異常 - 肺外結核難以診斷肺外結核難以診斷 ( (特別是兒童特別是兒童)活動性結核活動性結核5%5%再次激活再次激活6結核病與結核感染 結核病當結核分枝桿菌增加，并超過機體免疫系統(tǒng)所能控制，就會產生相應的臨床癥狀。 潛伏性結核感染（LTBI）人體攜帶結核分枝桿菌，并能被機體免疫系統(tǒng)控制，這時只存在少量細菌，并且無臨床癥狀。7結核病

4、與結核感染 結核病有診斷的“金標準”細菌學檢測：抗酸桿菌染色、分枝桿菌培養(yǎng)細菌學檢測：抗酸桿菌染色、分枝桿菌培養(yǎng)病理診斷：有病灶破裂風險 結核感染診斷無“金標準”TST（PPD）結核抗體實驗8細菌學診斷優(yōu)缺點優(yōu)點：1.直接查到菌，金標準缺點：敏感性低，檢出率不足30%，大多數(shù)漏檢特異性較低，非結核分枝桿菌也可呈陽性結果，需進一步鑒定是否為結核分枝桿菌培養(yǎng)時間耗時長，需2-8周，不能進行早期診斷和治療只能診斷結核病，無法檢測結核感染只能診斷結核病，無法檢測結核感染結核抗體檢測結核抗體檢測PPDPPD結核菌素皮試結核菌素皮試假陽性與假陰性比例高2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)出正式聲

5、明，要求禁止將血清學檢測方法（抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結核和肺外結核的診斷。1.操作簡單，價廉 2.特異性低：區(qū)分不出卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染，假陽性高3.敏感性低：收到免疫低下/功能不全/受抑制影響，假陰性高。9結核潛伏感染檢測-干擾素釋放試驗 （IGRAs，interferon- gamma release assays ）酶聯(lián)免疫斑點技術 （ELISPOT，Enzyme-Linked ImmunoSpot assay）結核桿菌特異抗原 早期抗原靶6（ESAT-6，early secreted antigenic target 6 ） 培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10，cultur

6、e filtrate protein 10 ）技術背景-干擾素釋放試驗原理（IGRAs)TB抗原多肽T細胞活化T細胞-干擾素-干擾素檢測陽性-干擾素檢測陰性可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀。T-SPOT .TB 實驗方法學為酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）ELISPOT方法結合了細胞培養(yǎng)技術與酶聯(lián)免疫吸附技術（即ELISA 技術），是公認的最靈敏的抗原特異性T細胞的體外檢測技術。其技術原理可用一句話概括為：用抗體捕獲培養(yǎng)中細胞所分泌的細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色方式將其表現(xiàn)出來。由結核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白；所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列；絕大多

7、數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)。結核桿菌特異抗原ESAT-6與CFP 10抗原T-SPOT.TB 是利用結核特異抗原（ESAT-6/CFP 10），通過酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）檢測受試者體內是否存在結核效應T淋巴細胞，從而判斷目前該受試者是否感染結核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。T-SPOT.TB 實驗原理 T-SPOT.TB 技術原理 T-SPOT.TB 實驗條件 T-SPOT.TB 標準化實驗操作 T-SPOT.TB 結果分析討論 T-SPOT.TB 非血標本采集要求及操作 T-Cell Xtend T-SPOT.TB 實驗常見問題解答目錄T-SPOT.TB 試劑盒T-SPOT.T

8、B 試劑盒組成及成分種類名稱數(shù)量規(guī)格成分說明微孔培養(yǎng)板 1塊 96孔由128孔的板條組成，包被有小鼠抗人的干擾素單抗 結核桿菌特異混合多肽A 2瓶0.8ml/瓶 主要成分為ESAT-6抗原，牛血清白蛋白和抑菌劑 結核桿菌特異混合多肽B 2瓶0.8ml/瓶 主要成分為CFP 10抗原，牛血清白蛋白和抑菌劑 陽性質控 2瓶0.8ml/瓶 主要成分為植物血凝素PHA，牛血清白蛋白和抑菌劑 濃縮標記抗體 1管50ul/管 含有堿性磷酸酶標記的小鼠的抗人-干擾素單抗 顯色底物溶液 1瓶25ml/瓶 含5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氯化硝基四氮唑藍（NBT） CD光盤 1張含使用說明書，技術手

9、冊，MSDS文件，操作指南等T-SPOT.TB 輔助試劑及耗材種類名稱規(guī)格與試劑盒配比量（2盒試劑所配輔助試劑的量）淋巴細胞分離液200ml/瓶1瓶（天津灝洋或天津美德太平洋）1640培養(yǎng)液500ml/瓶2瓶（天津美德太平洋或天津灝洋）AIM-V培養(yǎng)液100ml/瓶待定（天津美德太平洋）10或1的PBS400ml/瓶與試劑盒配套的輔助試劑（公司會選擇性的與試劑盒配套贈送）T-SPOT.TB 輔助試劑及耗材其他耗材（實驗室自行采購）種類名稱用量備注說明15ml可高壓的尖底離心管 34根/人份使用之前必須高壓滅菌1.5ml尖底離心管（子彈頭）12個/人份一次性白黃藍槍頭若干一次性獨立包裝的無菌吸管

10、23根/人份計數(shù)板若干若用顯微鏡則需要T-SPOT.TB 所用儀器設備1.II級生物安全柜：T-SPOT不做特殊要求；2.離心機：水平轉子、溫控18-25、能離15ml尖底離心管、可以實現(xiàn)緩慢降速（Thermo ST-16R、 Eppendorf 5810R、力康1600R、飛鴿TDL-5000CR）；3. 培養(yǎng)箱：37、5%CO2、有保濕裝置（Thermo3111系列、SANYO、力康HF-151、三騰DH-160I）；4.細胞計數(shù)設備：全自動血細胞計數(shù)儀或普通顯微鏡加血細胞計數(shù)板；5.10l、100或200 l、1000 l量程的移液器；6.ELISPOT讀板儀： AID德國、CTL美國。

11、1.采集外周全血，無需空腹，需用肝素/肝素鋰/肝素鈉抗凝劑，不得使用EDTA抗凝；2.采血要求：2歲以下兒童23ml，其他患者46ml；免疫力低下/受抑制患者（HIV/血液病/使用生物抑制劑或免疫抑制劑/老人）68ml；3.樣本室溫（15-25）保存與運輸，不得冷凍或冷藏；4.標本采集后4h內送到實驗室，以便盡快完成檢測；5.一周內有輸血史或做過PET-CT的患者會影響血液中淋巴細胞的分離，建議2周后進行檢；6.運輸過程中防止顛簸，避免樣本溶血影響結果。T-SPOT.TB 標本要求 T-SPOT.TB 技術原理 T-SPOT.TB 試實驗條件 T-SPOT.TB 標準化實驗操作 T-SPOT.

12、TB 結果分析討論 T-SPOT.TB 非血標本采集要求及操作 T-Cell Xtend T-SPOT.TB 實驗常見問題解答目錄實驗前準備1.在正式實驗操作1-2h前，將試劑盒、AIM-V培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、Ficoll淋巴細胞分離液從4冰箱拿出，平衡至室溫（18-25）。2.為避免污染，RPMI 1640培養(yǎng)液及AIM-V培養(yǎng)液一定要用無菌小瓶分裝（建議使用高壓滅菌的50ml離心管或一次性無菌痰盒來分裝RPMI 1640，因AIM-V每次用量較少，可以用每次壓好的15ml離心管分裝）。實驗前準備3. 務必嚴格檢查淋巴細胞分離液及RPMI 1640、AIM-V培養(yǎng)液是否污染。通

13、常正常的試劑清 澈透明，如遇液體渾濁、明顯的變黃、發(fā)現(xiàn)霉菌團或絮狀物等異常，則表示可能已污染，嚴禁使用；如果RPMI 1640和AIM-V由鮮亮的橘紅色漸變?yōu)榉凵?，屬正?，F(xiàn)象，輕微的發(fā)粉可以使用，淋巴細胞分離液幾乎不容易長菌，但也要注意霉菌的污染。實驗前準備4. 確認設備是否正常：可以實現(xiàn)緩慢降速的水平溫控離心機（與15ml尖底離心管相匹配，注意靠近轉軸的位置是否會卡住離心管）；II級生物安全柜且使用前仔細擦拭并紫外滅菌30min；37、5CO 培養(yǎng)箱，確保CO 正常且培養(yǎng)箱內有水盤；顯微鏡或者血細胞分析儀正常。實驗前準備5. 準備好試劑和耗材：15ml尖底無菌離心管；1.5ml微量離心管（滅

14、菌）；加樣滅菌槍頭（10l、100l、1ml）；一次性獨立包裝的無菌吸管等。所有耗材現(xiàn)用現(xiàn)壓，不得使用高壓后放置過久的耗材。第一天第二天 采集外周肝素抗凝全血，密度梯度離心分離PBMCs，洗滌后進行細胞計數(shù)。PBMCs和結核特異性抗原同時加入到包被抗-干擾素抗體的反應孔中，孵育過夜 （37C ，5%CO2）。洗滌反應孔，加入標記二抗孵育1h。洗滌反應孔，顯色，計數(shù)斑點數(shù)，一個斑點代表一個效應T細胞。檢測過程分步操作第一步 細胞分離Ficoll Paque 法 將抗凝全血按1:1等比例與1640混勻，按23:1的比例小心將稀釋血樣輕緩加到Ficoll淋巴細胞分離液上；注意：不能將血樣與分離液混合

15、。 18，1000g，離心22min；注意：減速度要求調到最低檔升速也不要太快。淋巴細胞分離管法 將3ml淋巴細胞分離液加入分離管中，350g離心1min，使淋巴液低于多孔膜； 將樣本按5:3的比例與1640稀釋混勻。將稀釋血樣加入淋巴細胞分離管中，18，10min，離心1000g；注意：減速度要求調到最低檔升速也不要太快。分步操作第一步 細胞分離離心后實際效果圖血漿PBMCs層紅細胞淋巴細胞分離液分步操作第一步 細胞分離分步操作第二步 細胞洗滌 離心結束后，將分離出來的單個核細胞層（PBMCs）取出至新的15ml尖底離心管中；注意：不要吸到底層的紅細胞。分步操作第二步 細胞洗滌 加入1640

16、至10ml，18 ，600g，離心7min，進行第一次洗滌； 離心后棄去上清，加入1ml1640將細胞輕緩重新懸浮后，再加1640至10ml，18 ，350g，離心7min，進行第二遍洗滌； 離心后小心棄去上清液，加入500l的AIM-V（根據(jù)細胞數(shù)量，可以適當調節(jié)加入AIM-V量），輕緩重懸細胞；注意： 盡量棄去上清液，可以準備無菌濾紙，倒掉液體后，將管口輕叩一下；此步驟嚴禁使1640。分步操作第二步 細胞洗滌顯微鏡計數(shù) 取10l細胞懸液加40l 0.4的臺酚藍染液，制備1:5的細胞稀釋液，充分混勻取10l加入細胞計數(shù)板并進行活細胞計數(shù)；死細胞（藍色）活細胞（透明立體）細胞凝塊分步操作第三步

17、 細胞計數(shù)手工使用血細胞技術板或快讀一次性計數(shù)片，計數(shù)44大格的細胞數(shù)目每ml細胞數(shù)量細胞計數(shù)稀釋倍數(shù)104；分步操作第三步 細胞計數(shù)分步操作第三步 細胞計數(shù)全自動血細胞計數(shù)儀 選用上樣量100l的細胞計數(shù)儀，用1.5ml的Ep管取5080l細胞液，用全血模式計數(shù)細胞，直接得到細胞濃度；分步操作第四步 細胞懸液的配制 計數(shù)完成后，以WBC 2.5106/ml為標準濃度（顯微鏡計數(shù)細胞的標準數(shù)目為44細胞數(shù)達到50個，其濃度就是2.5106/ml ），若2.5則需要按照所給Excel表格（光盤里有）配制成500l標準濃度細胞液；若2.5且2.0則不用另外做稀釋處理；若2.0則建議增加血量來保證細

18、胞達標；注意：配制細胞液是一定要使用AIM-V，不得使用1640；若淋巴細胞百分比70%或淋巴細胞沒有分出來，統(tǒng)一以WBC的數(shù)值為標準，若淋巴細胞百分比70%可以以淋巴細胞數(shù)值為標準參考。分步操作第五步 加板孵育過夜 培養(yǎng)板加試劑將培養(yǎng)板從鋁封袋中取出，并平衡到室溫（18-25），標記樣本順序，在每個樣本的板條上按順序加入50l AIM-V，50l抗原A，50l抗原B和50l陽性對照（PHA）。注意：避免槍頭接觸到膜，以免損害膜；遇單數(shù)樣本，需把另外四個孔用醫(yī)用膠帶或封口膜封住，禁止掰斷板條。分步操作第五步 加板孵育過夜 培養(yǎng)板加樣本的標準溶液在上述四孔內分別加入100l細胞懸液（含有25萬個

19、細胞）371 ，5CO2，孵育1620h；注意：在吸取細胞懸浮液時，輕輕混勻細胞液，確保細胞均勻地分布；加液后輕輕敲擊培養(yǎng)板，使液體均勻分布底部；要求培養(yǎng)箱保持濕度；勿堆疊放置培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱里，以免溫度和通風不均勻。分步操作第六步 洗板與顯色 配制無菌 1PBS同時根據(jù)標本數(shù)目配制新鮮的酶標二抗工作液；二抗配制方法：取出二抗，室溫平衡，用無菌 1 PBS按1:200配置新鮮酶標抗體工作液 （即用即配），1個樣本需要1l二抗，考慮到耗損，酌情多配；注意：配置二抗前，需要用力甩3-5次，避免二抗粘連在瓶蓋和管壁上；遵循少量往多量中加是原則；無菌1PBS不能含有表面活性劑，并用無菌去離子水或蒸餾水配

20、制。分步操作第六步 洗板與顯色 洗板取出培養(yǎng)板，棄去孔內液體，拍干后以200l新鮮配制的無菌PBS洗滌4遍；注意：每次洗板后拍干；無菌1PBS不能含有表面活性劑。 二抗孵育每孔加50l新鮮的酶標抗體工作液，將酶標板在2-8孵育1h； 洗板顯色無菌PBS洗滌4遍除去未結合的酶標抗體每孔加50l底物工作液,室溫避光7min；注意：顯色液提前從冰箱取出，恢復到室溫。分步操作第七步 斑點計數(shù) 蒸餾水終止反應，培養(yǎng)37烘箱干燥4小時或室溫過夜干燥，干燥后使用顯微鏡、放大鏡或自動計數(shù)儀進行斑點計數(shù)。注意：嚴禁在板條未干燥之前報結果，以免造成實驗結果的錯誤判斷。 T-SPOT.TB 技術原理 T-SPOT.

21、TB 實驗條件 T-SPOT.TB 標準化實驗操作 T-SPOT.TB 結果分析討論 T-SPOT.TB 非血標本采集要求及操作 T-Cell Xtend T-SPOT.TB 實驗常見問題解答目錄 T-SPOT.TB 實驗設有陰性對照、以植物血凝素（PHA）作為刺激源的陽 性對照以及以ESAT-6和CFP 10作為刺激源的兩個實驗孔； 實驗結果用每25萬個外周血單核細胞中斑點形成細胞（spot-forming cell，SFC）的數(shù)目來判斷陰陽性結果： 當陰性孔斑點數(shù)小于6時，任意一實驗孔的斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點 數(shù)大于等于6，結果判為陽性； 當陰性孔斑點數(shù)為大于6個小于10個時，任意一實驗

22、孔的斑點數(shù)大于陰 性孔斑點數(shù)的兩倍，結果判為陽性。結果判讀空白對照孔沒有或有很少的斑點而陽性質控對照孔斑點數(shù)超 過20個結果有效。不確定結果：空白對照孔斑點數(shù)超過10個或當陽性質控對照孔斑點數(shù)少于20個時為“不確定”，需要復查，除非抗原A或抗原B孔根據(jù)結果解釋和判斷標準確定為“有反應性”，此檢測結果有效。 陰性孔出斑點：1.培養(yǎng)液、試管等耗材污染 2.實驗操作原因 3.病人自身原因，包括藥物（升白細胞，血小板）或者菌 血癥影響，病人的白細胞處于亢奮狀態(tài)（內源性干擾素 ）通過分離洗滌步驟，不能完全去除內源性干擾素 陽性斑點生長不好，斑點小或斑點數(shù)量少甚至沒有斑點生長點不多： 1.CO2培養(yǎng)箱溫度

23、、濃度或濕度不正確 2.孵育時間不足 3.未按要求加入足夠數(shù)量的細胞 4.二抗或者底物，陽性對照等沒有按實驗要求加樣 5.標本對陽性對照（PHA）不敏感 6.近期使用抑制劑患者或PET-CT患者可能細胞不達標可能導致陽性孔斑點較少。結果解釋 陰性結果提示患者體內不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞。假陰性結果：感染階段不同（如樣本是在細胞免疫發(fā)生前獲取的）；少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/基礎疾病，如HIV患者、腫瘤患者、兒童等；樣本不正常保存與運輸，實驗非正常操作。 陽性結果提示患者體內存在針對結核桿菌特異的效應T細胞，患者存在結核感染，但是否是活動性結核病，需結合臨床癥狀和其它檢測指標綜合判斷。T-S

24、POT.TB 不能作為單獨的或決定性的診斷結核病的依據(jù)。假陽 性結果：4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）。結果解釋陰性結果陽性結果空白對照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10陽性對照（PHA）實際效果圖斑點識別斑點的識別斑點的識別 (a) (b) (c)陰性孔的鑒別 (a) (b) (c) （d）陽性孔的鑒別 （e） （f） （g） （h） （a） （b） （c） （d） 典型異常結果 N A B P N A B P典型異常結果長菌典型異常結果污染典型異常結果污染 N A B P典型異常結

25、果本底不干凈患者血本身有一些干擾成分去除不掉，淋巴細胞層可見塊狀蛋白類物質。細胞洗滌不干凈。顯色時間長分離后發(fā)現(xiàn)血漿層連同淋巴細胞層有紅細胞殘留或者僅僅在淋巴細胞層或血漿層有紅細胞殘留。 N P A B N P A B兩日后重復結果典型異常結果非特異性雜質 同一個標本兩次的結果陰性孔和AB孔讀數(shù)儀讀出的數(shù)值都是0，陽性孔讀出的點數(shù)也不多，幾十個，細胞數(shù)都夠，臨床那反饋是沒有相應的結核感染臨床表現(xiàn)，實驗的目的就是一個篩查，結果都報的陰性。 P A B N洗板后典型異常結果紅細胞殘留太多典型異常結果個別結果反應異常 洗滌不干凈 培養(yǎng)箱CO2濃度、溫度、濕度影響細胞生長，死亡的細胞會形成一些干擾物附

26、著在板孔上導致本底不干凈。 T-SPOT.TB 技術原理 T-SPOT.TB 實驗條件 T-SPOT.TB 標準化實驗操作 T-SPOT.TB 結果分析討論 T-SPOT.TB 非血標本采集要求及操作 T-SPOT.TB 實驗常見問題解答目錄62結核感染時，有活性的效應T淋巴細胞主要集中在炎癥反應的部位以對抗感染，如胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液、腹水、腦脊液、腸道灌洗液，血液中的效應T淋巴細胞只占所有效應T淋巴細胞的20%-30%，因此，檢測炎癥部位體液的效應T淋巴細胞有利于區(qū)別結核感染和其他原因導致的炎癥反應，對確診結核病具有重要的臨床意義。 非血樣本的檢測輔助判斷活動性結核對臨床判斷活動性結

27、核或其它病癥有非常大的幫助，是T-SPOT檢測的獨占優(yōu)勢。非血標本的檢測意義63 胸水 腹水 心包積液 關節(jié)液 腦脊液 支氣管肺泡灌洗液（BAL）？非血標本的種類64胸水、腹水、心包積液：無菌密閉容器留取50ml以上，每100毫升加2500IU肝素（0.4ml）抗凝并立即混勻；關節(jié)液：無菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混勻； 腦脊液：無菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混勻 。采集量及抗凝劑的添加量注：抗凝劑肝素可以是“肝素鈉注射液”2ml：1.25萬單位非血標本的采集65采集容器選擇 胸水、腹水、心包積液等因所需的體積

28、比較大，推薦用鹽水瓶（氯化鈉注射液）留取，具體方法：新打開一瓶鹽水，倒掉里面的液體并將抽取的胸水、腹水或心包積液等打到里面，按上述比例添加抗凝劑并立即混勻。 注意：可以選擇直接將標本打到肝素采血管內，但不能用飲料瓶、塑料酒精瓶等留取標本。 腦脊液和關節(jié)液因所能得到的體積比較小，可以用無菌帶蓋采集管留取。非血標本的采集66 容器推薦非血標本的采集67該混懸液示為血液輕輕加到4ml Ficoll液面上斑點計數(shù)取2030ml標本于2個15ml離心管內倒掉上清掉，再加入1640至10ml重懸沉淀倒掉上清掉，在2支管子中共加入1640 8ml左右混勻并合并于一管中600g，7min600g，7min吸出

29、細胞，加1640至10ml洗滌倒掉上清，加1640至10ml洗滌1000g，22min600g，7min倒掉上清，加500 l AIM-V重懸350g，7min臺盼藍5倍稀釋用顯微鏡計數(shù)細胞洗板加酶標二抗洗板顯色2.5 106/ml加板37 ，5%CO2，1620h28 ，1h室溫，7min注意：最開始洗滌時如果發(fā)現(xiàn)離心后的沉淀很少，應增大標本量，再取2030ml，將沉淀合在一起；非血標本中會出現(xiàn)一些類似于大細胞的雜細胞，細胞計數(shù)時注意不要數(shù)上，但如果雜細胞太多要考慮適當?shù)募哟笙♂尅z測步驟胸水、腹水、心包積液和關節(jié)液68將腦脊液轉入15ml無菌離心管中/如果是離心管直接采集的可直接離心即可倒

30、掉上清，加入510ml AIM-V混勻倒掉上清，加加500 l AIM-V重懸700g，7min臺盼藍5倍稀釋用顯微鏡計數(shù)細胞洗板加酶標二抗洗板顯色2.5 106/ml加板37 ，5%CO2，1620h28 ，1h室溫，7min注意：腦脊液細胞往往不多，謹慎加樣。600g，7min斑點計數(shù)檢測步驟腦脊液69 添加的肝素量不一定非常準確，但一定要加； 凝塊會嚴重影響淋巴細胞的數(shù)量，如果發(fā)現(xiàn)有凝塊不建議繼續(xù)操作； 樣本采集后4小時內必須送至實驗室，常溫保存（15-25），不可冷凍或冷藏； 腦脊液的細胞往往比較少，為提高實驗效率或成功率，操作之前可以先查一下“常規(guī)”數(shù)據(jù)中有無淋巴細胞； 非血標本T-

31、SPOT檢測時，需同時送檢病人血樣； 非血標本單個核細胞的計數(shù)采用顯微鏡下計數(shù)； 不可使用配有海綿（半固體組織）或墊片的淋巴細胞分離管。操作注意事項70血樣結果非血結果可能解釋+活動性TB-非TB+-潛伏感染（LTBI）/病灶部位非TB-+活動性TB（提高檢出率）臨界值靈敏度特異性686-100%60-80%1492%89%2580%65%（文獻數(shù)據(jù)，僅供參考）（文獻數(shù)據(jù)，僅供參考）結果分析及討論71文獻：Utility of T-Cell Interferon-c Release Assays for Diagnosing Tuberculous Serositis: A Prospecti

32、ve Study in Beijing, China PLOS ONE 2014目的：評估通過T-SPOT方法檢測漿膜腔積液中的T淋巴細胞，對于結核性漿膜炎的診斷效率。方法：選取了北京協(xié)和醫(yī)院2008年至2011年收住的，以包括胸腔積液、腹腔積液、心包積液等在內的漿膜腔積液為主要臨床表現(xiàn)的、疑診為結核性漿膜炎的206例住院病人開展了一項前瞻性研究，比較了漿膜腔積液和外周血T-SPOT兩種檢測方法對結核性漿膜炎的診斷價值。文獻解讀72敏感性敏感性特異性特異性陽性預測值陽性預測值陰性預測值陰性預測值外周血73%73.1%68.45%7.3%非血91.9%87.1%85%93.1%Cutoff為56

33、時非血90.5% 89.2% 87%92.2%結果：漿膜腔積液T-SPOT.TB的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值顯著高于外周血；漿膜腔積液結核特異性T細胞計數(shù)顯著高于外周血，是后者的4.6倍；漿膜腔積液T-SPOT.TB診斷結核性漿膜炎的最佳臨界值為56（SFCs/106SEMC）。結論：T-SPOT方法檢測漿膜腔液中的T淋巴細胞，可以作為結核性漿膜腔炎診斷的新方法，其最佳臨界值為56（SFCs/106SEMC），當漿膜腔積液T-SPOT與外周血T-SPOT二者的斑點形成細胞數(shù)之比大于1時，更傾向于診斷結核性漿膜炎 。 73 因非血標本目前沒有確定的cutoff值，建議暫不報陰陽性結果

34、只報斑點數(shù)； 對于陰性孔、A孔和B孔均出現(xiàn)很多斑點的情況：三個孔幾乎一樣，可能是雜細胞過多或標本本身微生物污染嚴重，此種情況重復的意義并不大，建議不報結果，告知臨床具體情況；如果A/B孔斑點明顯是陰性的2倍，可以直接報陽性； 如果有對應血液結果，請多加關注對應結果； 肺泡灌洗液考慮到生物安全性問題，暫不建議做； 第三方不建議開展非血標本，如有意愿，一定要詳細告知其中的問題，我們不承擔不確定結果的損失及后續(xù)事宜； 隔夜標本/非當天標本是否可以操作？非血難點問題討論 T-SPOT.TB 技術原理 T-SPOT.TB 實驗條件 T-SPOT.TB 標準化實驗操作 T-SPOT.TB 結果分析討論 T

35、-SPOT.TB 非血標本采集要求及操作 T-SPOT.TB 實驗常見問題解答目錄常見問題 T-SPOT.TB的檢測原理和用途？的檢測原理和用途？T-SPOT.TB陽性結果代表什么？陰性結果代表什么？陽性結果代表什么？陰性結果代表什么？嘗試解釋嘗試解釋T-SPOT.TB的報告單的報告單 陰性孔出斑點是什么原因？污染如何避免？ T-SPOT.TB 標本要求標本要求 影響淋巴細胞分離效果和數(shù)量的因素有哪些； 有時PBMC 層中會摻雜紅細胞，如何解釋； 第二次離心速度是600g，第三次離心速度是350g，兩次離心的目的是什么；CO2培養(yǎng)箱濃度、溫度和濕度條件對實驗結果影響大嗎；其它標本結果都正常，個

36、別標本陽性對照孔偏弱/斑點少、小或不顯示沒有斑點出現(xiàn)，原因有哪些； 如果陰性對照孔斑點大于20個，A孔或B孔的斑點數(shù)有陰性對照孔的2-3倍，結果能報陽嗎； 為什么有些標本的板條背景顏色比較深？哪些實驗非正常操作會造成“假陰性”和“假陽性”（王詩文） ？病人已經排除結核，為何TSPOT檢測結果為陽性（王詩文） ？T-SPOT.TB 所用儀器設備有哪些所用儀器設備有哪些（王詩文） ？ 如何給客戶配試劑（配比比例）（王詩文） ？常見問題 陰性對照孔出現(xiàn)斑點的原因； 如果一整板中只有不相連的個別陰性孔出斑點，可能是患者個體差異的原因，患者血液中有其他病原（如胞內病毒，兒童容易感染的EB病毒）污染刺激導

37、致其他淋巴細胞發(fā)生應答產生的，不是實驗操作的問題。病人在此期間服用某些藥物（升白細胞，血小板等），內源性干擾因素會使結果陰性孔有斑點。如果一整板或者相連很多陰性孔出斑點，很可能是實驗過程中污染造成的，必須檢查實驗各個環(huán)節(jié)，找到污染源，同時進行實驗復查。如果是污染或實驗操作的原因，一定要重新抽血復查；如果有可能是病人本身的原因，建議兩周以后再復查。 常見問題常見問題 影響淋巴細胞分離效果的因素有哪些； 1. Ficoll和所用培養(yǎng)液沒有恢復到室溫，要提前一個小時從冰箱取出；標本抽取時間過長；2. 標本沒有在1825保溫；3. 血液稀釋時沒有充分混勻或沒有嚴格按照1:1稀釋；4. 血液抗凝不充分，出現(xiàn)凝塊；5. 個體的差異，同一種實驗條件，不同來源血可能情況不一，特別是特殊人群（老人/HIV患者/免疫力低下患者）細胞本身就少一些；6. 離心速度過小以致尚未完全分層或速度不穩(wěn)定；7. 離心機降速太快，目的細胞無法富集，要使離心機完全停下來的時間在2min以上比較理想。 8. AIM-V添加量過多，500l 使細胞濃度降低（建議最后加400-500l)。最后一步洗滌后1640殘留過多。常見問題 有時PBMC 層中會摻雜紅細胞，如何解釋； 可能血液是血液中的紅細胞破裂成碎片，