抗菌藥物敏感試驗(yàn)及細(xì)菌耐藥性檢課件

1、1n抗菌藥物敏感性概述抗菌藥物敏感性概述n抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法n全國(guó)全國(guó)“細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)”簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介2敏感和耐藥的概念敏感和耐藥的概念n從本質(zhì)上講：從本質(zhì)上講：細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥物是敏感還是耐細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥物是敏感還是耐藥，藥，常以該抗菌藥物的常以該抗菌藥物的治療濃度治療濃度與與MIC的關(guān)系而的關(guān)系而定。定。常用劑量的抗菌藥物通過(guò)常常用劑量的抗菌藥物通過(guò)常用途徑所能達(dá)到的用途徑所能達(dá)到的血藥濃度血藥濃度3血藥濃度與血藥濃度與MIC之間的關(guān)系之間的關(guān)系 致死量 中毒濃度 最小中毒量 極量 R 治療安 全范圍 治療濃度 （常用劑量） I S 最小有效量 無(wú)效濃度

2、 血藥濃度 MIC 敏感敏感中介耐藥中介耐藥耐藥耐藥上限上限下限下限4 抗菌藥物的抗菌藥物的治療濃度治療濃度與與MIC的關(guān)系：的關(guān)系：n若若MIC小于小于治療濃度，治療濃度， 則為則為“敏感敏感”（Sensitive , S ），推薦使用。），推薦使用。n若若MIC大于大于治療濃度，治療濃度， 則為則為“耐藥耐藥”（ Resistant , R ）；）；n若若MIC介于治療濃度的上下限之間介于治療濃度的上下限之間， 則為則為“中度中度耐藥耐藥”（ Intermediate , I ）或中度敏）或中度敏感感敏感和耐藥的概念敏感和耐藥的概念56敏感敏感治療濃度的上限治療濃度的上限即表中的即表中的

3、R治療濃度的下限治療濃度的下限即表中的即表中的 S耐藥耐藥中介中介耐藥耐藥治療濃度治療濃度CLSI標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)MIC7 第一節(jié)、第一節(jié)、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法需氧和兼性厭氧菌需氧和兼性厭氧菌8n稀釋法稀釋法 肉湯稀釋法（試管稀釋法）肉湯稀釋法（試管稀釋法） 瓊脂稀釋法（平板稀釋法）瓊脂稀釋法（平板稀釋法）n紙片擴(kuò)散法（紙片法）紙片擴(kuò)散法（紙片法） nE-試驗(yàn)試驗(yàn)n聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)需氧和兼性厭氧菌藥敏試驗(yàn)的方法需氧和兼性厭氧菌藥敏試驗(yàn)的方法9稀釋法的特點(diǎn)稀釋法的特點(diǎn)n定量定量的藥敏試驗(yàn)，的藥敏試驗(yàn)，測(cè)定測(cè)定MIC、MBC。n方法比較繁瑣，手工操作一般不作為常規(guī)試

4、驗(yàn)，方法比較繁瑣，手工操作一般不作為常規(guī)試驗(yàn)，常用于調(diào)查罕見(jiàn)耐藥。常用于調(diào)查罕見(jiàn)耐藥。n自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)采用微量稀釋法采用微量稀釋法檢測(cè)檢測(cè)MIC。10二、紙片擴(kuò)散法（disc diffusion test) （Kirby-Bauer法） 原理：原理：n將將浸有抗菌藥物的紙片浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有測(cè)試菌的瓊脂平貼在涂有測(cè)試菌的瓊脂平板上?？咕幬锵颦傊闹軘U(kuò)散形成板上?？咕幬锵颦傊闹軘U(kuò)散形成遞減的梯度遞減的梯度濃度濃度。n藥物敏感細(xì)菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長(zhǎng)受到藥物敏感細(xì)菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長(zhǎng)受到抑制，形成抑制，形成抑菌圈抑菌圈。n抑菌圈的大

5、小反映測(cè)試菌抑菌圈的大小反映測(cè)試菌 對(duì)對(duì)藥物的敏感程度藥物的敏感程度。 二者呈正相關(guān)。二者呈正相關(guān)。11抑菌圈邊緣的藥物濃度抑菌圈邊緣的藥物濃度 與與 MIC12 抑菌圈的大小與抑菌圈的大小與MICMIC：n二者呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，二者呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MICMIC愈小。愈小。氨芐青霉素對(duì)腸桿菌科的抑菌試驗(yàn)0102030405005101520Diameter（mm）lgMIC系列113紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑與結(jié)果解釋的標(biāo)準(zhǔn)紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑與結(jié)果解釋的標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物與細(xì)菌抗菌藥物與細(xì)菌 紙片含量紙片含量 抑菌圈直徑抑菌圈直徑：mm 相應(yīng)相應(yīng)MIC g/ml 耐藥耐藥 中介度中

6、介度 敏感敏感 耐藥耐藥 敏感敏感丁胺卡那霉素丁胺卡那霉素 30g 14 15-16 17 32 16 氨芐青霉素氨芐青霉素 測(cè)腸桿菌測(cè)腸桿菌 10g 11 12-13 14 32 8 測(cè)葡萄球菌測(cè)葡萄球菌 10g 28 29 測(cè)嗜血桿菌測(cè)嗜血桿菌 10g 19 20 4 0.25 測(cè)腸球菌測(cè)腸球菌 10g 16 16 214 操作方法操作方法 ：1. 制備制備M-H瓊脂平板，厚度瓊脂平板，厚度4mm。2 .制備制備0.5麥?zhǔn)消準(zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木罕葷峁軡岫鹊木海ㄅ囵B(yǎng)（培養(yǎng)1624h，45個(gè)菌落）。個(gè)菌落）。3. 菌液均勻涂布于平板。（菌液均勻涂布于平板。（15分鐘接種完畢）分鐘接種完畢）4.

7、 無(wú)菌貼標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片于無(wú)菌貼標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片于M-H瓊脂表面，瓊脂表面， 5. 經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)351624h孵育。孵育。6. 量取抑菌環(huán)直徑量取抑菌環(huán)直徑， 根據(jù)根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)， 報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感、報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感、 耐藥、中介耐藥、中介。15操作方法操作方法 ：1. 將在約將在約56恒溫的無(wú)菌恒溫的無(wú)菌M-H瓊脂傾注直徑為瓊脂傾注直徑為90mm 的平板，其厚度的平板，其厚度 4mm。162.無(wú)菌挑取孵育無(wú)菌挑取孵育1624h的血平板上的血平板上45個(gè)菌落。個(gè)菌落。173. 將菌置于無(wú)菌生理鹽水中，校正其濁度于將菌置于無(wú)菌生理鹽水中，校正其濁度于0.5麥?zhǔn)消準(zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木骸１?/p>

8、濁管濁度的菌液。1.5108CFU /ml184.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在液。棉簽在三個(gè)方向均勻三個(gè)方向均勻抹抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60）使菌液均勻分布，最后沿使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。平板內(nèi)緣涂抹一周。 195.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置310分鐘分鐘后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。 206. .用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-HM-H瓊瓊脂的表

9、面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中 心距離應(yīng)大于心距離應(yīng)大于24mm24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm15mm。217.7.經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)3516351624h24h孵育。孵育。8.8.取抑菌環(huán)直徑，取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)根據(jù)CLSICLSI標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感、耐藥、中介。該抗生素敏感、耐藥、中介。 22紙片擴(kuò)散法紙片擴(kuò)散法質(zhì)量控制質(zhì)量控制n 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：M-H平板厚度，平板厚度，4 mm n細(xì)菌懸液：細(xì)菌懸液：0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌濃度麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌濃度n藥敏紙片的質(zhì)量藥敏紙片的質(zhì)量n各抗菌紙片中

10、心距離應(yīng)大于各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm， 紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。 9cm的平板貼的平板貼6個(gè)個(gè)n培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間n質(zhì)控菌株質(zhì)控菌株 抑菌圈直徑？抑菌圈直徑？ 2324n根據(jù)抑菌圈的直徑，依照根據(jù)抑菌圈的直徑，依照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，作出敏感、標(biāo)準(zhǔn)，作出敏感、耐藥、和中介的判斷。為耐藥、和中介的判斷。為 定性定性”結(jié)果。結(jié)果。nCLSI推薦的最簡(jiǎn)單的藥敏試驗(yàn)。推薦的最簡(jiǎn)單的藥敏試驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法的特點(diǎn)紙片擴(kuò)散法的特點(diǎn)25三、三、E試驗(yàn)法試驗(yàn)法（濃度梯度法）（濃度梯度法） 原理：原理：nE E試條是試條是一條一條5mm5mm50mm50mm無(wú)孔無(wú)孔試劑載體試劑載體，一面固

11、定有，一面固定有一系列預(yù)先制備的一系列預(yù)先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)的抗菌藥物濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)的抗菌藥物，另一面有判別的另一面有判別的刻度刻度?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有15-15- -2020個(gè)對(duì)倍稀釋濃度個(gè)對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍。的寬度范圍。n將將E E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育，圍試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育，圍繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的MICMIC。n依照依照CLSICLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感、耐藥、中介。標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感

12、、耐藥、中介。 256128 801626無(wú)菌生長(zhǎng)區(qū)無(wú)菌生長(zhǎng)區(qū)有菌生長(zhǎng)區(qū)有菌生長(zhǎng)區(qū)27 橢圓形細(xì)菌橢圓形細(xì)菌生長(zhǎng)抑制區(qū)生長(zhǎng)抑制區(qū)256128 8016判讀抑菌濃度判讀抑菌濃度（MIC ug/ml)282930E test 法法特點(diǎn)特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)q連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好（相關(guān)系數(shù)為（相關(guān)系數(shù)為0.9）.可測(cè)可測(cè)MIC。q操作簡(jiǎn)單，影響因素少，穩(wěn)定性高。操作簡(jiǎn)單，影響因素少，穩(wěn)定性高。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：E試條較昂貴試條較昂貴; 不適用于生長(zhǎng)緩慢的苛養(yǎng)菌。不適用于生長(zhǎng)緩慢的苛養(yǎng)菌。31n用于病原菌尚未確定的急、重癥感染的經(jīng)驗(yàn)治用于病原菌尚未確定的急、重癥感染

13、的經(jīng)驗(yàn)治療療,以擴(kuò)大病原治療的覆蓋面以擴(kuò)大病原治療的覆蓋面n治療多種細(xì)菌所引起的混合感染治療多種細(xì)菌所引起的混合感染n對(duì)于某些耐藥菌可取得協(xié)同抗菌作用對(duì)于某些耐藥菌可取得協(xié)同抗菌作用n減少或推遲治療過(guò)程中細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生減少或推遲治療過(guò)程中細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生n避免藥物達(dá)到毒性劑量。避免藥物達(dá)到毒性劑量。 四、聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)四、聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)聯(lián)合藥物意義聯(lián)合藥物意義32n增強(qiáng)作用：增強(qiáng)作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果兩種抗生素聯(lián)用的效果大于大于它們單它們單獨(dú)使用時(shí)的效果之和；獨(dú)使用時(shí)的效果之和； 2025n相加作用相加作用：它們聯(lián)用時(shí)的效果：它們聯(lián)用時(shí)的效果等于等于單用兩種抗單用兩種抗生素效果之和；

14、生素效果之和； 6070n無(wú)關(guān)作用：無(wú)關(guān)作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果，兩種抗生素聯(lián)用的效果，僅相當(dāng)于僅相當(dāng)于其中一種其中一種具有較強(qiáng)作用的抗生素的效果；具有較強(qiáng)作用的抗生素的效果；n拮抗作用：拮抗作用：兩種抗生素聯(lián)用時(shí)的效果兩種抗生素聯(lián)用時(shí)的效果反而小于反而小于它們分別使用時(shí)的效果之和。它們分別使用時(shí)的效果之和。 1015兩種藥物的聯(lián)合使用的效果兩種藥物的聯(lián)合使用的效果33 兩種抗菌藥物作用部位不同：兩種抗菌藥物作用部位不同：n內(nèi)酰胺類抗生素（抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成）與內(nèi)酰胺類抗生素（抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成）與氨基糖苷類抗生素（干擾細(xì)菌的代謝）。氨基糖苷類抗生素（干擾細(xì)菌的代謝）。 增強(qiáng)作用：增強(qiáng)作用：

15、增加了藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞增加了藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞n桿菌肽（降低細(xì)胞通透性）與氨基糖苷類藥物桿菌肽（降低細(xì)胞通透性）與氨基糖苷類藥物（干擾細(xì)菌的代謝）。（干擾細(xì)菌的代謝）。 拮抗作用：拮抗作用：降低了藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞降低了藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞抗菌藥物協(xié)同作用發(fā)生原理抗菌藥物協(xié)同作用發(fā)生原理34n棋盤稀釋法棋盤稀釋法 利用肉湯稀釋法原理，依據(jù)兩種藥物的利用肉湯稀釋法原理，依據(jù)兩種藥物的MICMIC， 以棋盤設(shè)計(jì)兩種藥物不同濃度的組合。以棋盤設(shè)計(jì)兩種藥物不同濃度的組合。n計(jì)算抑菌濃度指數(shù)（計(jì)算抑菌濃度指數(shù)（fraction inhaibitory concentration,FIC)聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)方法聯(lián)合

16、藥物敏感試驗(yàn)方法35棋盤稀釋法棋盤稀釋法n首先分別測(cè)定擬聯(lián)合的抗菌藥物對(duì)檢測(cè)菌的首先分別測(cè)定擬聯(lián)合的抗菌藥物對(duì)檢測(cè)菌的MICMIC。n藥物最高濃度為藥物最高濃度為MICMIC的的2 2倍，對(duì)倍稀釋。倍，對(duì)倍稀釋。n兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進(jìn)行，兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進(jìn)行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。藥物混合液。n接種菌量為接種菌量為5 510105 5CUFCUFmlml，3535孵育孵育18h18h后觀察后觀察結(jié)果。結(jié)果。n計(jì)算部分抑菌濃度（計(jì)算部分抑菌濃度（FICFIC）指數(shù)。）指數(shù)。36抑菌濃度

17、指數(shù)（抑菌濃度指數(shù)（FICFIC）A藥聯(lián)合時(shí)的藥聯(lián)合時(shí)的MICA藥單測(cè)的藥單測(cè)的MICB藥聯(lián)合時(shí)的藥聯(lián)合時(shí)的MICB藥單測(cè)的藥單測(cè)的MIC FIC 0.5為協(xié)同作用；為協(xié)同作用； 0.51為相加作用；為相加作用； 12為無(wú)關(guān)作用；為無(wú)關(guān)作用； 2 為拮抗作用為拮抗作用37A藥：藥：32 16 8 4B藥藥: 16 8 4 2生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng) 生生 長(zhǎng)長(zhǎng)38藥敏試驗(yàn)方法的比較藥敏試驗(yàn)方法的比較nK-B法：法： WTO推薦使用的最簡(jiǎn)單的推薦使用的最簡(jiǎn)單的定性藥敏定性藥敏試驗(yàn)試驗(yàn)。n稀釋法：稀釋法：準(zhǔn)確測(cè)定準(zhǔn)確測(cè)定MIC、 MBC，比較

18、繁瑣，比較繁瑣， 試管法一般不作為常規(guī)試驗(yàn)。試管法一般不作為常規(guī)試驗(yàn)。 微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)采用微量稀釋法原理微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)采用微量稀釋法原理。nE試驗(yàn)：試驗(yàn)：可測(cè)定可測(cè)定MIC。39第二節(jié)第二節(jié) 結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn) （了解）（了解）n首次分離的分枝桿菌需做藥敏試驗(yàn)，有助于首次分離的分枝桿菌需做藥敏試驗(yàn)，有助于合理用藥和監(jiān)測(cè)藥物敏感性。合理用藥和監(jiān)測(cè)藥物敏感性。n另外經(jīng)過(guò)三個(gè)月正規(guī)治療，標(biāo)本分離培養(yǎng)仍另外經(jīng)過(guò)三個(gè)月正規(guī)治療，標(biāo)本分離培養(yǎng)仍為陽(yáng)性患者，或感染的嚴(yán)重疾患（如播散性為陽(yáng)性患者，或感染的嚴(yán)重疾患（如播散性結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎）。結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎）。n以及

19、來(lái)自高耐藥流行區(qū)的患者，均須做體外以及來(lái)自高耐藥流行區(qū)的患者，均須做體外藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)。40四種方法四種方法n比例法比例法n放射同位素法放射同位素法n絕對(duì)濃度法絕對(duì)濃度法n耐藥率法耐藥率法直接法：直接采用圖片陽(yáng)直接法：直接采用圖片陽(yáng)性的體液標(biāo)本。（須經(jīng)充性的體液標(biāo)本。（須經(jīng)充分消化五雜菌）分消化五雜菌）間接法：經(jīng)分離純培養(yǎng)后間接法：經(jīng)分離純培養(yǎng)后的次代培養(yǎng)菌。的次代培養(yǎng)菌。41無(wú)藥藥2藥3藥1nMiddlebrook7H10瓊脂瓊脂n培養(yǎng)培養(yǎng)3周周間接比例法（間接比例法（WHO推薦）推薦）敏感：含藥格無(wú)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)，敏感：含藥格無(wú)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)， 或菌落數(shù)或菌落數(shù)1%對(duì)照格對(duì)照格耐藥：含藥格

20、菌落數(shù)耐藥：含藥格菌落數(shù)1%對(duì)照格。對(duì)照格。不含藥的對(duì)照格菌落數(shù)應(yīng)為不含藥的對(duì)照格菌落數(shù)應(yīng)為501504 格平板格平板42分枝桿菌微量直視分枝桿菌微量直視快速藥敏試驗(yàn)法快速藥敏試驗(yàn)法4000 倍倍43培養(yǎng)培養(yǎng)72h72h觀察結(jié)果觀察結(jié)果INHINH敏感敏感RFPRFP耐藥耐藥陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照44第三節(jié)第三節(jié) 厭氧菌體外藥敏試驗(yàn)厭氧菌體外藥敏試驗(yàn) （了解）（了解）n厭氧菌感染多為內(nèi)源性感染，厭氧菌藥物敏感性穩(wěn)厭氧菌感染多為內(nèi)源性感染，厭氧菌藥物敏感性穩(wěn)定，一般不做體外藥敏試驗(yàn)。定，一般不做體外藥敏試驗(yàn)。n下述情況應(yīng)考慮藥敏試驗(yàn)：下述情況應(yīng)考慮藥敏試驗(yàn)： 明確厭氧菌引起的嚴(yán)重感染；

21、明確厭氧菌引起的嚴(yán)重感染； 已確證的厭氧菌感染，經(jīng)驗(yàn)性選藥治療未能奏效；已確證的厭氧菌感染，經(jīng)驗(yàn)性選藥治療未能奏效； 需長(zhǎng)期用藥的厭氧菌感染。需長(zhǎng)期用藥的厭氧菌感染。45n基本原理和方法與需氧菌相同，只是在培養(yǎng)基、基本原理和方法與需氧菌相同，只是在培養(yǎng)基、操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等應(yīng)根據(jù)厭氧菌的特定需操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等應(yīng)根據(jù)厭氧菌的特定需要變動(dòng)。要變動(dòng)。n培養(yǎng)基為布氏血瓊脂再加人補(bǔ)充劑培養(yǎng)基為布氏血瓊脂再加人補(bǔ)充劑 5g/ml氯氯化血紅素，化血紅素，5脫纖維羊脫纖維羊,1g/ml Vit K。n厭氧孵育條件厭氧孵育條件n質(zhì)控菌株為脆弱類桿菌質(zhì)控菌株為脆弱類桿菌ATCC25285。 厭氧菌體外藥敏試

22、驗(yàn)厭氧菌體外藥敏試驗(yàn)46藥敏試驗(yàn)結(jié)果的臨床價(jià)值藥敏試驗(yàn)結(jié)果的臨床價(jià)值 n影響抗菌藥物臨床療效的因素很多，據(jù)報(bào)道藥影響抗菌藥物臨床療效的因素很多，據(jù)報(bào)道藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床療效的敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床療效的符合率約為符合率約為70%70% ，n因此細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)報(bào)告只能作為臨床用因此細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)報(bào)告只能作為臨床用藥的參考，應(yīng)根據(jù)患者用藥后的治療反應(yīng)和臨藥的參考，應(yīng)根據(jù)患者用藥后的治療反應(yīng)和臨床病情及時(shí)調(diào)整用藥。床病情及時(shí)調(diào)整用藥。n醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的靈魂是與臨床溝通。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的靈魂是與臨床溝通。47新的藥敏試驗(yàn)方法探索新的藥敏試驗(yàn)方法探索n流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗生素最低抑菌濃度流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗生素最低抑菌濃

23、度n分枝桿菌藥物最低抑菌濃度的快速測(cè)定分枝桿菌藥物最低抑菌濃度的快速測(cè)定方法研究方法研究48細(xì)菌耐藥性的發(fā)生過(guò)程：細(xì)菌耐藥性的發(fā)生過(guò)程：細(xì)菌獲得與耐藥相關(guān)的基因細(xì)菌獲得與耐藥相關(guān)的基因編碼與耐藥有關(guān)的蛋白編碼與耐藥有關(guān)的蛋白表現(xiàn)出對(duì)某種抗生素的耐藥表現(xiàn)出對(duì)某種抗生素的耐藥 基因：基因：537表型：書(shū)表型：書(shū)533頁(yè)頁(yè)敏感性敏感性49第第3535章第三節(jié)章第三節(jié)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)50n生物化學(xué)技術(shù)檢測(cè)生物化學(xué)技術(shù)檢測(cè)酶酶的等電點(diǎn)的等電點(diǎn)( (等電聚焦電泳等電聚焦電泳) )n頭孢哨噻吩濾紙片法頭孢哨噻吩濾紙片法n碘淀粉測(cè)定法碘淀粉測(cè)定法n分析酶的底物譜及抑制物譜分析酶的底物譜及抑制物譜

24、紙片法和稀釋法紙片法和稀釋法 1、-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)內(nèi)酰胺酶檢測(cè)臨床意義：產(chǎn)臨床意義：產(chǎn)ESBL克雷伯菌和大腸埃希克雷伯菌和大腸埃希菌對(duì)青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無(wú)效。菌對(duì)青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無(wú)效。一、耐藥表型檢測(cè)一、耐藥表型檢測(cè)51G-菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶檢測(cè)菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶檢測(cè) -頭孢哨噻吩濾紙片法頭孢哨噻吩濾紙片法 n用接種環(huán)挑取受試菌于用接種環(huán)挑取受試菌于頭孢哨噻吩（產(chǎn)色頭孢頭孢哨噻吩（產(chǎn)色頭孢菌素）菌素）濾紙片上濾紙片上( (商品化商品化) )，n1010分鐘內(nèi)由淺黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色即陽(yáng)性結(jié)果，分鐘內(nèi)由淺黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色即陽(yáng)性結(jié)果， 表示頭孢菌素的表示頭孢菌素的-內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開(kāi)

25、。內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開(kāi)。n臨床意義：產(chǎn)生該酶的細(xì)菌對(duì)頭孢菌素類抗生臨床意義：產(chǎn)生該酶的細(xì)菌對(duì)頭孢菌素類抗生素耐藥。素耐藥。52G+菌產(chǎn)生的菌產(chǎn)生的青霉素酶檢測(cè)青霉素酶檢測(cè) -碘淀粉測(cè)定法碘淀粉測(cè)定法 受試菌混于青霉素溶液，振搖受試菌混于青霉素溶液，振搖3030分鐘。加入淀分鐘。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液變藍(lán)，繼續(xù)振搖。粉液后，再加入碘液，溶液變藍(lán)，繼續(xù)振搖。 1010分鐘之內(nèi)藍(lán)色消失者為產(chǎn)酶株。分鐘之內(nèi)藍(lán)色消失者為產(chǎn)酶株。青霉素酶青霉素酶青霉素青霉素青霉素噻唑酸青霉素噻唑酸碘碘碘淀粉復(fù)合物碘淀粉復(fù)合物變?yōu)闊o(wú)色變?yōu)闊o(wú)色 多為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生，對(duì)青霉素多為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生，對(duì)青霉素G G耐藥。

26、耐藥。53超廣譜超廣譜- -內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺酶酶Extended-Spectyum-Lactamase，ESBL ESBLsn能水解青霉素類，頭孢菌素和氨曲南。能水解青霉素類，頭孢菌素和氨曲南。 不能水解碳青烯酶類，如亞胺培南不能水解碳青烯酶類，如亞胺培南n多數(shù)可被多數(shù)可被內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸，三內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。唑巴坦及舒巴坦）所抑制。n如為如為ESBLESBL陽(yáng)性，則對(duì)陽(yáng)性，則對(duì)青霉素類，頭孢菌素和氨青霉素類，頭孢菌素和氨曲南均曲南均報(bào)告報(bào)告耐藥，不考慮體外藥敏結(jié)果。耐藥，不考慮體外藥敏結(jié)果。54常見(jiàn)常見(jiàn)產(chǎn)產(chǎn)ESBLs菌株菌株n最常見(jiàn)最常見(jiàn)是腸桿菌科細(xì)

27、菌（是腸桿菌科細(xì)菌（大腸埃希氏菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）肺炎克雷伯氏菌）；n其次，陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弗勞其次，陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸菌、銅綠假單胞菌、地枸櫞酸菌、銅綠假單胞菌、奈瑟菌等奈瑟菌等。 55ESBLs的臨床意義的臨床意義n對(duì)產(chǎn)對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株，目前最有效的抗生素為碳菌株，目前最有效的抗生素為碳青霉烯類（泰能），其次，頭孢西丁及含酶抑青霉烯類（泰能），其次，頭孢西丁及含酶抑制劑的復(fù)合劑、氨基糖甙類部分有效。制劑的復(fù)合劑、氨基糖甙類部分有效。n若臨床出現(xiàn)產(chǎn)若臨床出現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株，會(huì)在病人和醫(yī)院菌株，會(huì)在病人和醫(yī)院之間及不同菌株間相互傳播，應(yīng)引起充分的

28、重之間及不同菌株間相互傳播，應(yīng)引起充分的重視。視。56紙片初篩：紙片初篩：n培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：Muller-HintonMuller-Hinton瓊脂瓊脂n藥敏紙片藥敏紙片n接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法n孵育：孵育： 3535大氣環(huán)境，大氣環(huán)境，16-1816-18小時(shí)小時(shí)n結(jié)果：結(jié)果： 頭孢泊肟（頭孢泊肟（10ug10ug片）抑菌環(huán)片）抑菌環(huán)22mm 22mm 頭孢他啶（頭孢他啶（10ug10ug片）抑菌環(huán)片）抑菌環(huán)22mm22mm 氨曲南氨曲南 （30ug30ug片）抑菌環(huán)片）抑菌環(huán)27mm27mm 頭孢噻肟（頭孢噻肟（30ug30ug片）抑菌環(huán)片）抑菌環(huán)27mm27mm 頭

29、孢曲松（頭孢曲松（30ug30ug片）抑菌環(huán)片）抑菌環(huán)25mm 25mm 超超-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)內(nèi)酰胺酶檢測(cè)紙片擴(kuò)散法紙片擴(kuò)散法ESBLs的底物的底物可能產(chǎn)生可能產(chǎn)生ESBLs57 n培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：Muller-HintonMuller-Hinton瓊脂瓊脂n藥敏紙片濃度：藥敏紙片濃度： 頭孢噻肟頭孢噻肟30ug30ug、頭孢噻肟頭孢噻肟/ /克拉維酸克拉維酸30ug/10ug30ug/10ug 頭孢他啶頭孢他啶30ug30ug、頭孢他啶頭孢他啶/ /克拉維酸克拉維酸30ug/10ug30ug/10ugn接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法n孵育：孵育：3535大氣環(huán)境，大氣環(huán)境，16-

30、1816-18小時(shí)小時(shí) n結(jié)果：結(jié)果：復(fù)合制劑藥物紙片的抑菌圈直徑復(fù)合制劑藥物紙片的抑菌圈直徑 比非復(fù)合制劑藥物紙片的直徑比非復(fù)合制劑藥物紙片的直徑 5mm5mm 以上者為產(chǎn)以上者為產(chǎn)ESBLsESBLs菌。菌。ESBLs的底物的底物ESBLs的抑制劑的抑制劑(1)紙片確證試驗(yàn)：紙片確證試驗(yàn)：58混合克拉維酸藥物混合克拉維酸藥物紙片紙片無(wú)無(wú)克拉維酸克拉維酸藥物紙藥物紙片的直徑片的直徑直徑差直徑差5 mm ：ESBL59 篩選試驗(yàn)：篩選試驗(yàn)：n選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松至少頭孢曲松至少2種以上，種以上，n用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法稀釋至用標(biāo)

31、準(zhǔn)肉湯稀釋法稀釋至1g/ml,n凡被測(cè)菌在上述各管中能夠生長(zhǎng)凡被測(cè)菌在上述各管中能夠生長(zhǎng)(MIC2g/ml)，高度懷疑為高度懷疑為ESBLs，應(yīng)進(jìn)一步作確認(rèn)試驗(yàn)來(lái)加以，應(yīng)進(jìn)一步作確認(rèn)試驗(yàn)來(lái)加以確診。確診。（2）液體稀釋法）液體稀釋法60 確認(rèn)試驗(yàn)：確認(rèn)試驗(yàn)：n用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法測(cè)定MIC的方法的方法, n頭孢噻肟單獨(dú)稀釋頭孢噻肟單獨(dú)稀釋(0.2564g/ml)及及 頭孢噻肟頭孢噻肟(稀釋范圍相同稀釋范圍相同)加克拉維酸加克拉維酸(每管每管4g/ml); 頭孢他啶單獨(dú)稀釋頭孢他啶單獨(dú)稀釋(0.25128g/ml)及及 頭孢他啶加克拉維酸頭孢他啶加克拉維酸(每管每管4g/ml),

32、 上述上述2種藥物必須同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)種藥物必須同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn),n結(jié)果加克拉維酸和不加克拉維酸的結(jié)果加克拉維酸和不加克拉維酸的 MIC差值差值8倍倍(3個(gè)稀釋度個(gè)稀釋度)，可確認(rèn)為，可確認(rèn)為ESBLs菌株。菌株。（2）液體稀釋法）液體稀釋法61二、細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)二、細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)n基因檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的優(yōu)缺點(diǎn)基因檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的優(yōu)缺點(diǎn)n抗生素耐藥性的基因檢測(cè)方法抗生素耐藥性的基因檢測(cè)方法n基因檢測(cè)方法的應(yīng)用基因檢測(cè)方法的應(yīng)用62基因檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的優(yōu)點(diǎn)：基因檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的優(yōu)點(diǎn)：n能早期指導(dǎo)臨床醫(yī)生治療用藥。能早期指導(dǎo)臨床醫(yī)生治療用藥。 分子遺傳學(xué)方法可以直接從臨床標(biāo)本入手，無(wú)需分

33、子遺傳學(xué)方法可以直接從臨床標(biāo)本入手，無(wú)需菌株的培養(yǎng)，極大地節(jié)省時(shí)間菌株的培養(yǎng)，極大地節(jié)省時(shí)間 ， 減輕實(shí)驗(yàn)室生物危險(xiǎn)性。減輕實(shí)驗(yàn)室生物危險(xiǎn)性。n有助鑒別那些處于中介水平或常規(guī)藥敏結(jié)果模棱有助鑒別那些處于中介水平或常規(guī)藥敏結(jié)果模棱兩可的結(jié)果。兩可的結(jié)果。分子生物學(xué)方法被認(rèn)為是分子生物學(xué)方法被認(rèn)為是“ 金標(biāo)金標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)” 。n在細(xì)菌耐藥性的流行病追蹤調(diào)研中，耐藥基因檢在細(xì)菌耐藥性的流行病追蹤調(diào)研中，耐藥基因檢測(cè)比抗生素敏感方法更準(zhǔn)確。測(cè)比抗生素敏感方法更準(zhǔn)確。n發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因。發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因。63基因檢測(cè)方法檢測(cè)抗生素耐藥性的缺點(diǎn)：基因檢測(cè)方法檢測(cè)抗生素耐藥性的缺點(diǎn)：n當(dāng)樣品中菌量很少時(shí)，其敏感性

34、會(huì)大大降低。當(dāng)樣品中菌量很少時(shí)，其敏感性會(huì)大大降低。n對(duì)每一個(gè)測(cè)試的抗菌藥物，均需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的分對(duì)每一個(gè)測(cè)試的抗菌藥物，均需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的分子檢測(cè)方法，一次只能檢測(cè)一種耐藥機(jī)制。子檢測(cè)方法，一次只能檢測(cè)一種耐藥機(jī)制。n目前仍有許多耐藥機(jī)制是未知的，無(wú)法進(jìn)行分子目前仍有許多耐藥機(jī)制是未知的，無(wú)法進(jìn)行分子檢測(cè)。檢測(cè)。n耐藥基因的檢測(cè)也會(huì)存在假陽(yáng)性問(wèn)題。耐藥基因的檢測(cè)也會(huì)存在假陽(yáng)性問(wèn)題。n對(duì)許多耐藥基因的檢測(cè)方法，對(duì)許多耐藥基因的檢測(cè)方法，目前還缺乏臨床對(duì)目前還缺乏臨床對(duì)照研究以評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性、重復(fù)性及臨床應(yīng)用價(jià)值。照研究以評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性、重復(fù)性及臨床應(yīng)用價(jià)值。64常見(jiàn)的細(xì)菌耐藥相關(guān)基因舉例常見(jiàn)的細(xì)菌耐藥

35、相關(guān)基因舉例基基 因因耐藥抗生素耐藥抗生素細(xì)菌種類細(xì)菌種類基因大小基因大小bpbpAnt(4Ant(4）氨基糖苷類氨基糖苷類金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌473473antant（6 6)-la )-la 氨基糖苷類氨基糖苷類糞腸球菌糞腸球菌470470mec Amec A內(nèi)酰胺類內(nèi)酰胺類金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌400400blaTEM blaTEM 一內(nèi)酰胺類一內(nèi)酰胺類大腸埃希菌大腸埃希菌424 424 cat Dcat D氯霉素氯霉素艱難桿菌艱難桿菌27027065耐藥基因檢測(cè)方法：耐藥基因檢測(cè)方法：n分子方法檢測(cè)耐藥基因的基礎(chǔ)是分子方法檢測(cè)耐藥基因的基礎(chǔ)是 PCR。n在在 PCR基礎(chǔ)上

36、發(fā)展的方法：基礎(chǔ)上發(fā)展的方法： 分子雜交、分子雜交、 DNA序列分析，序列分析， 基因微振列技術(shù)等?；蛭⒄窳屑夹g(shù)等。 66PCR-序列特異性引物擴(kuò)增序列特異性引物擴(kuò)增耐藥基因耐藥基因耐藥基因的的耐藥基因的的特異性引物特異性引物n理想的靶序列應(yīng)當(dāng)是耐藥基因的編碼區(qū)域，而非編碼區(qū)外理想的靶序列應(yīng)當(dāng)是耐藥基因的編碼區(qū)域，而非編碼區(qū)外的基因的基因( 如插入序列或啟動(dòng)子序列如插入序列或啟動(dòng)子序列) 。n特異性高，需要設(shè)立陰性對(duì)照。特異性高，需要設(shè)立陰性對(duì)照。67基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)n芯片制備：以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩芯片制備：以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或陣的方法將寡核苷酸片段或cDNAcDNA作為探針按順序排列在載作為探針按順序排列在載體上。體上。n樣品制備：生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，須將樣品制備：生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，須將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNADNA、RNARNA，然，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和使用者的安全性。后用熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和使用者的安全性。 n雜交反應(yīng)：即熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)雜交反應(yīng)：即熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過(guò)程。生